Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Terapia autologicznymi komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) osiągnęła sukcesy kliniczne w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów hematologicznych, co doprowadziło do zatwierdzenia przez amerykańską FDA sześciu produktów CART ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA)¹. Pomimo imponującej początkowej aktywności terapii komórkami CART, u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu pierwszych 1-2 lat po leczeniu². Zidentyfikowano kilka mechanizmów oporności na CART, w tym nieoptymalne dopasowanie limfocytów T, ucieczkę antygenu i słabą trwałość CART, a także hamowanie, w którym pośredniczy immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME)^2,3. Komórki mieloidalne, takie jak monocyty i makrofagi, często stanowią znaczną część TME i wykazano, że są głównymi inhibitorami innych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T ^4,5. Szkodliwy wpływ komórek szpikowych w kontekście skuteczności terapeutycznej komórek CART opisano w modelach przedklinicznych oraz w badaniach klinicznych zarówno guzów hematologicznych, jak i litych ^3,6. Hamowanie za pośrednictwem szpiku może zachodzić od początku procesu wytwarzania CART - wykazano, że monocyty w początkowym produkcie aferezy hamują ekspansję CART ex vivo ^7,8. Biorąc pod uwagę gromadzące się dowody na hamowanie CART za pośrednictwem szpiku, wiele badań miało na celu zmodyfikowanie komórek CART w celu celowania i eliminowania immunosupresyjnych makrofagów w TME w celu uzyskania lepszej odpowiedzi immunologicznej⁵. Jednak mechanizmy stojące za interakcjami między komórkami CART a makrofagami immunosupresyjnymi nadal nie są w pełni wyjaśnione. Ponadto istnieje ograniczona liczba publicznie dostępnych modeli ksenoprzeszczepów tych interakcji. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na modele badające interakcje między ludzkimi makrofagami a komórkami CART, zarówno in vitro, jak i na modelach mysich.

Tutaj opisujemy metodę, w której ludzkie komórki CART (CART19) ukierunkowane na CD19 są hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi CD19 ⁺ i spolaryzowanymi ex vivo makrofagami podobnymi do M2. Ponadto opisujemy mysi model ksenoprzeszczepu, w którym myszy z niedoborem odporności są podskórnie wszczepiane zarówno komórkami docelowymi, jak i ludzkimi makrofagami, co pozwala na ocenę interesujących immunoterapii w warunkach z makrofagami immunosupresyjnymi. W szczególności przeanalizowaliśmy proliferację specyficzną dla antygenu CART w obecności lub braku immunosupresyjnych makrofagów in vitro, wykazując znaczne hamowanie ekspansji limfocytów T zarówno na płytkach transwell, jak i bezpośrednich kokulturach. W naszym modelu ksenoprzeszczepu myszom NSG wszczepiono podskórnie komórki nowotworowe i ludzkie makrofagi zawieszone w Matrigel w celu przeprowadzenia badań przesiewowych terapii. Ten model zwierzęcy z powodzeniem wykazał, że zróżnicowane immunosupresyjne ludzkie makrofagi ex vivo były w stanie promować progresję guza u myszy NSG. Postępując zgodnie z tym protokołem, można przetestować skuteczność leków immunosupresyjnych ukierunkowanych na makrofagi, w tym leków małocząsteczkowych, biologicznych i innych terapii komórkowych. Jednak ze względu na ograniczenia związane z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności do badania ludzkiego TME, proponowane modele najlepiej nadają się do badań potwierdzających słuszność koncepcji.

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Mayo Clinic, Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) oraz Departamentu Medycyny Porównawczej zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt A00001767.

1. Przygotowanie ludzkich klasycznych monocytów do badań in vitro

1. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców krwi, jak opisano wcześniej⁹. Krótko mówiąc, rozcieńczyć krew pełną 2% FBS w PBS w stosunku objętościowym 1:1, a następnie izolować PBMC w pożywce o gradiencie gęstości.
2. Wyizolować ludzkie klasyczne monocyty (CD14⁺CD16^-) z pobranych PBMC poprzez selekcję ujemnych kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Na krótko przemyć odpowiednią ilość PBMC buforem izolacyjnym i ponownie zawiesić ogniwa we wskazanej objętości zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki z wyjątkiem klasycznych monocytów znakować koktajlem przeciwciał i mikrokulkami magnetycznymi. Zbierz klasyczne monocyty z przepływu, zachowując niemonocyty w kolumnach.
   UWAGA: Załóżmy, że 5% wszystkich PBMC to klasyczne monocyty i odpowiednio dostosuj początkową liczbę komórek PBMC. Zapisz pozostałe PBMC w celu potwierdzenia czystości populacji monocytów w kroku 1.7. Klasyczne monocyty powinny być zawsze izolowane ze świeżych PBMC bez uprzedniej krioprezerwacji.
3. Policz liczbę wyizolowanych monocytów za pomocą licznika komórek (tabela materiałów) i odwiruj komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w buforze do izolacji komórek, aby osiągnąć 1 x 10⁶ komórek/ml jako stężenie końcowe. Pobrać 100 μl zawiesiny komórek i przenieść na płaskodenną 96-dołkową płytkę.
4. Przenieść 1 x 10⁵ PBMC na tę samą płytkę, co ujemna kontrola bramkowania, aby potwierdzić klasyczną czystość populacji monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Trzymaj izolowane monocyty na lodzie podczas kroków 1.5-1.12.
5. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie 200 μl buforu FACS i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
6. Dla każdej próbki należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm), 0,5 μl anty-ludzkiego^{CD14 10} sprzężonego z APC (1 ng/μL) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD16¹¹ sprzężonego z PE (1 ng/μL; Tabela materiałów).
   UWAGA: Aby zachować spójność barwienia, należy przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek zgodnie z całkowitą liczbą próbek. Przenieś 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki.
7. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj komórki, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
8. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki i odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
9. Przemyć, dodając 200 μl buforu FACS do każdej studzienki i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym (tabele materiałów).
10. Bramka CD14 ⁺ CD16^- populacja. Upewnij się, że populacja CD14 ⁺ CD16^- przekracza 90% żywych komórek, aby uzyskać idealną czystość. Bramka CD14⁺CD16^- populacja żywych singletów.
    UWAGA: Zakłada się, że użytkownicy są zaznajomieni z analizą cytometrii przepływowej.

2. Różnicowanie makrofagów M0 od ludzkich klasycznych monocytów

UWAGA: Różnicowanie makrofagów podobnych do M2 od ludzkich klasycznych monocytów jest zaadaptowane z poprzedniej publikacji¹².

1. Odkręcać izolowane monocyty w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml.
2. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml (tabela materiałów) i dobrze wymieszać. Przenieść 100 μl komórek na 48-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli tkankowej i dodać dodatkowe 50 μl pożywki do hodowli komórkowych. Upewnij się, że każdy warunek ma 3 powtórzenia dla końcowego odczytu w dniu 11.
   UWAGA: Użytkownicy mogą odpowiednio dodawać kolejne grupy eksperymentów. Protokół ten obejmuje tylko eksperymentalne kohodowle komórek nowotworowych i limfocytów T z makrofagami podobnymi do M2 lub bez nich (Tabela 1).
3. Przenieś 100 μl komórek na inną 48-dołkową płytkę i dodaj dodatkowe 50 μl pożywki do hodowli komórkowych w celu fenotypowania makrofagów. Upewnij się, że dołączyłeś jeden studzienka do fenotypowania makrofagów M0 i jeden do fenotypowania makrofagów podobnych do M2.
4. Dodaj 200 μl PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu kultur komórkowych. Inkubować monocyty w temperaturze 37 °C przez 7 dni w celu różnicowania komórek w makrofagi M0.
5. Aby zbadać interakcje między zróżnicowanymi makrofagami a dopasowanymi do dawcy komórkami CART19, wyizoluj 1 x 10⁷ limfocytów T z PBMC tego samego dawcy i wygeneruj komórki CART19 po 8-dniowej procedurze produkcji CART, jak opisano wcześniej ^9,13,14.
   UWAGA: Komórki CART komulowane domeną sygnalizacyjną CD28 są generowane z 5 x 10⁶ limfocytów T, jak opisano wcześniej ^9,13,14. Równolegle generowane są nietransdukowane (UTD) limfocyty T w tym samym procesie ^9,13,14. Limfocyty T UTD będą wykorzystywane jako kontrola negatywna w proliferacji limfocytów T w celu kontroli proliferacji allogenicznej.

3. Różnicowanie makrofagów podobnych do M2 od makrofagów M0 poprzez kohodowlę z komórkami docelowymi

1. W dniu 7 należy pobrać 48-dołkową płytkę z makrofagami M0 i inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut. Energicznie pipetuj komórki w sposób ciągły, trzymając płytkę na lodzie.
   UWAGA: Długość inkubacji lodu zależy od tego, jak przylegające są makrofagi, które mogą się różnić ze względu na wariancję dawcy. Pierwsze mieszanie polega na zebraniu luźno przylegających makrofagów, więc pipetowanie trwające 5 minut powinno wystarczyć.
2. Przenieść oderwane komórki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (tabela materiałów) wstępnie schłodzonej na lodzie. Dodaj 200 μl lodowatego PBS do dołków 48-dołkowej płytki i energicznie pipetuj pozostałe komórki co 10 minut, aż większość makrofagów zostanie odłączona od dna. Po każdym pipetowaniu należy sprawdzić komórki pod mikroskopem i w razie potrzeby dostosować czas inkubacji lodu, przy czym czas inkubacji powinien być dłuższy w przypadku większej liczby przylegających komórek.
3. Przenieść pozostałe oderwane makrofagi M0 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie. Dokładnie wymieszaj komórki i policz komórki na liczniku komórek.
4. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Zawiesić w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml.
5. Przenieść 200 μl komórek na płaskodenną płytkę 96-dołkową (tabele materiałów). Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty. Jako ujemną kontrolę bramkowania dodać dodatkowo dobrze wybarwiony markerami tylko populacji rodzicielskiej.
6. Do każdej próbki dodać 100 μl buforu FACS uzupełnionego 1 μl roztworu blokującego receptor Fc. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
   UWAGA: Ważne jest, aby wstępnie inkubować makrofagi z buforem blokującym receptor Fc przed faktycznym barwieniem markerów, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom.
7. Do dołka próbki należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm), 0,5 μl anty-ludzkiego^{CD14 10} sprzężonego z APC (1 ng/μL), 0,5 μl anty-ludzkiego CD206¹⁵ sprzężonego z APC/Cy7 (2 ng/μL) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD163¹⁶ sprzężonego z PerCP (2 ng/μL; Tabela materiałów). Do kontroli bramkowania ujemnego należy przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika i 0,5 μl anty-ludzkiego CD14 sprzężonego z APC.
8. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj komórki, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
9. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
10. Przemyć dodając 200 μl buforu FACS. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS.
11. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym i przesuń populację komórek CD14 ⁺ CD206 ⁺ CD163 ⁺. Użyj ekspresji CD163 i CD206 na makrofagach M0 jako punktu odniesienia dla fenotypów podobnych do M2. Oczekuje się, że migracja populacji z^niskiegopoziomu CD163 do^niskiego poziomu CD163 lub^wysokiego CD206 jest oczekiwana w makrofagach podobnych do M2. Skala przesunięcia populacji może być zależna od dawcy.
12. Przygotuj interesującą Cię linię komórek nowotworowych i licz na licznik komórek.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje jako cel nieprzylegającą linię komórkową chłoniaka z komórek płaszcza CD19 ⁺ , JeKo-1. W razie potrzeby można przetestować inne linie komórek nowotworowych i ich zdolność do różnicowania makrofagów podobnych do M0 do M2.
    1. Utrzymuj komórki JeKo-1 z sugerowaną przez dostawcę pożywką hodowlaną (tabela materiałów) na poziomie 1 x 10⁶ komórek/ml w kolbie do hodowli tkankowej. Wymieszaj komórki nowotworowe w kolbie i policz je za pomocą licznika komórek.
13. Odwirowywać komórki docelowe w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty i odsysać supernatanty. Zawiesić komórki docelowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁶ komórek/ml.
    UWAGA: Przygotuj odpowiednią liczbę komórek nowotworowych w oparciu o liczbę grup eksperymentalnych. Upewnij się, że istnieją 2 x 10⁵ komórek docelowych dla każdej grupy kokultury makrofagów podobnych do M2, w tym płytki fenotypowej M2.
14. Przenieść 100 μl komórek nowotworowych do grup kokultur makrofagów podobnych do M2 na 48-dołkowej płytce przygotowanej w dniu 0 i delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny.
    UWAGA: Stosunek makrofagów JeKo-1: M0 2:1 został przetestowany pod kątem różnicowania fenotypu podobnego do M2. W razie potrzeby można przetestować inne proporcje.
15. W dniu 8 umieść płytkę fenotypową podobną do M2 na lodzie, energicznie odłącz komórki i przygotuj się do fenotypowania zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.11.
    UWAGA: Makrofagi podobne do M2 są znacznie bardziej przylegające niż makrofagi M0, więc spodziewana jest potrzeba dłuższej inkubacji lodu. Ten protokół wykorzystuje tylko lodowaty i lodowaty PBS do odłączania makrofagów, aby zminimalizować stres w komórkach.
16. Połącz pliki cytometrii przepływowej fenotypowania M0 od dnia 7 z fenotypowaniem podobnym do M2. Bramkować CD206 i CD163 populacji komórek rodzicielskich CD14 ⁺ próbki makrofagów M0 i zastosować tę samą strategię bramkowania do próbki makrofagów podobnych do M2, aby zwizualizować przesunięcie populacji.
17. Aby wprowadzić limfocyty T do kokultur, zbierz limfocyty T CART19 i UTD z 8 dnia wygenerowane w kroku 2.5 i przenieś komórki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj pipetą i policz za pomocą licznika komórek.
18. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ostrożnie odsysać supernatanty. Zawiesić limfocyty T CART lub UTD w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10^{6 komórek} /ml.
19. Przygotuj linię komórek nowotworowych i policz na liczniku komórek. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
20. Ponownie zawiesić komórki nowotworowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁶ komórek/ml. Przenieś 100 μl komórek nowotworowych do studzienek kokulturowych bez makrofagów podobnych do M2 (Tabela 1).
21. Przenieść 100 μl limfocytów T CART lub UTD do odpowiednich studzienek kokultury (Tabela 1). Ostateczna kokultura z makrofagami podobnymi do M2 powinna mieć komórki nowotworowe, limfocyty T i makrofagi w stosunku 2:2:1. Używaj kokultur bez makrofagów jako kontroli.
22. Aby utrzymać końcową objętość spójną we wszystkich grupach, dodaj kolejne 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do studzienek bez makrofagów. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
    UWAGA: Jeśli używane są allogeniczne komórki CART, użytkownicy muszą włączyć do kokultur komórki T UTD dopasowane do dawcy jako właściwą kontrolę w celu wykrycia ekspansji limfocytów T wywołanej allogenicznością. W takim przypadku kriokonserwowane wcześniej wygenerowane limfocyty T CART i UTD powinny zostać rozmrożone i odpowiednio odzyskane, a następnie co najmniej 3-4 godziny odpoczynku przed dodaniem do kokultur.

4. Analiza proliferacji kokultur specyficznej dla antygenu

1. W dniu 11 umieść płytkę kokultury na lodzie i energicznie pipetuj komórki. Dobrze wymieszaj komórki i przenieś je do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Podstawowym odczytem kokultur jest ilościowe określenie ekspansji limfocytów T, więc odłączanie makrofagów nie jest konieczne, chyba że użytkownicy planują również analizować inne markery makrofagów w tym samym panelu.
2. Dodać 200 μl lodowatego PBS do dołków na próbkę i energicznie pipetować. Przenieś pozostały roztwór do tych samych probówek do mikrowirówek.
3. Sprawdź studzienki pod mikroskopem (10x), aby upewnić się, że komórki zawiesiny są całkowicie zbierane. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
4. Zawiesić komórki ze wszystkich warunków za pomocą 200 μl buforu FACS i przenieść na płaskodenną 96-dołkową płytkę. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
5. Przygotować 50 μl buforu FACS zawierającego 0,3 μl żywego/martwego odczynnika (wzbudzenie przy 405 nm) i 0,5 μl anty-ludzkiego CD3¹⁷ sprzężonego z APC (1 ng/μL; Tabela materiałów) dla każdej studzienki na próbkę. Dodaj 50 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki i ostrożnie wymieszaj komórki pipetą, aby uniknąć pęcherzyków.
   UWAGA: Na tym etapie pojawią się granulki o dużych komórkach. Aby upewnić się, że wszystkie limfocyty T są barwione, sprawdź spód płytki, aby upewnić się, że po dokładnym wymieszaniu nie ma pozostałych granulek komórek.
6. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej studzienki. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty.
7. Przemyć dodając 200 μl buforu FACS. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS.
8. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym. Bramkuj komórki CD3 ⁺ i określ ilościowo bezwzględną liczbę żywych komórek CD3 ⁺ , jak poniżej:
   
9. Wykres bezwzględnej liczby komórek CD3⁺ w każdym warunku za pomocą GraphPad Prism.
   UWAGA: Oczekuje się, że kokultury z makrofagami podobnymi do M2 będą miały znacznie niższą bezwzględną liczbę limfocytów T CD3 niż warunki przy braku makrofagów podobnych do M2.

5. Wpływ makrofagów podobnych do M2 na komórki CART w systemie transwell

UWAGA: Płytki Transwell fizycznie oddzielają makrofagi podobne do M2 od stymulowanych komórek CART i pozwalają tylko rozpuszczalnym cząsteczkom przemieszczać się między typami komórek, umożliwiając użytkownikom badanie dynamiki niezależnych od kontaktu interakcji między makrofagami a komórkami CART (Figura 1).

1. Wyizolować 1 x 10⁶ klasycznych monocytów ludzkich i potwierdzić czystość populacji za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 1.1-1.10. Odwirować 1 x 10⁶ monocytów w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatanty.
   UWAGA: Użytkownicy mogą chcieć wygenerować autologiczny CART i komórki UTD dopasowane do dawcy, zgodnie z opisem w kroku 2.5.
2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml i dobrze wymieszać.
3. Przenieść 200 μl zawieszonych komórek do dolnej studzienki 24-dołkowej płytki transwellowej (0,4 μm) z 3 kontrpróbami technicznymi. Dodaj dodatkowe 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka i upewnij się, że dno studzienki jest całkowicie zakryte. Dodaj 300 μl pożywki do hodowli komórkowych do kolejnych 3 studzienek w warunkach bez makrofagów (kontrola pozytywna).
4. Dodaj 200 μl PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu kultur komórkowych. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
5. W dniu 7 przygotuj 1,4 x 10⁶ komórek nowotworowych JeKo-1 i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
6. Ponownie zawiesić komórki nowotworowe za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁶ komórek/ml. Dodaj 200 μl komórek nowotworowych do studzienek dennych we wszystkich warunkach próbki i dobrze wymieszaj. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny. Używać studzienek dennych, w których jako kontrolę pozytywną służy tylko JeKo-1.
7. W dniu 8, w dniu zbiorów, w 8 dniu zbiorów, limfocyty T CART i UTD wygenerowane w kroku 5.1. i ponownie zawiesić limfocyty T w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml.
   UWAGA: Jeśli używane są allogeniczne komórki CART, użytkownicy muszą włączyć do kokultur komórki T UTD dopasowane do dawcy, jak opisano w kroku 3.22.
8. Policz i przygotuj 1,4 x 10⁶ komórek JeKo-1. Przenieść komórki nowotworowe do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
9. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w pożywkach do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml. Przenieść 100 μl przygotowanych limfocytów T i 100 μl komórek nowotworowych do każdej górnej studzienki dla wszystkich warunków próbki.
10. Dokładnie wymieszać komórki w górnej studzience i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
11. W dniu 11 wymieszaj komórki w górnej komorze i przenieś do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przemyć górne studzienki 200 μl PBS i przenieść pozostałe komórki do probówek do mikrowirówek.
12. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Przeprowadź test proliferacji limfocytów T zgodnie z opisem w krokach 4.4-4.9.
    UWAGA: Makrofagi podobne do M2 spolaryzowane JeKo-1 mogą hamować proliferację limfocytów T specyficznych dla antygenu w sposób niezależny od kontaktu. Inne modele nowotworów mogą być testowane w razie potrzeby.

6. Ustanowienie modelu ksenoprzeszczepu zarówno z ludzkimi makrofagami, jak i guzem u myszy NSG

1. Wyizolować 1 x 10⁷ klasycznych ludzkich monocytów i potwierdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 1.1-1.10. Użyj myszy NSG wszczepionych samym JeKo-1 jako kontrolę, aby potwierdzić pronowotworowe działanie makrofagów podobnych do M2, jak pokazano na rycinie 2.
   UWAGA: Ten protokół wszczepia myszom NSG 5 x 10⁵ ludzkich makrofagów podskórnie. Regeneracja makrofagów po odłączeniu w 7 dniu wynosi około 50%. Użytkownicy mogą odpowiednio dostosować numery komórek i upewnić się, że przygotowali dodatkowe komórki.
2. Odkręcać izolowane monocyty w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x 10⁶ komórek/ml.
3. Dodać ludzki rekombinowany GM-CSF, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng / ml i dobrze wymieszać. Przenieść monocyty do kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
4. W dniu 7 energicznie pipetuj komórki na lodzie co 10 minut i sprawdzaj komórki pod mikroskopem, aż większość makrofagów zostanie odłączona. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie, umyć kolbę lodowatym PBS, aby poluzować pozostałe komórki, i połączyć komórki w stożkowej probówce.
5. Policz komórki na liczniku komórek. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
6. Umyj i ponownie zawieś komórki za pomocą 5 ml lodowatego PBS. Odwirowywać komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatanty.
7. Zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁷ komórek/ml. Przenieś roztwór komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymaj go na lodzie.
8. Przygotuj 1,5 x 10⁷ komórek lucyferazy ⁺ JeKo-1 i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Ze względu na małą liczbę wstrzykiwanych komórek konieczne jest obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) w celu monitorowania obciążenia guza. W razie potrzeby można zwiększyć liczbę makrofagów i komórek nowotworowych do wstrzyknięć podskórnych. Jeśli guzy są widoczne i dostępne przez zacisk po wstrzyknięciu, zamiast tego można użyć komórek nowotworowych typu dzikiego.
9. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut i odsysać supernatanty. Zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 4 x 10⁷/ml.
10. Przenieś tę samą objętość makrofagów i komórek nowotworowych do innej świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszaj. Dodaj tę samą objętość rozpuszczonej macierzy błony podstawnej do roztworu mieszanych komórek i dobrze wymieszaj na lodzie.
    UWAGA: Matrycę błony podstawnej należy rozmrozić na lodzie przez noc, aby zapobiec krzepnięciu. W tym momencie każde 100 μl roztworu komórkowego ma 5 x 10⁵ makrofagów i 1 x 10⁶ JeKo-1 zawieszonych w macierzy błony podstawnej, która wykorzystuje ten sam stosunek liczby komórek, który jest używany w protokole różnicowania makrofagów podobnych do M2 in vitro .
11. Jako kontrolę, przenieś pozostałe przygotowane komórki JeKo-1 o tej samej objętości lodowatego PBS do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodając tę samą objętość macierzy błony podstawnej do roztworu komórkowego i dobrze mieszając z lodem.
12. Przygotuj 10 6-8-tygodniowych samic i samców myszy NOD-SCID-γ-/- (NSG) (~20 g) do znieczulenia wziewnego 2,5% izofluranem. Wprowadzić znieczulenie izofluranem za pomocą aparatu do znieczulenia wziewnego gryzoni. Odparowany izofluran jest dostarczany do komory i podgrzewanego stolika ze stożkami nosowymi.
13. Umieść myszy w komorze anestezjologicznej na 1-2 minuty. Przenieś myszy do stożków nosowych na podgrzewanej scenie po utracie odruchów posturalnych i prawych¹⁸. Utrzymuj myszy na etapie ogrzewania przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż maść do oczu na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki z powodu utraty odruchu mrugania podczas znieczulenia.
14. Ostrożnie ogol prawy bok każdej myszy, aby odsłonić skórę po znieczuleniu myszy. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml ze 100 μl mieszaniny komórek makrofagów JeKo-1 i ostrożnie usunąć pęcherzyki z roztworu.
15. Ostrożnie unieś odsłoniętą skórę ręką i włóż igłę w uniesiony obszar. Kontynuować unoszenie skóry za pomocą igły i przycisnąć jeden palec do miejsca wstrzyknięcia. Staraj się nie przesuwać igły po włożeniu, aby zapobiec przypadkowym nakłuciom i wyciekowi komórek.
16. Powoli uwolnij komórki do warstwy podskórnej i ostrożnie wyjmij igłę. Powtórz wstrzyknięcia podskórne dla wszystkich 10 myszy NSG, przy czym 5 myszy otrzymało zarówno JeKo-1, jak i makrofagi, a 5 myszy otrzymało sam JeKo-1.
17. Przygotować D-lucyferynę (tabela materiałów) w stężeniu 15 mg/ml. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml z 200 μl D-lucyferyny i wstrzyknąć każdej myszy dootrzewnowo.
18. Umieść znieczulone myszy na scenie dla BLI 10 minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny. Wykonaj BLI dla każdej myszy i zapisz jako wyjściowe (Dzień 0) obciążenie nowotworem. Umieść myszy z powrotem w klatkach.
    UWAGA: Użytkownicy muszą upewnić się, że znieczulone myszy nie są pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyskają przytomności, aby utrzymać leżącą mostek po zabiegu obrazowania.
19. Monitoruj obciążenie guza BLI 2 razy w tygodniu, aż do osiągnięcia eksperymentalnych lub humanitarnych punktów końcowych. Punkt końcowy przeżycia całkowitego jest osiągany, gdy objętość guza jest równa lub wyższa niż 2000 mm³, obliczona według poniższego wzoru:
    
    UWAGA: Długość monitorowania guza można dostosować w zależności od celu eksperymentów i pożądanych odczytów. Ze względu na bardzo małe rozmiary guza w ciągu pierwszych 2-3 tygodni, BLI jest zalecany do wskazania obciążenia nowotworem. Gdy guzy staną się widoczne i dostępne za pomocą suwmiarki, w celu dokładnej analizy guza zaleca się zarówno pomiary BLI, jak i suwmiarki.
20. Aby zbadać interakcje między wszczepionymi ludzkimi makrofagami a autologicznymi komórkami CART19 u myszy NSG, wygeneruj i wszczepij ludzkie makrofagi zróżnicowane ex vivo, jak opisano w krokach 6.1-6.16. Wyizolować autologiczne limfocyty T od tego samego dawcy krwi w kroku 6.1 zgodnie z 8-dniowym protokołem wytwarzania CART, jak opisano wcześniej ^9,13,14.
    UWAGA: Każda mysz NSG jest traktowana komórkami 2 x 10⁶ CART19. Użytkownicy powinni wygenerować co najmniej 2 x 10⁷ komórek CART, aby leczyć 10 myszy. Komórki CART są kriokonserwowane w 8 dniu i przechowywane do momentu wszczepienia JeKo-1 / makrofagów myszom, 5 dni po wstrzyknięciu podskórnym.
21. Po 5 dniach wstrzykiwań guza/makrofagów losowo dobieraj myszy na podstawie BLI, jak opisano w krokach 6.17-6.18. Rozmrozić i przygotować komórki CART zgodnie z opisem w kroku 3.22. Przemyć komórki koszyka PBS i odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
22. Ponownie zawiesić komórki CART w PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10^{7 komórek} /ml. Załadować strzykawkę o pojemności 0,5 ml ze 100 μl przygotowanych komórek CART i wstrzyknąć każdej myszy z nowozem dożylnie przez żyłę ogonową.
23. Monitoruj obciążenie guzem za pomocą BLI raz w tygodniu przez 4 tygodnie.
    UWAGA: Ze względu na funkcje immunosupresyjne przeszczepionych ludzkich makrofagów, u myszy, którym wstrzyknięto JeKo-1 / makrofagi, spodziewane jest upośledzone działanie przeciwnowotworowe CART i większe obciążenie guza.

7. Potwierdzenie fenotypu podobnego do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach przez barwienie immunofluorescencyjne

1. Aby potwierdzić indukowany przez JeKo-1 fenotyp podobny do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach opisanych w kroku 6 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, wykonaj kroki 6.1-6.19 i zwiększ liczbę wstrzykniętych makrofagów i lucyferazy ⁺ JeKo-1 odpowiednio do 5 x 10⁶ komórek i 1 x 10⁷ komórek na mysz NSG.
   UWAGA: Użytkownicy powinni upewnić się, że ostateczna objętość wstrzyknięcia dla każdej myszy wynosi 100 μl.
2. W dniu 7 poddaj eutanazji myszy NSG za pomocą CO₂ (ustaw przepływomierz na 3,5 l / min na 5 minut lub do momentu eutanazji zwierząt), wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i potwierdź utratę odruchów rogówkowych, jak opisano wcześniej¹⁹. Umieść myszy na stole roboczym z guzami skierowanymi do góry. Rozpyl 70% etanolu na miejsca guza i ostrożnie zbierz wszczepione guzy nożyczkami i kleszczami.
3. Przenieś tkanki nowotworowe do stożkowych probówek o pojemności 50 ml wypełnionych 20-30 ml 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia, jak opisano wcześniej²⁰. Kriokonserwacja i kriosekcja tkanek nowotworowych do barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem²⁰.
4. Barwienie tkanki nowotworowej szkiełkuje się mysim przeciwciałem anty-ludzkim CD206 sprzężonym z AF546 (1:50) i króliczym przeciwciałem anty-ludzkim iNOS skoniugowanym z AF647 (1:100) rozcieńczonym w buforze do barwienia immunofluorescencyjnego, a następnie barwieniem i konserwacją jądra, jak opisano wcześniej²¹.
   UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, użytkownicy powinni odpowiednio dostosować miareczkowanie przeciwciał, zwłaszcza gdy używane są różne linie komórek nowotworowych.
5. Uzyskaj obrazy immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopii konfokalnej z 40-krotną prędkością. Aby potwierdzić, że wszczepione ludzkie makrofagi rozwijają fenotyp podobny do M2, spodziewaj się ekspresji ludzkiego CD206 i minimalnej ekspresji ludzkiego iNOS.

Celem tego protokołu jest ustanowienie modeli zarówno in vitro , jak i in vivo w celu zbadania interakcji między ludzkimi makrofagami immunosupresyjnymi a komórkami CART ze względu na złożony charakter i dynamikę interakcji oraz ograniczone istniejące modele ksenoprzeszczepów. Zgodnie z protokołem, izolowane ludzkie klasyczne monocyty są różnicowane w celu uzyskania fenotypów podobnych do M2 i stają się funkcjonalnie immunosupresyjne.

Aby potwierdzić czystość izolowanych ludzkich klasycznych monocytów, uruchom barwione próbki na cytometrze przepływowym i przeanalizuj przez bramkowanie na ludzkiej populacji CD14 + CD16- (Figura 3A-B). Udana izolacja monocytów da co najmniej 90% populacji CD14 + CD16- z populacji rodzicielskiej żywych komórek. Aby fenotypować i potwierdzić zróżnicowane makrofagi podobne do M2, oczekuje się przesunięcia populacji odniskiego CD163niskiego CD206 do CD163wysokiego lub CD206wysokiego podczas porównywania makrofagów M0 z makrofagami podobnymi do M2 (Figura 4). Pomyślne wykazanie proliferacji specyficznej dla antygenu CART, na którą negatywny wpływ mają immunosupresyjne makrofagi, powinno wykazać znaczne zmniejszenie proliferacji CART (Figura 5A). Zgodnie z naszymi danymi, makrofagi różnicowane przez JeKo-1 są również zdolne do hamowania proliferacji specyficznej dla antygenu CART w sposób niezależny od kontaktu w teście transwellowym (Figura 5B). Udany model ksenoprzeszczepu u myszy NSG wszczepionych ludzkimi makrofagami immunosupresyjnymi powinien wykazywać znacznie szybszy postęp guza niż myszy wszczepione samymi komórkami nowotworowymi (Figura 6). Aby dodatkowo potwierdzić fenotyp podobny do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach u myszy NSG, ekspresję ludzkiego CD206 i minimalną ekspresję ludzkiego iNOS należy obserwować w makrofagach przez barwienie immunofluorescencyjne (Figura 7A-D). Oczekuje się, że wszczepione immunosupresyjne ludzkie makrofagi upośledzają działanie przeciwnowotworowe CART19 in vivo u myszy NSG (Figura 8).

Rycina 1: Schemat testu transwellowego badającego niezależne od kontaktu interakcje między komórkami CART a makrofagami. Klasyczne monocyty różnicują się w makrofagi podobne do M2 w dolnej komorze płytki transwell, jak opisano w protokole. Komórki CART19 i JeKo-1 hoduje się równolegle w stosunku 1:1 w górnej studzience przez 3 dni, a następnie przeprowadza się analizę proliferacji specyficznej dla antygenu CART za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Schemat mysiego modelu ksenoprzeszczepu NSG z przeszczepem ludzkim immunosupresyjnym makrofagami i komórkami nowotworowymi. Klasyczne monocyty są różnicowane w makrofagi M0, jak opisano w protokole. Makrofagi M0 są ostrożnie odłączane i mieszane z lucyferazą+ JeKo-1 w stosunku 1:2 w Matrigel. Jako grupa kontrolna, lucyferaza + JeKo-1 jest mieszana z PBS w stosunku objętościowym 1:1 w Matrigel. Myszy NSG są podskórnie wszczepiane zarówno komórkami nowotworowymi, jak i makrofagami lub samymi komórkami nowotworowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Klasyczne potwierdzenie czystości populacji monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Ludzkie klasyczne monocyty (CD14 + CD16-) są izolowane ze świeżych PBMC poprzez magnetyczną selekcję ujemnych kulek zgodnie z instrukcjami producenta. Zarówno PBMC, jak i izolowane monocyty są przetwarzane do barwienia cytometrią przepływową zgodnie z opisem w protokole. (A) Strategia bramkowania barwionych ludzkich PBMC jako kontroli. (B) Strategia bramkowania barwionych, oczyszczonych klasycznych monocytów ludzkich. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przepływu i strategie bramkowania. Idealna klasyczna izolacja monocytów powinna mieć czystość >90%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza fenotypów podobnych do M2 w makrofagach po różnicowaniu. Makrofagi M0 i zróżnicowane przez JeKo-1 makrofagi podobne do M2 przygotowuje się do ekspresji CD163 i CD206 za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w protokole. Reprezentatywne przesunięcie populacji jest pokazane jako półnakładka histogramu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Makrofagi podobne do M2 hamują proliferację specyficzną dla antygenu CART19 w sposób niezależny od kontaktu. (A) JeKo-1, makrofagi podobne do M2 i limfocyty T są hodowane w stosunku 2:1:2 przez 3 dni, jak opisano w protokole. Bezwzględną liczbę żywych komórek CD3 + mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywną analizę proliferacji. Pokazana jest średnia i SEM. Analizie poddano łącznie 3 kontrpróby biologiczne. Używana jest dwukierunkowa ANOVA, *p < 0,05, ***p < 0,001. (B) Makrofagi podobne do M2 są fizycznie oddzielane od stymulowanych antygenem komórek CART19 na płytce transwell (0,4 μm), jak opisano w protokole. Przedstawiono reprezentatywną analizę proliferacji. Pokazana jest średnia i SEM. Analizie poddano łącznie 3 kontrpróby biologiczne. Stosowana jest dwukierunkowa ANOVA; **p < 0,01, ****p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Zróżnicowane makrofagi sprzyjają podskórnej progresji guza w ksenoprzeszczepie NSG. Myszy NSG są podskórnie wszczepiane klasycznymi makrofagami M0 zróżnicowanymi monocytami w połączeniu z samymi komórkami JeKo-1 lub JeKo-1, jak opisano w protokole. Obciążenie guza w czasie jest monitorowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). Pokazana jest średnia i SEM. Stosowana jest dwukierunkowa ANOVA, ***p < 0,001. Mφ = makrofag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Potwierdzenie fenotypów podobnych do M2 w przeszczepionych ludzkich makrofagach u myszy NSG. Myszom NSG wszczepia się podskórnie 5 x 106 zróżnicowanych ex vivo ludzkich makrofagów i 1 x 107 lucyferazy + JeKo-1. Guzy są zbierane i przygotowywane do barwienia immunofluorescencyjnego 7 dni po wstrzyknięciu guza/makrofaga. (A) ludzki CD206 lub (B) iNOS jest barwiony odpowiednio mysim przeciwciałem anty-ludzkim sprzężonym z AF547 (czerwonym) lub przeciwciałem królika przeciwko człowiekowi skoniugowanym z AF647 (magenta); (C) lucyferaza + JeKo-1 wytworzona w laboratorium również wyraża GFP (zielony); (D) DAPI jest prezentowany w kolorze niebieskim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Immunosupresyjne hamowanie aktywności przeciwnowotworowej CART19 in vivo za pośrednictwem makrofagów. Myszom NSG wstrzykuje się podskórnie 5 x 105 ludzkich spolaryzowanych makrofagów ex vivo i 1 x 106 lucyferazy + JeKo-1 lub 1 x 106 lucyferazy + JeKo-1 w monoterapii. Myszy są leczone 2 x 106 CART19 dożylnie przez żyłę ogonową 5 dni po wstrzyknięciu guza. Obciążenie guzem jest wskazane przez BLI przez 4 tygodnie. Pokazana jest średnia i SEM. Używana jest dwukierunkowa ANOVA, *p < 0,05. Mφ = makrofag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Interesujące warunki kokultury CART19, makrofagów i JeKo-1. W 48-dołkowym teście kohodowli komórki CART19 lub UTD hodowano wspólnie z makrofagami podobnymi do M2 i komórkami JeKo-1 w stosunku 2:1:2 przez 3 dni. W teście transwell makrofagi podobne do M2 wysiewano w dolnej komorze, podczas gdy stymulowane przez JeKo-1 komórki CART19 lub UTD wysiewano w górnej komorze.

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), MustangBio (poprzez Mayo Clinic) i Sendero (poprzez Mayo Clinic). RLS i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen (za pośrednictwem Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, na które firma Immix posiada licencję. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK pełniła funkcję konsultanta dla firm Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma i Humanigen.