Artykuł metodologiczny

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

DOI:

10.3791/67823

⸱

21 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Center for Nano Science and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia, 3Disease Biophysics Group, John A. Paulson School of Engineering and Applied Science, Harvard University, 4Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering “Giulio Natta”, Politecnico di Milano, 5Department of Physics, Politecnico di Milano, 6Department of Physics and Astronomy, University of Bologna

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele mikrofizjologiczne serca in vitro są wysoce wiarygodne dla badań naukowych, rozwoju leków i zastosowań medycznych. Chociaż systemy te są powszechnie akceptowane przez społeczność naukową, ich żywotność jest nadal ograniczona ze względu na brak nieinwazyjnych technik stymulacji. Fotoprzetworniki zapewniają wydajną metodę stymulacji, oferując bezprzewodowe podejście o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej przy jednoczesnej minimalizacji inwazyjności w procesach stymulacji. W niniejszej pracy przedstawiono w pełni optyczną metodę stymulacji i wykrywania aktywności modelu mikrofizjologicznego serca in vitro. W szczególności wytworzyliśmy zmodyfikowane laminarne tkanki anizotropowe poprzez wysiewanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) generowanych w hodowli zawiesinowej bioreaktora 3D. Użyliśmy fotoprzetwornika, amfifilowej pochodnej azobenzenu o nazwie Ziapin2, do stymulacji oraz barwnika Ca2+ (X-Rhod 1) do monitorowania odpowiedzi systemu. Wyniki pokazują, że Ziapin2 może fotomodulować odpowiedzi Ca2+ w zastosowanym systemie bez uszczerbku dla integralności tkanki, żywotności lub zachowania. Co więcej, wykazaliśmy, że podejście oparte na stymulacji światłem oferuje podobną rozdzielczość w porównaniu ze stymulacją elektryczną, która jest obecnie złotym standardem. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten otwiera obiecujące perspektywy dla zastosowania Ziapin2 i fotostymulacji opartej na materiale w badaniach kardiologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie światła do stymulacji żywych komórek i tkanek staje się znaczącym przełomem w badaniach biomedycznych, oferując możliwości stymulacji bezdotykowej z precyzyjną rozdzielczością czasową i przestrzenną1,2,3,4,5,6. Jedną z wiodących technik stosowanych do uwrażliwiania komórek na światło jest optogenetyka, która polega na genetycznej modyfikacji komórek w celu ekspresji wrażliwych na światło kanałów jonowych lub pomp7,8. Podejście to wykazało imponującą skuteczność w regulacji komórek w żywej tkance; Jednak jego zależność od transferu genów wirusa utrudniła jego powszechne zastosowanie w badaniach i zastosowaniach klinicznych.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, materiały organiczne i nieorganiczne zostały użyte jako światłoczułe przetworniki do opracowania niegenetycznych, opartych na materiale technik stymulacji światłem za pośrednictwem światła9,10. Organiczne nanostrukturalne fotoprzetworniki11,12,13,14,15 wykazały ostatnio niezwykłe sukcesy w wywoływaniu odpowiedzi komórkowych w różnych zastosowaniach, w tym w neuronach, kardiomiocytach i komórkach mięśni szkieletowych.

Niniejszym proponujemy Ziapin216,17,18, pochodną azobenzenu, do badania propagacji Ca2+ w zmodyfikowanych laminarnych tkankach serca. Amfifilowa struktura cząsteczki pozwala na precyzyjne celowanie w błonę plazmatyczną komórki, podczas gdy rdzeń azobenzenu umożliwia izomeryzację indukowaną światłem, prowadząc do jej zmiany konformacyjnej16,17,18. W komórkach serca ta izomeryzacja trans-to-cis zmienia grubość błony plazmatycznej, indukując kaskadę efektów, które generują potencjał czynnościowy, który z kolei uruchamia proces wzbudzenia-skurczu19,20,21.

Dodatkowo, opisujemy proces wytwarzania platformy inżynieryjnej do anizotropowego wzrostu tkanki sercowej22 i szczegółowo opisujemy eksperymentalną konfigurację używaną do optycznego wyzwalania i monitorowania jej aktywności, ze szczególnym naciskiem na uzyskanie dynamiki Ca2+ w tkance23,24. Na koniec porównujemy pozyskane sygnały z tymi uzyskanymi za pomocą stymulacji elektrycznej, która jest uważana za wzorzec odniesienia. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten podkreśla zastosowanie nowatorskiego przetwornika reagującego na światło w pogłębianiu naszej wiedzy na temat zachowania komórek serca, zwłaszcza w kontekście tkanek inżynieryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyta hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) to linia iPSC typu ludzkiego typu dzikiego, która zawiera indukowany doksycykliną (Dox) system CRISPR/Cas9, stworzony przez wprowadzenie CAGrtTA::TetO-Cas9 do locus AAVS1 (Addgene: #73500). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Boston Children's Hospital Institutional Review Board. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów przed ich udziałem w badaniu. Wytwarzanie kardiomiocytów pochodzących z hiPSC (hiPSC-CM) zostało wywołane zgodnie z wcześniejszym opisem25,26. Protokół zostanie pokrótce podsumowany w następującej sekcji:

1. Wytwarzanie i przygotowanie ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych

  1. Przemyć hiPSC hodowane w kolbach T75 za pomocą PBS. Odłączyć komórki przez inkubację z czynnikiem chelatującym Versene przez 10-15 minut i wysiać nasiona do naczyń bioreaktora wstępnie potraktowanych 1% roztworem niejonowego środka powierzchniowo czynnego o gęstości 50 milionów IPSC / naczynie w 100 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK Y-27632.
  2. Ustaw następujące parametry bioreaktora: mieszanie 60 obr./min, temperatura 37 °C, pH 7 i gazowanie nakładkowe (O2 iCO2) na poziomie 3 standardowych l/h.
  3. Po 1 dniu w hodowli potwierdź, że średnica ciała zarodka (EB) osiągnęła 100-300 μm i potraktuj komórki podstawową pożywką RPMI (pożywka RPMI 1640 uzupełniona witaminą B27 minus insulina), zawierającą 7 μM CHIR99021 przez 24 godziny, a następnie zmień pożywkę na RPMI na kolejne 24 godziny. Dodaj podstawową pożywkę RPMI zawierającą 5 μM IWR-1-endo przez kolejne 48 godzin, aby rozpocząć proces różnicowania w kierunku linii serca. Po 48 godzinach zmień medium z powrotem na podstawowe RPMI.
  4. W 7 dniu różnicowania komórki hodowlane w podstawowej pożywce RPMI uzupełnione insuliną ludzką w proporcji 1:1 000 (v/v). Odświeżaj podłoże co 2 dni lub codziennie z 50% zmianą podłoża, jeśli zużycie tlenu osiąga więcej niż 30%.
  5. W dniu 15 enzymatycznie dysocjuj komórki bioreaktora przez 3 godziny za pomocą roztworu kolagenazy II zawierającego HBSS, kolagenazę II (200 jednostek/ml), HEPES (10 mM), inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM) i N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS, 30 μM). Aby to zrobić, najpierw przemyj zróżnicowane EB hiPSC-CM 2x wstępnie podgrzanym HBSS i inkubuj je w roztworze kolagenazy II (200 μl objętości EB / 12 ml roztworu kolagenazy II) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aż pojawią się pojedyncze komórki z pełnej dysocjacji EB.
  6. Zatrzymać reakcję dysocjacji, dodając równą objętość buforu blokującego (RPMI-1640 bez B27 i DNazy II, z 6 μl DNazy II na ml RPMI-1640) do zawiesiny jednokomórkowej. Policz zróżnicowane hiPSC-CMs, odwiruj (200 × g, 5 min) i przygotuj się do dalszych zastosowań, zamrażając komórki w temperaturze -80 °C w izopropanolu przez 24 godziny i przenosząc je do zbiorników z ciekłym azotem do czasu przeprowadzenia siewu.

2. Inżynieria wytwarzania tkanek laminarnych

  1. Przyklej dwie warstwy taśmy laboratoryjnej, jedną białą i jedną niebieską, do przezroczystego, odpornego na zarysowania i promieniowanie UV arkusza akrylowego o grubości 1 mm. Za pomocą grawera laserowego CO2 wytnij arkusz akrylowy w kółka (średnica 20 mm, aby pasował do 12 MW) i wzór chipa (3 x kwadraty 7,5 mm, po trzy na chip) na taśmie, zgodnie z projektem w oprogramowaniu do grafiki wektorowej (np. CorelDraw); parametry cięcia akrylu: moc 100, prędkość 20 i 1 000 PPI; parametry cięcia taśmy: 8 mocy, 6 prędkości i 1 000 PPI. Usuń dwie warstwy taśmy wewnątrz najbardziej wewnętrznej linii za pomocą pęsety, namocz frytki w czystym wybielaczu przez 30 minut do 1 godziny, aby usunąć grube linie i ciemne plamy z cięcia, pozostawiając ostrą linię, a następnie opłucz frytki w zlewce pod bieżącą wodą dejonizowaną (DI) przez noc lub przez co najmniej 3 godziny
    UWAGA: Nie wybielaj dłużej niż 2 godziny, ponieważ spowoduje to wytrawienie klejów na ściankach bocznych, uniemożliwiając prawidłowe przyleganie żelatyny.
  2. Sonikować wióry przez 10 minut, a polidimetylosiloksan (PDMS, Sylgard 184) stemplować z cechami rowka liniowego (szerokość grzbietu 25 μm, szerokość rowka 4 μm i głębokość rowka 5 μm) przez 30 minut w czystym 70% etanolu. Przenieś wióry i stemple do czystego miejsca pod maską i pozwól im wyschnąć pod przepływem powietrza przez ~1-2 godziny.
  3. Odważyć 1 g żelatyny ze skóry świni (moc żelu ~175 g Bloom, Typ A) do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dokładnie wymieszać, aby zapewnić natychmiastowe rozpuszczenie żelatyny. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 30 minut, aby zakończyć proces rozpuszczania. Podobnie zważyć 1 g transglutaminazy mikrobiologicznej (MTG) do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 12,5 ml PBS, dokładnie wymieszać i umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie MTG.
  4. Sonikować probówkę żelatynową przez 15 minut, a następnie przed użyciem umieścić ją z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C. Umieść rurkę MTG w eksykatorze z lekko poluzowaną nakrętką i powoli włączaj próżnię. Obserwuj, jak pęcherzyki są usuwane z roztworu MTG pod próżnią. Po odgazowaniu włóż rurkę MTG z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Monitoruj proces i dostosuj podciśnienie, aby uniknąć energicznego wrzenia.
  5. Przykryj arkusz siatki czystym parafilmem, umieść wióry na siatce i trzymaj stempel w pobliżu, gotowy do użycia. Dodać 5 ml MTG do 5 ml roztworu żelatyny, ostrożnie pipetując, aby uniknąć pęcherzyków; następnie szybko odpipetuj żelatynę na chip, używając tyle, aby pokryć obszar wióra (około 0,5 ml każdy). Następnie umieść stempel PDMS22 (szerokość linii 25 μm, wysokość 5 μm, odstępy 4 μm) na wierzchu i nałóż odważnik o wadze 200 g, aby upewnić się, że żelatyna jest ułożona równolegle do osi podłużnej tkanki. Gdy wszystkie wióry zostaną uformowane, przykryj je szklanym słoikiem, aby uniknąć zakłóceń środowiskowych i pozwól im usieciować się przez noc.
    UWAGA: Zużyć zmieszany roztwór żelatyny-MTG w ciągu 5 minut; W przeciwnym razie docelowy wzór zostanie zmieniony z powodu wyższego stanu usieciowania żelatyny.
  6. Przenieś chip i kanapkę ze stemplem PDMS do nowego naczynia P150 wypełnionego PBS i uwodnij żelatynę przez 30 minut do 1 godziny, aby ułatwić oddzielenie stempla PDMS od chipa. Usuń nadmiar nieformowanej żelatyny wokół chipa i przenieś czysty wiór do nowego naczynia P150 wypełnionego PBS. Przechowuj znaczki PDMS w 70% etanolu.
  7. Wysterylizuj frytki, mocząc je w etanolu przez 10 minut pod maską.
    UWAGA: Nie przekraczaj 10 minut w etanolu, ponieważ dłuższa ekspozycja może zdeformować żelatynę.
  8. Przenieś wiórki do PBS, moczyć przez 10 minut i spłucz 3x. Przygotuj roztwory powlekające, mieszając 20 μg/ml fibronektyny z rozcieńczoną w stosunku 1:100 matrycą błony podstawnej w pożywkach hodowlanych (około 0,5 ml na studzienkę). Powlekać wióry przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Rozmrozić i zasiać komórki (8 × 105 hiPSC-CM na cm2) w podłożu RPMI z Y-27632 (10 μM), a następnie po 24 godzinach zastąpić go RPMI bez Y-27632.
  10. Trzy dni po wysianiu komórek usuń białą taśmę za pomocą pęsety.

3. Synteza i zastosowanie fotoprzetwornika

UWAGA: Ziapin2 został zsyntetyzowany zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą16,18 i został podany hiPSC-CMs bezpośrednio w pożywce hodowlanej.

  1. Dodać 25 μM Ziapin2 do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 minut.
  2. Delikatnie zmyj nadmiar cząsteczek i spłucz świeżą pożywką hodowlaną.

4. Test żywotności

UWAGA: Alamar Blue to test oparty na resazurynie, który może przenikać do komórek i działać jako wskaźnik redoks do monitorowania żywotności komórek. Rezazuryna rozpuszcza się w fizjologicznych, w wyniku czego powstaje ciemnoniebieski roztwór, który jest dodawany bezpośrednio do komórek w hodowli. Żywe komórki z aktywnym metabolizmem redukują rezyzynę do rezofuryny, która jest różowa i fluorescencyjna.

  1. Komórki płytki na 96-dołkowej płytce pokrytej wcześniej fibronektyną 20 μg/ml i rozcieńczoną w stosunku 1:100 matrycą błony podstawnej w pożywce hodowlanej. Wymieszać przez wstrząsanie, a następnie aseptycznie dodać Alamar Blue do każdej studzienki w ilości równej 10% objętości studzienki.
  2. Inkubuj kultury z Alamar Blue przez 4 godziny.
  3. Traktuj komórki za pomocą fotoprzetwornika i nośnika (DMSO), jak opisano wcześniej. Zastosuj stymulację światłem (światło pulsacyjne 1 Hz przez 1 minutę) przez światłowód (cyjan, 470 nm), aby ocenić wpływ internalizacji Ziapin2 i ekspozycji na światło na żywotność hiPSC-CM.
  4. Odczyt fluorescencji czytnikiem płytek przy wzbudzeniu 560 nm i emisji 590 nm.

5. Ocena anizotropii tkanek laminarnych serca

UWAGA: Ten protokół przedstawia systematyczne podejście do oceny anizotropii zmodyfikowanej laminarnej tkanki serca za pomocą barwienia immunologicznego, mikroskopii konfokalnej i analizy jąder27.

  1. Przemyć podłoże PBS kilkakrotnie przed utrwaleniem 4% (v/v) paraformaldehydu zawierającego 0,05% (v/v) Triton X-100 w PBS przez 10 min.
  2. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przez inkubację próbek z 5% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 30 minut.
  3. Próbki inkubować za pomocą Hoechsta (1:500) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Umyć PBS przed zamontowaniem na szkiełkach mikroskopowych środkiem zapobiegającym blaknięciu. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazu.
  5. Próbki obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem przy 20-krotnym powiększeniu. Określ orientację komórek za pomocą wtyczki FiJi OrientationJ Measure28.

6. Zapisy mapowania optycznego

UWAGA: Mapowanie optyczne zostało przeprowadzone po 5 dniach w hodowli na hiPSC-CM wysianych na wiórach tkanek formowanych żelatyną.

  1. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy upewnić się, że aparatura do mapowania optycznego składa się ze zmodyfikowanego mikroskopu z tandemową soczewką wyposażonego w szybką kamerę i źródło światła wzbudzającego, lampę rtęciową o mocy 200 mW. Umieść lustro dichroiczne przed wyznaczoną kamerą obrazującą Ca2+, aby upewnić się, że preparat jest wystawiony na działanie światła wzbudzającego i aby zebrać emitowaną fluorescencję pochodzącą z próbki.
  2. Inkubować próbkę z 2 μM X-Rhod 1 dodanymi do pożywki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Próbkę należy wystawiać na działanie światła tylko podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć fotowybielania barwnika.
  3. Przeprowadzić inkubację fotoprzetwornika zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 3.
  4. Umyj świeżą pożywką hodowlaną i przenieś frytki na wolne od czerwieni fenolowej pożywce RPMI 1640 uzupełnionej witaminą B27 minus insulina.
  5. Umieść chipy tkankowe w naczyniu o kontrolowanej temperaturze i rozpocznij nagrywanie w temperaturze fizjologicznej (37 °C), uzyskując obrazy z szybkością 2,5 klatki/s.
  6. W przypadku stymulacji optycznej należy zastosować optyczną stymulację punktową na jednym końcu tkanki za pomocą źródła światła LED (465/25 nm) umożliwiającego stymulację Ziapin2. Utrzymuj tempo tkanek z częstotliwością 0,5 lub 1 Hz za pomocą czasowo regulowanego światłowodu umieszczonego w odległości 1 mm od tkanki. W przypadku stymulacji elektrycznej zastosuj stymulację punktową za pomocą bipolarnej elektrody platynowej umieszczonej pośrodku najbardziej dystalnego końca prostokątnej tkanki. Takie umieszczenie zapewnia, że propagacja fali Ca2+ rozpoczyna się od środka szerokości tkanki, który odpowiada krótszemu bokowi prostokąta. Stymulacja powinna być stosowana z częstotliwością 0,5 Hz, o amplitudzie 10 V i czasie trwania impulsu 100 ms.
  7. Po nagraniach zastosuj filtr przestrzenny o rozmiarze 3 x 3 piksele, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
  8. Określ prędkość przewodzenia fali Ca2+ w każdym pikselu dla każdego impulsu, obliczając szybkość zmian zarówno w kierunku x, jak i y. Aby to zrobić, zmierz gradient przestrzenny natężenia sygnału Ca2+ w tych kierunkach i odnieś go do opóźnienia czasowego propagacji sygnału. Łącząc te szybkości zmian kierunkowych, określ ilościowo, jak szybko fala przemieszcza się w polu komórkowym w obu wymiarach.

7. Eksport i obsługa danych

  1. Wyodrębnij i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  2. Zastosuj filtr przestrzenny o wymiarach 3 x 3 piksele, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
  3. Wyodrębnij ślady stanów nieustalonych Ca2+ (CaT) jako średnią z określonego, ręcznie wybranego obszaru zainteresowania (ROI).
  4. Zmierz parametry CaT w centralnym obszarze zainteresowania (ROI) o wymiarach 50 x 50 pikseli (≈ 25 mm2).
  5. Dla każdego CaT przeanalizuj amplitudę CaT, czas narastania (szczyt t), czas maksymalnego nachylenia zaniku (maksymalne nachylenie zaniku) i czas do 90% przejściowego zaniku (czas zaniku90).

8. Analiza statystyczna

  1. Ocenić normalność rozkładu za pomocą odpowiedniego testu statystycznego, takiego jak test normalności, w celu określenia, czy należy zastosować metody parametryczne czy nieparametryczne.
  2. Oceń istotność statystyczną między dwoma warunkami za pomocą testu t-Studenta lub testu U-Manna-Whitneya odpowiednio dla danych ciągłych lub kategorycznych. Porównując więcej niż dwie grupy, należy zastosować jednoczynnikową ANOVA lub test Kruskala-Wallisa w zależności od założeń danych, a następnie odpowiednie testy post-hoc w celu zidentyfikowania istotnych różnic parami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wieloetapowy proces został opracowany i wdrożony do produkcji inżynieryjnej laminarnej tkanki serca przy użyciu kombinacji laserowego modelowania, formowania żelatyny i technik wysiewu komórek. Pierwotnie opracowana przez McCain et al.22 i Lee et al.24, technika ta została ponownie zaimplementowana, zgodnie z ich protokołami w celu skonstruowania zmodyfikowanych mikrotkanek laminarnych. Proces ten łączy w sobie precyzyjne wzorcowanie laserowe w celu prowadzenia strukturalne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście to stanowi solidną platformę do rozwoju badań nad sercem, dostarczając wglądu w złożoną dynamikę tkanki serca, otwierając nowe możliwości długoterminowych badań mechanistycznych serca in vitro , które mogą potencjalnie prowadzić do nowych strategii terapeutycznych. Aby zapewnić powodzenie tej metodologii, kluczowe jest odtworzenie środowiska mikrofizjologicznego, które ściśle naśladuje warunki panujące in vivo w ludzkim sercu. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na zaprojektowanie i wyrówn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CB, GL i FL są wynalazcami patentu "ZWIĄZKI FOTOCHROMOWE" nr 1. PE 3802491 (02/07/2020).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Michaelowi Rosnachowi za ilustracje na Rysunku 1 i Rysunku 3 oraz Prof. Williamowi T. Pu za dostarczenie hiPSC. Prace te były wspierane przez NCATS Tissue Chips Consortium (UH3 TR003279) na rzecz KKP, włoskie Ministerstwo Uniwersytetów i Badań Naukowych poprzez projekt PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) na Florydzie, projekt PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) na rzecz CB i GL oraz projekt Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) na rzecz GL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
alamarBlue Odczynnik do żywotności komórekThermo Fisher ScientificDAL1025Test żywotności komórek
Suplement B-27, bez insulinyThermo Fisher ScientificA1895601Do hodowli komórkowych
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9056-50GDo barwienia komórek
Oprogramowanie BrainVision Analyzer Produkty mózgowehttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/Eksport i obsługa danych
BTSSigma203895-5MG
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
Przezroczysty arkusz akrylowy odporny na zarysowania i promieniowanie UV, 12 "x 12" x 0,01 calaMcMaster Carr4076N11Produkcja chipów tkankowych
Kolagenaza typu II WorthingtonCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
Essential 8 Średni Thermo Fisher ScientificA1517001Do hodowli komórkowych
FibronektynaVWR47743-654Powłoka
Żelatyna z żelu do skóry świń o wytrzymałości 175 Typ ASigma-AldrichG2625-100GProdukcja chipów tkankowych
Geltrex LDEV-Free, zakwalifikowany przez hESC, o obniżonym współczynniku wzrostu Matryca membrany podstawnejThermo Fisher ScientificA1413302Coating
HBSS Thermo Fisher14175-095
HEPES (1 m)Thermo Fisher Scientific15630080
Hoechst 33342 Technologie życioweH1399Do barwienia komórek
Roztwór insuliny ludzkiejSigma AldrichI9278-5ML
IWR-1-endoStem Cell Technologies72564
Paraformadehyd 16% roztwór wodny (PFA)VWR100503-917Do barwienia komórek
PBS, sterylny, 500 mlThermo Fisher Scientific10010049Produkcja chipów tkankowych
sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPNiejonowy środek powierzchniowo czynny
Inhibitor ROCK Y-27632Stem Cell Technologies72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SuplementThermo Fisher Scientific61870127Do hodowli komórkowych
RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific11835030Mapowanie optyczne
Roztwór VerseneThermo Fisher Scientific15040066czynnik chelatujący
VWR Uniwersalna taśma do etykietowania laboratoryjnego VWRVWR89098-058Produkcja chipów tkankowych
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210Mapowanie optyczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Maria, F., Lodola, F., Zucchetti, E., Benfenati, F., Lanzani, G. The evolution of artificial light actuators in living systems: from planar to nanostructured interfaces. Chem Soc Rev. 47 (13), 4757-4780 (2018).
  2. Manfredi, G., et al. The physics of plasma membrane photostimulation. APL Mater. 9 (3), 030901(2021).
  3. Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int J Nanomed. 9 Suppl 1 (Suppl 1), 65-83 (2014).
  4. Ford, S. M., Watanabe, M., Jenkins, M. W. A review of optical pacing with infrared light. J. Neural Eng. 15 (1), 011001(2018).
  5. Antognazza, M. R., et al. Shedding light on living cells. Adv Mater. 27 (46), 7662-7669 (2015).
  6. Zhang, J., Wang, J., Tian, H. Taking orders from light: progress in photochromic bio-materials. Mater Horiz. 1 (2), 169-184 (2014).
  7. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  8. Ambrosi, C. M., Entcheva, E. Optogenetics' promise: pacing and cardioversion by light. Future Cardiol. 10 (1), 1-4 (2014).
  9. Hopkins, J., et al. Photoactive organic substrates for cell stimulation: Progress and perspectives. Adv Mater Technol. 4 (5), 1800744(2019).
  10. Vurro, V., Venturino, I., Lanzani, G. A perspective on the use of light as a driving element for bio-hybrid actuation. Appl Phys Lett. 120 (8), 080502(2022).
  11. Bruno, G., et al. All-optical and label-free stimulation of action potentials in neurons and cardiomyocytes by plasmonic porous metamaterials. Adv Sci. 8 (21), 2100627(2021).
  12. Ronchi, C., et al. Nongenetic optical modulation of pluripotent stem cells derived cardiomyocytes function in the red spectral range. Adv Sci. 11 (3), 2304303(2023).
  13. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  14. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nat Protoc. 14 (5), 1339-1376 (2019).
  15. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  16. DiFrancesco, M. L., et al. Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch. Nat Nanotechnol. 15 (4), 296-306 (2020).
  17. Paternò, G. M., et al. Membrane environment enables ultrafast isomerization of amphiphilic azobenzene. Adv Sci. 7 (8), 1903241(2020).
  18. Vurro, V., et al. Molecular design of amphiphilic plasma membrane-targeted azobenzenes for nongenetic optical stimulation. Front Mater. 7, 631567(2021).
  19. Vurro, V., et al. Optical modulation of excitation-contraction coupling in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. iScience. 26 (3), 106121(2023).
  20. Vurro, V., et al. Light-triggered cardiac microphysiological model. APL Bioeng. 7 (2), 026108(2023).
  21. Florindi, C., et al. Role of stretch-activated channels in light-generated action potentials mediated by an intramembrane molecular photoswitch. J. Transl. Med. 22 (1), 1068(2024).
  22. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
  23. Park, S. -J., et al. Insights into the pathogenesis of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia from engineered human heart tissue. Circulation. 140 (5), 390-404 (2019).
  24. Lee, K. Y., et al. An autonomously swimming biohybrid fish designed with human cardiac biophysics. Science. 375 (6581), 639-647 (2022).
  25. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  26. Prondzynski, M., et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 15 (1), 5929(2024).
  27. Pasqualini, F. S., Sheehy, S. P., Agarwal, A., Aratyn-Schaus, Y., Parker, K. K. Structural phenotyping of stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Rep. 4 (3), 340-347 (2015).
  28. Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40 (7), 2552-2556 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Propagacja wapniafotostymulacja oparta na materia achludzkie kardiomiocytyfototransduktor Ziapin2obrazowanie wapniamapowanie optycznestymulacja nieinwazyjnahodowla w bioreaktorze 3D

Powiązane artykuły