Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68013

⸱

25 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Streszczenie

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) doprowadziła do niezwykłych sukcesów klinicznych w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak u większości pacjentów dochodzi do nawrotu w ciągu 1-2 lat. Zidentyfikowano kilka mechanizmów prowadzących do oporności na CART, w tym hamowanie limfocytów T przez immunosupresyjne komórki szpikowe. Coraz więcej dowodów wskazuje, że monocyty i makrofagi w mikrośrodowisku guza (TME) przyczyniają się do słabej wydajności CART i wyników klinicznych. Modele przedkliniczne do badania interakcji między ludzkimi makrofagami a komórkami CART są ograniczone. W tym miejscu omawiamy podejścia do zrozumienia wpływu ludzkich makrofagów na komórki CART zarówno in vitro , jak i in vivo. Opisujemy modele kokultury in vitro , aby pokazać, że makrofagi immunosupresyjne hamują funkcje CART. Dodatkowo przedstawiamy model ksenoprzeszczepu, w którym ludzkie makrofagi i komórki nowotworowe są podskórnie wszczepiane myszom NSG w celu zbadania interakcji makrofagów podobnych do M2 z komórkami CART i komórkami nowotworowymi. Modele te mogą być wykorzystane do oceny roli makrofagów w TME i testowania immunoterapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na makrofagi.

Wprowadzenie

Terapia autologicznymi komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) osiągnęła sukcesy kliniczne w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów hematologicznych, co doprowadziło do zatwierdzenia przez amerykańską FDA sześciu produktów CART ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA)1. Pomimo imponującej początkowej aktywności terapii komórkami CART, u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu pierwszych 1-2 lat po leczeniu2. Zidentyfikowano kilka mechanizmów oporności na CART, w tym nieoptymalne dopasowanie limfocytów T, ucieczkę antygenu i słabą trwałość CART, a także hamowanie, w którym pośredniczy immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME)2,3. Komórki mieloidalne, takie jak monocyty i makrofagi, często stanowią znaczną część TME i wykazano, że są głównymi inhibitorami innych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T 4,5. Szkodliwy wpływ komórek szpikowych w kontekście skuteczności terapeutycznej komórek CART opisano w modelach przedklinicznych oraz w badaniach klinicznych zarówno guzów hematologicznych, jak i litych 3,6. Hamowanie za pośrednictwem szpiku może zachodzić od początku procesu wytwarzania CART - wykazano, że monocyty w początkowym produkcie aferezy hamują ekspansję CART ex vivo 7,8. Biorąc pod uwagę gromadzące się dowody na hamowanie CART za pośrednictwem szpiku, wiele badań miało na celu zmodyfikowanie komórek CART w celu celowania i eliminowania immunosupresyjnych makrofagów w TME w celu uzyskania lepszej odpowiedzi immunologicznej5. Jednak mechanizmy stojące za interakcjami między komórkami CART a makrofagami immunosupresyjnymi nadal nie są w pełni wyjaśnione. Ponadto istnieje ograniczona liczba publicznie dostępnych modeli ksenoprzeszczepów tych interakcji. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na modele badające interakcje między ludzkimi makrofagami a komórkami CART, zarówno in vitro, jak i na modelach mysich.

Tutaj opisujemy metodę, w której ludzkie komórki CART (CART19) ukierunkowane na CD19 są hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi CD19 + i spolaryzowanymi ex vivo makrofagami podobnymi do M2. Ponadto opisujemy mysi model ksenoprzeszczepu, w którym myszy z niedoborem odporności są podskórnie wszczepiane zarówno komórkami docelowymi, jak i ludzkimi makrofagami, co pozwala na ocenę interesujących immunoterapii w warunkach z makrofagami immunosupresyjnymi. W szczególności przeanalizowaliśmy proliferację specyficzną dla antygenu CART w obecności lub braku immunosupresyjnych makrofagów in vitro, wykazując znaczne hamowanie ekspansji limfocytów T zarówno na płytkach transwell, jak i bezpośrednich kokulturach. W naszym modelu ksenoprzeszczepu myszom NSG wszczepiono podskórnie komórki nowotworowe i ludzkie makrofagi zawieszone w Matrigel w celu przeprowadzenia badań przesiewowych terapii. Ten model zwierzęcy z powodzeniem wykazał, że zróżnicowane immunosupresyjne ludzkie makrofagi ex vivo były w stanie promować progresję guza u myszy NSG. Postępując zgodnie z tym protokołem, można przetestować skuteczność leków immunosupresyjnych ukierunkowanych na makrofagi, w tym leków małocząsteczkowych, biologicznych i innych terapii komórkowych. Jednak ze względu na ograniczenia związane z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności do badania ludzkiego TME, proponowane modele najlepiej nadają się do badań potwierdzających słuszność koncepcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Mayo Clinic, Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) oraz Departamentu Medycyny Porównawczej zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt A00001767.

1. Przygotowanie ludzkich klasycznych monocytów do badań in vitro

  1. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców krwi, jak opisano wcześniej9. Krótko mówiąc, rozcieńczyć krew pełną 2% FBS w PBS w stosunku objętościowym 1:1, a następnie izolować PBMC w pożywce o gradiencie gęstości.
  2. Wyizolować ludzkie klasyczne monocyty (CD14+CD16-) z pobranych PBMC poprzez selekcję ujemnych kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Na krótko przemyć odpowiednią ilość PBMC buforem izolacyjnym i ponownie zawiesić ogniwa we wskazanej objętości zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki z wyjątkiem klasycznych monocytów znakować koktajlem przeciwciał i mikrokulkami magnetycznymi. Zbierz klasyczne monocyty z przepływu, zachowując niemonocyty w kolumnach.
    UWAGA: Załóżmy, że 5% wszystkich PBMC to klasyczne monocyty i odpowiednio dostosuj początkową liczbę komórek PBMC. Zapisz pozostałe PBMC w celu potwierdzenia czystości populacji monocytów w kroku 1.7. Klasyczne monocyty powinny być zawsze izolowane ze świeżych PBMC bez uprzedniej krioprezerwacji.
  3. Policz liczbę wyizolowanych monocytów za pomocą licznika komórek (tabela materiałów) i odwiruj komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w buforze do izolacji komórek, aby osiągnąć 1 x 106 komórek/ml jako stężenie końcowe. Pobrać 100 μl zawiesiny komórek i przenieść na płaskodenną 96-dołkową płytkę.
  4. Przenieść 1 x 105 PBMC na tę samą płytkę, co ujemna kontrola bramkowania, aby potwierdzić klasyczną czystość populacji monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Trzymaj izolowane monocyty na lodzie podczas kroków 1.5-1.12.
  5. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie 200 μl buforu FACS i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
  6. Dla każdej próbki należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm), 0,5 μl anty-ludzkiegoCD14 10 sprzężonego z APC (1 ng/μL) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD1611 sprzężonego z PE (1 ng/μL; Tabela materiałów).
    UWAGA: Aby zachować spójność barwienia, należy przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek zgodnie z całkowitą liczbą próbek. Przenieś 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki.
  7. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj komórki, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  8. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki i odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
  9. Przemyć, dodając 200 μl buforu FACS do każdej studzienki i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym (tabele materiałów).
  10. Bramka CD14 + CD16- populacja. Upewnij się, że populacja CD14 + CD16- przekracza 90% żywych komórek, aby uzyskać idealną czystość. Bramka CD14+CD16- populacja żywych singletów.
    UWAGA: Zakłada się, że użytkownicy są zaznajomieni z analizą cytometrii przepływowej.

2. Różnicowanie makrofagów M0 od ludzkich klasycznych monocytów

UWAGA: Różnicowanie makrofagów podobnych do M2 od ludzkich klasycznych monocytów jest zaadaptowane z poprzedniej publikacji12.

  1. Odkręcać izolowane monocyty w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.
  2. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml (tabela materiałów) i dobrze wymieszać. Przenieść 100 μl komórek na 48-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli tkankowej i dodać dodatkowe 50 μl pożywki do hodowli komórkowych. Upewnij się, że każdy warunek ma 3 powtórzenia dla końcowego odczytu w dniu 11.
    UWAGA: Użytkownicy mogą odpowiednio dodawać kolejne grupy eksperymentów. Protokół ten obejmuje tylko eksperymentalne kohodowle komórek nowotworowych i limfocytów T z makrofagami podobnymi do M2 lub bez nich (Tabela 1).
  3. Przenieś 100 μl komórek na inną 48-dołkową płytkę i dodaj dodatkowe 50 μl pożywki do hodowli komórkowych w celu fenotypowania makrofagów. Upewnij się, że dołączyłeś jeden studzienka do fenotypowania makrofagów M0 i jeden do fenotypowania makrofagów podobnych do M2.
  4. Dodaj 200 μl PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu kultur komórkowych. Inkubować monocyty w temperaturze 37 °C przez 7 dni w celu różnicowania komórek w makrofagi M0.
  5. Aby zbadać interakcje między zróżnicowanymi makrofagami a dopasowanymi do dawcy komórkami CART19, wyizoluj 1 x 107 limfocytów T z PBMC tego samego dawcy i wygeneruj komórki CART19 po 8-dniowej procedurze produkcji CART, jak opisano wcześniej 9,13,14.
    UWAGA: Komórki CART komulowane domeną sygnalizacyjną CD28 są generowane z 5 x 106 limfocytów T, jak opisano wcześniej 9,13,14. Równolegle generowane są nietransdukowane (UTD) limfocyty T w tym samym procesie 9,13,14. Limfocyty T UTD będą wykorzystywane jako kontrola negatywna w proliferacji limfocytów T w celu kontroli proliferacji allogenicznej.

3. Różnicowanie makrofagów podobnych do M2 od makrofagów M0 poprzez kohodowlę z komórkami docelowymi

  1. W dniu 7 należy pobrać 48-dołkową płytkę z makrofagami M0 i inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut. Energicznie pipetuj komórki w sposób ciągły, trzymając płytkę na lodzie.
    UWAGA: Długość inkubacji lodu zależy od tego, jak przylegające są makrofagi, które mogą się różnić ze względu na wariancję dawcy. Pierwsze mieszanie polega na zebraniu luźno przylegających makrofagów, więc pipetowanie trwające 5 minut powinno wystarczyć.
  2. Przenieść oderwane komórki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (tabela materiałów) wstępnie schłodzonej na lodzie. Dodaj 200 μl lodowatego PBS do dołków 48-dołkowej płytki i energicznie pipetuj pozostałe komórki co 10 minut, aż większość makrofagów zostanie odłączona od dna. Po każdym pipetowaniu należy sprawdzić komórki pod mikroskopem i w razie potrzeby dostosować czas inkubacji lodu, przy czym czas inkubacji powinien być dłuższy w przypadku większej liczby przylegających komórek.
  3. Przenieść pozostałe oderwane makrofagi M0 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie. Dokładnie wymieszaj komórki i policz komórki na liczniku komórek.
  4. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Zawiesić w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.
  5. Przenieść 200 μl komórek na płaskodenną płytkę 96-dołkową (tabele materiałów). Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty. Jako ujemną kontrolę bramkowania dodać dodatkowo dobrze wybarwiony markerami tylko populacji rodzicielskiej.
  6. Do każdej próbki dodać 100 μl buforu FACS uzupełnionego 1 μl roztworu blokującego receptor Fc. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
    UWAGA: Ważne jest, aby wstępnie inkubować makrofagi z buforem blokującym receptor Fc przed faktycznym barwieniem markerów, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom.
  7. Do dołka próbki należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm), 0,5 μl anty-ludzkiegoCD14 10 sprzężonego z APC (1 ng/μL), 0,5 μl anty-ludzkiego CD20615 sprzężonego z APC/Cy7 (2 ng/μL) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD16316 sprzężonego z PerCP (2 ng/μL; Tabela materiałów). Do kontroli bramkowania ujemnego należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika i 0,5 μl anty-ludzkiego CD14 sprzężonego z APC.
  8. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj komórki, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  9. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
  10. Przemyć dodając 200 μl buforu FACS. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS.
  11. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym i przesuń populację komórek CD14 + CD206 + CD163 +. Użyj ekspresji CD163 i CD206 na makrofagach M0 jako punktu odniesienia dla fenotypów podobnych do M2. Oczekuje się, że migracja populacji zniskiegopoziomu CD163 doniskiego poziomu CD163 lubwysokiego CD206 jest oczekiwana w makrofagach podobnych do M2. Skala przesunięcia populacji może być zależna od dawcy.
  12. Przygotuj interesującą Cię linię komórek nowotworowych i licz na licznik komórek.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje jako cel nieprzylegającą linię komórkową chłoniaka z komórek płaszcza CD19 + , JeKo-1. W razie potrzeby można przetestować inne linie komórek nowotworowych i ich zdolność do różnicowania makrofagów podobnych do M0 do M2.
    1. Utrzymuj komórki JeKo-1 z sugerowaną przez dostawcę pożywką hodowlaną (tabela materiałów) na poziomie 1 x 106 komórek/ml w kolbie do hodowli tkankowej. Wymieszaj komórki nowotworowe w kolbie i policz je za pomocą licznika komórek.
  13. Odwirowywać komórki docelowe w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty i odsysać supernatanty. Zawiesić komórki docelowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Przygotuj odpowiednią liczbę komórek nowotworowych w oparciu o liczbę grup eksperymentalnych. Upewnij się, że istnieją 2 x 105 komórek docelowych dla każdej grupy kokultury makrofagów podobnych do M2, w tym płytki fenotypowej M2.
  14. Przenieść 100 μl komórek nowotworowych do grup kokultur makrofagów podobnych do M2 na 48-dołkowej płytce przygotowanej w dniu 0 i delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny.
    UWAGA: Stosunek makrofagów JeKo-1: M0 2:1 został przetestowany pod kątem różnicowania fenotypu podobnego do M2. W razie potrzeby można przetestować inne proporcje.
  15. W dniu 8 umieść płytkę fenotypową podobną do M2 na lodzie, energicznie odłącz komórki i przygotuj się do fenotypowania zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.11.
    UWAGA: Makrofagi podobne do M2 są znacznie bardziej przylegające niż makrofagi M0, więc spodziewana jest potrzeba dłuższej inkubacji lodu. Ten protokół wykorzystuje tylko lodowaty i lodowaty PBS do odłączania makrofagów, aby zminimalizować stres w komórkach.
  16. Połącz pliki cytometrii przepływowej fenotypowania M0 od dnia 7 z fenotypowaniem podobnym do M2. Bramkować CD206 i CD163 populacji komórek rodzicielskich CD14 + próbki makrofagów M0 i zastosować tę samą strategię bramkowania do próbki makrofagów podobnych do M2, aby zwizualizować przesunięcie populacji.
  17. Aby wprowadzić limfocyty T do kokultur, zbierz limfocyty T CART19 i UTD z 8 dnia wygenerowane w kroku 2.5 i przenieś komórki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj pipetą i policz za pomocą licznika komórek.
  18. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ostrożnie odsysać supernatanty. Zawiesić limfocyty T CART lub UTD w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek /ml.
  19. Przygotuj linię komórek nowotworowych i policz na liczniku komórek. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
  20. Ponownie zawiesić komórki nowotworowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml. Przenieś 100 μl komórek nowotworowych do studzienek kokulturowych bez makrofagów podobnych do M2 (Tabela 1).
  21. Przenieść 100 μl limfocytów T CART lub UTD do odpowiednich studzienek kokultury (Tabela 1). Ostateczna kokultura z makrofagami podobnymi do M2 powinna mieć komórki nowotworowe, limfocyty T i makrofagi w stosunku 2:2:1. Używaj kokultur bez makrofagów jako kontroli.
  22. Aby utrzymać końcową objętość spójną we wszystkich grupach, dodaj kolejne 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do studzienek bez makrofagów. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
    UWAGA: Jeśli używane są allogeniczne komórki CART, użytkownicy muszą włączyć do kokultur komórki T UTD dopasowane do dawcy jako właściwą kontrolę w celu wykrycia ekspansji limfocytów T wywołanej allogenicznością. W takim przypadku kriokonserwowane wcześniej wygenerowane limfocyty T CART i UTD powinny zostać rozmrożone i odpowiednio odzyskane, a następnie co najmniej 3-4 godziny odpoczynku przed dodaniem do kokultur.

4. Analiza proliferacji kokultur specyficznej dla antygenu

  1. W dniu 11 umieść płytkę kokultury na lodzie i energicznie pipetuj komórki. Dobrze wymieszaj komórki i przenieś je do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Podstawowym odczytem kokultur jest ilościowe określenie ekspansji limfocytów T, więc odłączanie makrofagów nie jest konieczne, chyba że użytkownicy planują również analizować inne markery makrofagów w tym samym panelu.
  2. Dodać 200 μl lodowatego PBS do dołków na próbkę i energicznie pipetować. Przenieś pozostały roztwór do tych samych probówek do mikrowirówek.
  3. Sprawdź studzienki pod mikroskopem (10x), aby upewnić się, że komórki zawiesiny są całkowicie zbierane. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
  4. Zawiesić komórki ze wszystkich warunków za pomocą 200 μl buforu FACS i przenieść na płaskodenną 96-dołkową płytkę. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
  5. Przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD317 sprzężonego z APC (1 ng/μL; Tabela materiałów) dla każdej studzienki na próbkę. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i ostrożnie wymieszaj komórki pipetą, aby uniknąć pęcherzyków.
    UWAGA: Na tym etapie pojawią się granulki o dużych komórkach. Aby upewnić się, że wszystkie limfocyty T są barwione, sprawdź spód płytki, aby upewnić się, że po dokładnym wymieszaniu nie ma pozostałych granulek komórek.
  6. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
  7. Przemyć dodając 200 μl buforu FACS. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS.
  8. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym. Bramkuj komórki CD3 + i określ ilościowo bezwzględną liczbę żywych komórek CD3 + , jak poniżej:
    figure-protocol-1
  9. Wykres bezwzględnej liczby komórek CD3+ w każdym warunku za pomocą GraphPad Prism.
    UWAGA: Oczekuje się, że kokultury z makrofagami podobnymi do M2 będą miały znacznie niższą bezwzględną liczbę limfocytów T CD3 niż warunki przy braku makrofagów podobnych do M2.

5. Wpływ makrofagów podobnych do M2 na komórki CART w systemie transwell

UWAGA: Płytki Transwell fizycznie oddzielają makrofagi podobne do M2 od stymulowanych komórek CART i pozwalają tylko rozpuszczalnym cząsteczkom przemieszczać się między typami komórek, umożliwiając użytkownikom badanie dynamiki niezależnych od kontaktu interakcji między makrofagami a komórkami CART (Figura 1).

  1. Wyizolować 1 x 106 klasycznych monocytów ludzkich i potwierdzić czystość populacji za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 1.1-1.10. Odwirować 1 x 106 monocytów w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatanty.
    UWAGA: Użytkownicy mogą chcieć wygenerować autologiczny CART i komórki UTD dopasowane do dawcy, zgodnie z opisem w kroku 2.5.
  2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml i dobrze wymieszać.
  3. Przenieść 200 μl zawieszonych komórek do dolnej studzienki 24-dołkowej płytki transwellowej (0,4 μm) z 3 kontrpróbami technicznymi. Dodaj dodatkowe 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka i upewnij się, że dno studzienki jest całkowicie zakryte. Dodaj 300 μl pożywki do hodowli komórkowych do kolejnych 3 studzienek w warunkach bez makrofagów (kontrola pozytywna).
  4. Dodaj 200 μl PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu kultur komórkowych. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
  5. W dniu 7 przygotuj 1,4 x 106 komórek nowotworowych JeKo-1 i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
  6. Ponownie zawiesić komórki nowotworowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml. Dodaj 200 μl komórek nowotworowych do studzienek dennych we wszystkich warunkach próbki i dobrze wymieszaj. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny. Używać studzienek dennych, w których jako kontrolę pozytywną służy tylko JeKo-1.
  7. W dniu 8, w dniu zbiorów, w 8 dniu zbiorów, limfocyty T CART i UTD wygenerowane w kroku 5.1. i ponownie zawiesić limfocyty T w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Jeśli używane są allogeniczne komórki CART, użytkownicy muszą włączyć do kokultur komórki T UTD dopasowane do dawcy, jak opisano w kroku 3.22.
  8. Policz i przygotuj 1,4 x 106 komórek JeKo-1. Przenieść komórki nowotworowe do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  9. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w pożywkach do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml. Przenieść 100 μl przygotowanych limfocytów T i 100 μl komórek nowotworowych do każdej górnej studzienki dla wszystkich warunków próbki.
  10. Dokładnie wymieszać komórki w górnej studzience i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
  11. W dniu 11 wymieszaj komórki w górnej komorze i przenieś do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przemyć górne studzienki 200 μl PBS i przenieść pozostałe komórki do probówek do mikrowirówek.
  12. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Przeprowadź test proliferacji limfocytów T zgodnie z opisem w krokach 4.4-4.9.
    UWAGA: Makrofagi podobne do M2 spolaryzowane JeKo-1 mogą hamować proliferację limfocytów T specyficznych dla antygenu w sposób niezależny od kontaktu. Inne modele nowotworów mogą być testowane w razie potrzeby.

6. Ustanowienie modelu ksenoprzeszczepu zarówno z ludzkimi makrofagami, jak i guzem u myszy NSG

  1. Wyizolować 1 x 107 klasycznych ludzkich monocytów i potwierdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 1.1-1.10. Użyj myszy NSG wszczepionych samym JeKo-1 jako kontrolę, aby potwierdzić pronowotworowe działanie makrofagów podobnych do M2, jak pokazano na rycinie 2.
    UWAGA: Ten protokół wszczepia myszom NSG 5 x 105 ludzkich makrofagów podskórnie. Regeneracja makrofagów po odłączeniu w 7 dniu wynosi około 50%. Użytkownicy mogą odpowiednio dostosować numery komórek i upewnić się, że przygotowali dodatkowe komórki.
  2. Odkręcać izolowane monocyty w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.
  3. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml i dobrze wymieszać. Przenieść monocyty do kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
  4. W dniu 7 energicznie pipetuj komórki na lodzie co 10 minut i sprawdzaj komórki pod mikroskopem, aż większość makrofagów zostanie odłączona. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie, umyć kolbę lodowatym PBS, aby poluzować pozostałe komórki, i połączyć komórki w stożkowej probówce.
  5. Policz komórki na liczniku komórek. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
  6. Umyj i ponownie zawieś komórki za pomocą 5 ml lodowatego PBS. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
  7. Zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 107 komórek/ml. Przenieś roztwór komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymaj go na lodzie.
  8. Przygotuj 1,5 x 107 komórek lucyferazy + JeKo-1 i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Ze względu na małą liczbę wstrzykiwanych komórek konieczne jest obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) w celu monitorowania obciążenia guza. W razie potrzeby można zwiększyć liczbę makrofagów i komórek nowotworowych do wstrzyknięć podskórnych. Jeśli guzy są widoczne i dostępne przez zacisk po wstrzyknięciu, zamiast tego można użyć komórek nowotworowych typu dzikiego.
  9. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 4 x 107/ml.
  10. Przenieś tę samą objętość makrofagów i komórek nowotworowych do innej świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszaj. Dodaj tę samą objętość rozpuszczonej macierzy błony podstawnej do roztworu mieszanych komórek i dobrze wymieszaj na lodzie.
    UWAGA: Matrycę błony podstawnej należy rozmrozić na lodzie przez noc, aby zapobiec krzepnięciu. W tym momencie każde 100 μl roztworu komórkowego ma 5 x 105 makrofagów i 1 x 106 JeKo-1 zawieszonych w macierzy błony podstawnej, która wykorzystuje ten sam stosunek liczby komórek, który jest używany w protokole różnicowania makrofagów podobnych do M2 in vitro .
  11. Jako kontrolę, przenieś pozostałe przygotowane komórki JeKo-1 o tej samej objętości lodowatego PBS do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodając tę samą objętość macierzy błony podstawnej do roztworu komórkowego i dobrze mieszając z lodem.
  12. Przygotuj 10 6-8-tygodniowych samic i samców myszy NOD-SCID-γ-/- (NSG) (~20 g) do znieczulenia wziewnego 2,5% izofluranem. Wprowadzić znieczulenie izofluranem za pomocą aparatu do znieczulenia wziewnego gryzoni. Odparowany izofluran jest dostarczany do komory i podgrzewanego stolika ze stożkami nosowymi.
  13. Umieść myszy w komorze anestezjologicznej na 1-2 minuty. Przenieś myszy do stożków nosowych na podgrzewanej scenie po utracie odruchów posturalnych i prawych18. Utrzymuj myszy na etapie ogrzewania przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż maść do oczu na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki z powodu utraty odruchu mrugania podczas znieczulenia.
  14. Ostrożnie ogol prawy bok każdej myszy, aby odsłonić skórę po znieczuleniu myszy. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml ze 100 μl mieszaniny komórek makrofagów JeKo-1 i ostrożnie usunąć pęcherzyki z roztworu.
  15. Ostrożnie unieś odsłoniętą skórę ręką i włóż igłę w uniesiony obszar. Kontynuować unoszenie skóry za pomocą igły i przycisnąć jeden palec do miejsca wstrzyknięcia. Staraj się nie przesuwać igły po włożeniu, aby zapobiec przypadkowym nakłuciom i wyciekowi komórek.
  16. Powoli uwolnij komórki do warstwy podskórnej i ostrożnie wyjmij igłę. Powtórz wstrzyknięcia podskórne dla wszystkich 10 myszy NSG, przy czym 5 myszy otrzymało zarówno JeKo-1, jak i makrofagi, a 5 myszy otrzymało sam JeKo-1.
  17. Przygotować D-lucyferynę (tabela materiałów) w stężeniu 15 mg/ml. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml z 200 μl D-lucyferyny i wstrzyknąć każdej myszy dootrzewnowo.
  18. Umieść znieczulone myszy na scenie dla BLI 10 minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny. Wykonaj BLI dla każdej myszy i zapisz jako wyjściowe (Dzień 0) obciążenie nowotworem. Umieść myszy z powrotem w klatkach.
    UWAGA: Użytkownicy muszą upewnić się, że znieczulone myszy nie są pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyskają przytomności, aby utrzymać leżącą mostek po zabiegu obrazowania.
  19. Monitoruj obciążenie guza BLI 2 razy w tygodniu, aż do osiągnięcia eksperymentalnych lub humanitarnych punktów końcowych. Punkt końcowy przeżycia całkowitego jest osiągany, gdy objętość guza jest równa lub wyższa niż 2000 mm3, obliczona według poniższego wzoru:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Długość monitorowania guza można dostosować w zależności od celu eksperymentów i pożądanych odczytów. Ze względu na bardzo małe rozmiary guza w ciągu pierwszych 2-3 tygodni, BLI jest zalecany do wskazania obciążenia nowotworem. Gdy guzy staną się widoczne i dostępne za pomocą suwmiarki, w celu dokładnej analizy guza zaleca się zarówno pomiary BLI, jak i suwmiarki.
  20. Aby zbadać interakcje między wszczepionymi ludzkimi makrofagami a autologicznymi komórkami CART19 u myszy NSG, wygeneruj i wszczepij ludzkie makrofagi zróżnicowane ex vivo, jak opisano w krokach 6.1-6.16. Wyizolować autologiczne limfocyty T od tego samego dawcy krwi w kroku 6.1 zgodnie z 8-dniowym protokołem wytwarzania CART, jak opisano wcześniej 9,13,14.
    UWAGA: Każda mysz NSG jest traktowana komórkami 2 x 106 CART19. Użytkownicy powinni wygenerować co najmniej 2 x 107 komórek CART, aby leczyć 10 myszy. Komórki CART są kriokonserwowane w 8 dniu i przechowywane do momentu wszczepienia JeKo-1 / makrofagów myszom, 5 dni po wstrzyknięciu podskórnym.
  21. Po 5 dniach wstrzykiwań guza/makrofagów losowo dobieraj myszy na podstawie BLI, jak opisano w krokach 6.17-6.18. Rozmrozić i przygotować komórki CART zgodnie z opisem w kroku 3.22. Przemyć komórki koszyka PBS i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  22. Ponownie zawiesić komórki CART w PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 107 komórek /ml. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml ze 100 μl przygotowanych komórek CART i wstrzyknąć każdej myszy z nowozem dożylnie przez żyłę ogonową.
  23. Monitoruj obciążenie guzem za pomocą BLI raz w tygodniu przez 4 tygodnie.
    UWAGA: Ze względu na funkcje immunosupresyjne przeszczepionych ludzkich makrofagów, u myszy, którym wstrzyknięto JeKo-1 / makrofagi, spodziewane jest upośledzone działanie przeciwnowotworowe CART i większe obciążenie guza.

7. Potwierdzenie fenotypu podobnego do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach przez barwienie immunofluorescencyjne

  1. Aby potwierdzić indukowany przez JeKo-1 fenotyp podobny do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach opisanych w kroku 6 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, wykonaj kroki 6.1-6.19 i zwiększ liczbę wstrzykniętych makrofagów i lucyferazy + JeKo-1 odpowiednio do 5 x 106 komórek i 1 x 107 komórek na mysz NSG.
    UWAGA: Użytkownicy powinni upewnić się, że ostateczna objętość wstrzyknięcia dla każdej myszy wynosi 100 μl.
  2. W dniu 7 poddaj eutanazji myszy NSG za pomocą CO2 (ustaw przepływomierz na 3,5 l / min na 5 minut lub do momentu eutanazji zwierząt), wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i potwierdź utratę odruchów rogówkowych, jak opisano wcześniej19. Umieść myszy na stole roboczym z guzami skierowanymi do góry. Rozpyl 70% etanolu na miejsca guza i ostrożnie zbierz wszczepione guzy nożyczkami i kleszczami.
  3. Przenieś tkanki nowotworowe do stożkowych probówek o pojemności 50 ml wypełnionych 20-30 ml 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia, jak opisano wcześniej20. Kriokonserwacja i kriosekcja tkanek nowotworowych do barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem20.
  4. Barwienie tkanki nowotworowej szkiełkuje się mysim przeciwciałem anty-ludzkim CD206 sprzężonym z AF546 (1:50) i króliczym przeciwciałem anty-ludzkim iNOS skoniugowanym z AF647 (1:100) rozcieńczonym w buforze do barwienia immunofluorescencyjnego, a następnie barwieniem i konserwacją jądra, jak opisano wcześniej21.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, użytkownicy powinni odpowiednio dostosować miareczkowanie przeciwciał, zwłaszcza gdy używane są różne linie komórek nowotworowych.
  5. Uzyskaj obrazy immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopii konfokalnej z 40-krotną prędkością. Aby potwierdzić, że wszczepione ludzkie makrofagi rozwijają fenotyp podobny do M2, spodziewaj się ekspresji ludzkiego CD206 i minimalnej ekspresji ludzkiego iNOS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tego protokołu jest ustanowienie modeli zarówno in vitro , jak i in vivo w celu zbadania interakcji między ludzkimi makrofagami immunosupresyjnymi a komórkami CART ze względu na złożony charakter i dynamikę interakcji oraz ograniczone istniejące modele ksenoprzeszczepów. Zgodnie z protokołem, izolowane ludzkie klasyczne monocyty są różnicowane w celu uzyskania fenotypów podobnych do M2 i stają się funkcjonalnie immunosupresyjne.

Aby potwierdzić czystość izolowanych ludz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia komórkowa CART wykazała liczne sukcesy kliniczne w leczeniu podgrup pacjentów z nowotworami hematologicznymi, ale u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 1-2 lat po infuzji CART 1,2. Zidentyfikowano różne potencjalne mechanizmy oporności na CART i stwierdzono, że immunosupresyjne komórki szpikowe odgrywają ważną rolę w immunosupresji TME i wynikającej z niej niewydolności CART 3,4,5,6,7,8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), MustangBio (poprzez Mayo Clinic) i Sendero (poprzez Mayo Clinic). RLS i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen (za pośrednictwem Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, na które firma Immix posiada licencję. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK pełniła funkcję konsultanta dla firm Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma i Humanigen.

Podziękowania

Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), grant National Institutes of Health R37CA266344-01 (SSK) oraz grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 0,5 mlFisher Naukowy329461
1,5 ml probówka do mikrowirówekEppendorf powiedział:1415-2508 
Rurka stożkowa 15 mlNauki przyrodnicze Corning352097
24-dołkowa płytka transwell (0,4 μ m)Nauki przyrodnicze Corning3397
Probówka stożkowa 50 mlNauki przyrodnicze Corning352098
Anty-ludzki CD206 sprzężony z APC/Cy7Legenda biologiczna321119Przeciwciało przepływowe
Anty-ludzki CD14 sprzężony z APCLegenda biologiczna325607Przeciwciało przepływowe
Anty-ludzki CD3 sprzężony z APCLegenda biologiczna344811Przeciwciało przepływowe
Roztwór do płukania autoMACSMiltenyi Biotec130-091-222Klasowy bufor do izolacji monocytów 
Matryca membrany podstawnejNauki przyrodnicze CorningCLS356237Solubilizowana matryca błony podstawnej
Pożywki do hodowli komórkowych10% ludzka surowica AB 1% penicylina-streptomycyna-glutamina w X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy
Klasyczny zestaw do izolacji monocytów, ludzkiMiltenyi Biotec130-117-337
System CytoFLEX  B5-R3-V5Beckman CoulterZobacz materiał C04652Cytometr przepływowy
D-lucyferynaZłoto BiotechnologiaSZCZĘŚCIE-1G
D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco)Gibco (firma Gibco)14190250 
Maść do oczuRybak termiczny19-090-832
Bufor FACS2% FBS 1% azydek sodu w PBS
Surowica bydlęca płoduNauki przyrodnicze Corning35-011-CV
Płaska płytka 96-dołkowaNauki przyrodnicze CorningCLS3997
Inaktywowana termicznie pula ludzkiej surowicy AB Innowacyjne badania4931
Ludzki TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)Legenda biologiczna422301
Izofluran w płynie   Piramal Pharma Sp. z o.o.66794-017-10
System obrazowania in vivo IVIS SpectrumPerkinElmer powiedział:124262
Pożywki do hodowli linii komórkowych JeKo-110% FBS 1% penicylina-streptomycyna-glutamina w pożywce RPMI-1640
Żywy/martwy zestaw do naprawy Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nmInvitrogenL34966
Kolumna LSMiltenyi Biotec130-042-401Negatyw zaznaczenie ściegu
Preparat limfatycznyTechnologie komórek macierzystych07811Gradient gęstości średni
Roztwór podstawowy MACS BSAMiltenyi Biotec130-091-376Klasowy bufor do izolacji monocytów 
Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD206 sprzężone z AF546 Biotechnologia Santa CruzSC-376232 powiedział:
SKINIENIE. Cg-Prkdcscid  Myszy Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratorium Jacksona 5557
Anty-ludzki CD16 sprzężony z PELegenda biologiczna302007Przeciwciało przepływowe
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), PłynGibco (firma Gibco)10378-016
Anty-ludzki CD163 sprzężony z PerCPLegenda biologiczna333625Przeciwciało przepływowe
Królicze przeciwciało anty-ludzkie iNOS sprzężone z AF647 Technologia białkowaCL647-18985
Rekombinowany ludzki GM-CSFTechnologie komórek macierzystych78015
RPMI-1640 średniGibco (firma Gibco)11875093
SepMate-50 IVDTechnologie komórek macierzystych85450Izolacja PBMC metodą centrowania w gradicypinie gęstości 
Azek sodu, 5% (w/v)Ricca Chemiczny7144.8-16
Płytka 48-dołkowa poddana działaniu hodowli tkankowejNauki przyrodnicze Corning3548
Analizator żywotności komórek Vi-cell XRBeckman CoulterLicznik komórek
X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicyLonza04-418Q

Bibliografia

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywania kom rek mieloidalnychmakrofagi immunosupresyjnemikro rodowisko guzakokultura in vitroksenoprzeszczep in vivohematopoetyczne kom rki macierzystezaprawianie makrofag wobrazowanie bioluminescencyjneimmunoterapia celowana w makrofagi

Powiązane artykuły