Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68036

⸱

2 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pain and Signaling, Butantan Institute, 2Center of Excellence in New Target Discovery, Butantan Institute, 3Innovation and Development Laboratory, Innovation and Development Center, Butantan Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zwiększone produkty końcowe zaawansowanej glikacji (AGE) pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami. Tutaj zbadaliśmy, czy glikacja uwrażliwia neurony czuciowe na pobudzenie kapsaicyny.

Streszczenie

Zwiększone produkty końcowe zaawansowanej glikacji (AGE) pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami, w tym chorobą zwyrodnieniową stawów, neuropatią cukrzycową i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Ludzkie neurony czuciowe zróżnicowane z linii komórkowej SH-SY5Y zyskują funkcje pro-nocyceptywne po wystawieniu na działanie AGE poprzez uwalnianie substancji P i zwiększanie ekspresji przejściowego potencjału receptora waniloidowego 1 (TRPV1). Tutaj zbadaliśmy, czy receptor ten jest funkcjonalnie aktywny i czy proces glikacji uwrażliwia neurony czuciowe na pobudzenie kapsaicyny. Czuciowe komórki neuronalne uzyskano z różnicowania komórek SH-SY5Y z kwasem all-trans-retinowym i neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego. Inkubacja z macierzą zewnątrzkomórkową z glikowanym kolagenem (ECM-GC) symulowała bodziec pronocyceptywny. Komórki kontrolne inkubowano z nieglikowaną zewnątrzkomórkową macierzą kolagenową (ECM-NC). Zestaw do oznaczania strumienia wapnia Fluo-8 użyto do oceny napływu wapnia, który był stymulowany przez kapsaicynę. Wyniki pokazują, że glikacja zwiększa napływ wapnia w porównaniu z komórkami traktowanymi normalnym kolagenem, co sugeruje, że neurony czuciowe wyrażają funkcjonalne kanały TRPV1 i że glikacja zwiększa pobudzenie kapsaicyny. Dane te wskazują na nadwrażliwe czuciowe komórki neuronowe AGE, wyzwalające sygnalizację pronocyceptywną. Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że stworzyliśmy funkcjonalny model reagujący na kapsaicynę, który może być przydatny do badań przesiewowych kandydatów do leczenia bolesnych stanów.

Wprowadzenie

Glikacja to nieenzymatyczny, nieodwracalny i spontaniczny proces, w którym białka, takie jak kolagen, wiążą się z cząsteczkami cukru redukującego, co skutkuje zaawansowanymi produktami końcowymi glikacji (AGEs). AGE mogą aktywować receptory błony komórkowej, wyzwalając aktywację szlaków wewnątrzkomórkowych, takich jak zewnątrzkomórkowa kinaza białkowa regulowana sygnałem (ERK) 1/2, kinaza białkowa aktywowana mitogenem p38 (MAPK) i kinazy n-końcowe c-jun (JNK), rho-GTPazy, kinaza fosfoinozytolo-3 (PI3K), kinaza janusowa/przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji (JAK/STAT) oraz kinaza białkowa C (PKC), zwiększając uwalnianie cząsteczek prozapalnych i stres oksydacyjny1. Kolagen glikowany upośledza również strukturę i właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, a zwiększone AGE pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami, w tym chorobą zwyrodnieniową stawów, neuropatią cukrzycową i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi2,3.

Nasza grupa wcześniej wykazała, że linia komórkowa SH-SY5Y może być różnicowana w komórki neuronów podobnych do czuciowych, ponieważ komórki te wyrażają kanały zaangażowane w nocycepcję, takie jak kanały sodowe (Nav 1.7, Nav 1.8 i Nav 1.9) oraz przejściowy potencjał receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1), markery zwykle występujące w obwodowych neuronach czuciowych4. TRPV1 jest nieselektywnym kanałem kationowym przepuszczalnym dla jonów wapnia i wrażliwym na bodziec kapsaicyny. Co ważne, gdy czuciowe komórki neuronalne są wystawione na działanie glikowanej macierzy kolagenowej (ECM-GC), uzyskują funkcje pronocyceptywne poprzez zwiększenie ekspresji c-Fos, czynnika transkrypcyjnego zaangażowanego w aktywację neuronów, oraz uwalnianie substancji P, neuropeptydu szeroko zaangażowanego w zapalenie nerwów i ból. Komórki te reagują na leki przeciwbólowe, takie jak morfina, prototyp opiatu, zmniejszając uwalnianie substancji P indukowanej przez ECM-GC. Łącznie dane te wskazują, że model ten reaguje na cząsteczkę pro i anty-nocyceptywną4,5.

Monitorowanie wewnątrzkomórkowych zmian stężenia Ca2+ jest niezbędne do badania wielu procesów komórkowych. W neuronach może być użytecznym narzędziem do przewidywania uszkodzeń neuronów i neuroprotekcyjnych właściwości leków. Kapsaicyna, ostry składnik aktywny ostrej papryczki chili, jest najlepiej przebadanym agonistą receptora TRPV15 i cennym narzędziem do badania mechanizmów bólu i badań przesiewowych potencjalnych nowych leków przeciwbólowych. Wcześniejsze badania wykazały, że pierwotne neurony czuciowe z grzbietowych zwojów korzeniowych gryzoni inkubowanych z wysokim poziomem glukozy wykazują znaczny wzrost napływu wapnia indukowanego kapsaicyną6. Jednak to, czy kanał TRPV1 był funkcjonalnie aktywny w naszym modelu komórkowym i czy glikowany kolagen uwrażliwia czuciowe komórki neuronalne na wzbudzenie kapsaicyny, które może aktywować nocyceptywne szlaki sygnałowe, pozostaje nieznane. Dlatego naszym celem było opracowanie opłacalnego protokołu wykorzystującego proste narzędzia do monitorowania wapnia w komórkach sensorycznych w czasie rzeczywistym, przy jednoczesnym zapewnieniu wiarygodnej analizy. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół, który pomaga naukowcom przejść przez kolejne etapy różnicowania komórek SH-SY5Y w czuciowych komórkach neuronowych i jak uwrażliwić je na bodźce pronocyceptywne. Metoda ta może przyczynić się do odkrycia nowych związków przeciwbólowych lub neuroprotekcyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek SH-SY5Y i ich różnicowanie w komórki neuronopodobne o charakterze sensorycznym

UWAGA 1: Wszystkie etapy opisane w tej sekcji muszą być wykonywane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie roztwory i materiały muszą być sterylne.

  1. Najpierw przygotować kolbę hodowlaną (25 cm2), dodając 5 mL pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Do rozmrażania, namnażania i utrzymania tego typu komórek należy stosować mieszaninę pożywek: DMEM/F12 (Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12) uzupełnioną o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Następnie wyjąć z ciekłego azotu kriotubkę zawierającą komórki SH-SY5Y i przechowywać ją w lodzie. Rozmrozić komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 min.
  3. Do krioprobówki dodać 1 mL pełnej pożywki hodowlanej, przenieść komórki do probówki 15 mL, dodać 3 mL pełnej pożywki hodowlanej (DMEM/F12 uzupełniony o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej) i wymieszać, wielokrotnie pobierając i wydmuchując zawiesinę do probówki za pomocą pipety.
  4. Przenieść komórki do probówki 15 mL i odwirować przy 290 g. Odlać supernatant, aby usunąć dimetylosulfoksyd (DMSO), środek krioprotekcyjny stosowany w celu zapobiegania tworzeniu się kryształków lodu podczas zamrażania komórek.
  5. Do osadu komórkowego dodać 1 mL pożywki hodowlanej, dobrze wymieszać za pomocą pipety i przenieść do kolby hodowlanej 25 cm2 w celu namnożenia komórek. Umieścić komórki w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Komórki można wykorzystać, gdy osiągną około 80% konfluencji. W przypadku różnicowania neuronalnego zaleca się stosowanie komórek SH-SY5Y do dwudziestego pasażu.
  6. Przygotować zewnątrzkomórkową macierz kolagenową (100 µg/mL), rozcieńczając kolagen typu I z ogona szczura w sterylnym PBS, a następnie wlać 1 mL tego roztworu do szalki Petriego (35/10 mm) w celu powlekania.
  7. Inkubować w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 przez około 1 h.
  8. Po tym czasie dwukrotnie przemyć płytkę sterylnym PBS, a następnie policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera.
  9. Aby policzyć komórki, najpierw przemyć kolbę hodowlaną 25 cm2 zawierającą komórki 5 mL sterylnego PBS, aby usunąć całą pożywkę hodowlaną. Następnie usunąć sterylną PBS, dodać do komórek 3 mL 0,05% trypsyny i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez około 3-5 min, aby całkowicie odlepić komórki.
  10. Następnie wyjąć komórki z inkubatora, dodać do kolby hodowlanej 6 mL pożywki hodowlanej i przenieść ten roztwór do probówki 15 mL. Odwirować przy 290 g przez 5 min.
  11. Usunąć supernatant i dobrze resuspendować komórki w 1 mL pełnej pożywki hodowlanej.
  12. Na koniec policzyć komórki przy użyciu komory liczbowej Neubauera. Wymieszać 20 µL zawiesiny komórkowej i 20 µL błękitu trypanu, a następnie dodać 10 µL tej mieszaniny do komory Neubauera. Policzyć żywe komórki, które nie zabarwiły się na niebiesko.
  13. Wysiać komórki w stężeniu 5 × 104 komórek/mL do szalki Petriego (35/10 mm) w tej samej pożywce hodowlanej, która została opisana wcześniej. Zastosować całkowitą objętość 1 mL na płytkę.
  14. Następnie odczekać 24 h przed rozpoczęciem protokołu różnicowania neuronalnego. W tym celu usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 1 mL DMEM/F12 uzupełnionego o 2% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 10 µM całkowitego kwasu retinowego (RA 10 µM).
  15. Odczekać 48 h i wymieniać pożywkę hodowlaną codziennie przez 3 dni. Komórki przechowywać w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  16. Piątego dnia usunąć pożywkę z komórek i dodać do każdej płytki 1 mL bezsurowiczej pożywki hodowlanej uzupełnionej o ludzki neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF 50 ng/mL).
    UWAGA: Przetestowano BDNF od różnych producentów (patrz tabela materiałów). Wszystkie działały w ten sam sposób.
  17. Siódmego dnia różnicowania przemyć komórki raz sterylnym PBS i wykorzystać komórki neuronopodobne do eksperymentów. Jeśli nie jest możliwe natychmiastowe wykorzystanie tych komórek, dodać bezsurowiczą pożywkę hodowlaną, aby utrzymać ich żywotność do czasu użycia.
    UWAGA: Po zakończeniu różnicowania neuronalnego konieczne jest przemycie komórek sterylnym PBS w celu usunięcia pozostałego BDNF, aby uniknąć toksyczności komórkowej.

2. Kolagen glikowany i proces glikacji

UWAGA: Wszystkie etapy w tej sekcji muszą być wykonywane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie roztwory i materiały muszą być sterylne.

  1. Przygotuj glikowany kolagen poprzez inkubację kolagenu typu I z ogona szczura w formie włóknistej (3,89 mg/mL) z 200 mM D-rybozą, 160 mM D-glukozą i 200 mM D-treozą w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
    UWAGA: Aby przygotować kolagen glikowany, odważ cukry na podstawie ich masy cząsteczkowej i wymieszaj je z kolagenem typu I z ogona szczura w formie włóknistej (3,89 mg/mL).
  2. Inkubuj hodowlę komórek neuronów zmysłowych przez 24 h z macierzą zewnątrzkomórkową z kolagenu glikowanego (ECM-GC, 100 µg/mL) lub macierzą zewnątrzkomórkową z normalnego kolagenu (ECM-NC, 100 µg/mL) przygotowaną w pośrodku hodowlanym DMEM/F12 bez dodatku surowicy i antybiotyków.

3. Analiza napływu wapnia

  1. W celu oznaczenia napływu wapnia należy użyć zestawu do pomiaru strumienia wapnia i przygotować roztwory zgodnie z instrukcjami producenta, jak wskazano poniżej.
  2. W pierwszej kolejności należy przygotować 1 mL roztworu do ładowania barwnika Fluo-8, dodając 2 µL roztworu zapasowego Fluo-8 do 998 µL 1x buforu do analizy (mieszaniny buforu HBSS i 10x Pluronic F127 Plus).
    UWAGA: Ten roztwór roboczy jest stabilny przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Następnie 250 µL tego roztworu należy dodać do każdej płytki z komórkami neuronopodobnymi, które zostały uprzednio zróżnicowane i potraktowane ECM-NC lub ECM-GC, i inkubować przez 30 min w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie płytkę należy wyjąć z inkubatora i pozostawić w RT (w ciemności) na 30 min.
    UWAGA: Roztwór ten staje się cytotoksyczny, jeśli czas inkubacji zostanie przekroczony ponad 2 h. W czasie inkubacji należy przygotować roztwór kapsaicyny.

4. Indukcja kapsaicyną

UWAGA: Do indukowania napływu wapnia do komórek użyto kapsaicyny, która jest agonistą TRPV1.

  1. Odważyć i rozcieńczyć kapsaicynę w 1% etanolu i wodzie ultrapure. Następnie przygotować roztwór o stężeniu 2 µM, rozcieńczając go również w wodzie ultrapure.
    UWAGA: Roztwór kapsaicyny należy przygotować w dniu użycia. Kapsaicynę należy rozcieńczać najpierw w etanolu, a następnie w wodzie; w przeciwnym razie ulegnie ona wytrąceniu.
  2. Dodać 250 µL roztworu kapsaicyny o stężeniu 2 µM do każdej szalki Petriego 35/10 mm, tak aby stężenie końcowe wynosiło 1 µM.
    UWAGA: Stężenie roztworu stokowego kapsaicyny wynosiło 2 µM, aby zapewnić lepszą dyspersję i uniknąć izolowanych pików fluorescencji.

5. Obrazowanie napływu wapnia i analiza z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Obrazowanie przeprowadzono za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 20x/0,75NA i laser wzbudzający 488 nm (intensywność 0,5%). Emisję wykrywano przy 520 nm. Komórki skanowano w osiach xy (512 x 512 pikseli) w czasie (t) z prędkością 600 Hz, przy odstępie akwizycji 433 ms i całkowitym czasie akwizycji 5 min. Obrazowanie przeprowadzono w temperaturze 37 °C, aby za pomocą oprogramowania mikroskopowego utrzymać fizjologiczne warunki komórek.

  1. Przygotować strzykawkę z 250 µL 2 µM roztworu kapsaicyny (stężenie końcowe na płytce wyniesie 1 µM) i podłączyć ją do kaniuli typu motylkowego (Butterfly) 23 GA, sterylnej. Strzykawkę należy zabezpieczyć za pomocą statywu laboratoryjnego i zacisku.
  2. Umieścić szalkę Petriego na stoliku mikroskopu i z najwyższą ostrożnością wprowadzić igłę kaniuli do szalki, unikając kontaktu z dnem; końcówka igły nie powinna być zanurzona w cieczy.
    UWAGA: Do ustalenia pozycji kaniuli można użyć taśmy klejącej.
  3. Znaleźć pole z odpowiednią liczbą komórek (więcej niż 20) i ustawić ostrość, korzystając z oświetlenia w polu jasnym.
  4. Uruchomić tryb Live z użyciem lasera 488 nm oraz dostosować parametry ostrości i oświetlenia.
  5. Rozpocząć rejestrację obrazu, a po okresie bazowym (t = 0 do t = 60 sekund) dodać 250 µL 2 µM kapsaicyny, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby pobudzić napływ wapnia do komórek.
    UWAGA: Końcowy czas akwizycji nagrania wynosił około 300 s na płytkę.

6. Obróbka danych / analiza danych

  1. Przeprowadź analizę komórek za pomocą oprogramowania do mikroskopii w trybie Quantification (Kwantyfikacja). Najpierw przeanalizuj komórki wykazujące skoki fluorescencji przed i po stymulacji kapsaicyną.
  2. Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) dla każdej komórki reagującej, tj. komórek, które wykazują skok fluorescencji po podaniu kapsaicyny. Należy upewnić się, że ROI obejmuje cały obszar komórki, jak pokazano powyżej (Rycina 1).
  3. Wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanych przecinkami (CSV) w celu przeprowadzenia dalszej analizy.
  4. Alternatywnie przeprowadź analizę przy użyciu bezpłatnego oprogramowania FIJI7 (https://fiji.sc).
    1. Aby otworzyć pliki obrazów, użyj wtyczki Bio-Formats, przechodząc do File > Import > Bio-Formats i wybierając odpowiedni plik.
  5. Następnie użyj narzędzia Magnifying Glass (Lupa), aby powiększyć obraz, oraz narzędzia Freehand Selection (Zaznaczanie swobodne), aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) wokół reagujących komórek.
  6. Po wyrysowaniu każdego ROI naciśnij klawisz T, aby dodać go do ROI Manager (Menedżera ROI). Powtórz ten proces dla wszystkich interesujących komórek (Rycina 2).
  7. Po dodaniu wszystkich ROI przejdź do okna ROI Manager, zaznacz wszystkie ROI, a następnie w menu głównym wybierz Analyze > Set Measurements.
  8. Następnie wróć do ROI Manager i wybierz More > Multi Measure, aby zmierzyć intensywność we wszystkich klatkach. Wyniki pojawią się w nowym oknie; wyeksportuj je do pliku CSV, przechodząc do File > Save As.
    UWAGA: Plik CSV można analizować w programach Excel, Google Sheets oraz GraphPad. Użyj równania ΔF/F0  = (F(t) - F0)/F0, aby przeliczyć wartości intensywności fluorescencji uzyskane za pomocą zestawu Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit na względną miarę zmiany napływu wapnia. Tutaj F0 reprezentuje fluorescencję bazową, obliczaną jako średnia intensywność z obrazów zarejestrowanych od t = 0 s do t = 60 s przed stymulacją kapsaicyną. F(t) to wartość maksymalnej intensywności fluorescencji zaobserwowana po stymulacji, co pozwala na ocenę szczytowego napływu wapnia. Takie podejście podkreśla wzrost fluorescencji względem poziomu bazowego, gdzie wzrost ΔF/F0 wskazuje na podwyższony wewnątrzkomórkowy poziom wapnia.

Analiza mikroskopii fluorescencyjnej, segmentacja obrazu; struktura komórki wyróżniona za pomocą interfejsu oprogramowania.
Rysunek 1: Przykład ROI w wybranych komórkach do analizy napływu wapnia w oprogramowaniu LAS X. (A) Interfejs LAS X w trybie kwantyfikacji. Różowy prostokąt wskazuje kartę kwantyfikacji. Żółty prostokąt wskazuje narzędzie rysowania polilinii, a cyjanowy prostokąt wskazuje narzędzia pomniejszania i powiększania obrazu. (B) Przechwycone pole widzenia (FOV). (C) Powiększenie FOV w celu ułatwienia wyznaczenia ROI w całej komórce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy, analiza fluorescencji z wyborem ROI, oprogramowanie do przetwarzania danych neurocytologicznych.
Rysunek 2: Przykład ROI w wybranych komórkach do analizy napływu wapnia w oprogramowaniu FIJI. (A) Interfejs FIJI przedstawiający menu główne i narzędzia. Czerwony kwadrat wskazuje narzędzie lupy, a zielony kwadrat wskazuje wybór swobodny (Freehand selection). (B) Pole widzenia (FOV) uchwycone z powiększeniem i narysowanym ROI. (C) Okno menedżera ROI. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

7. Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli obraz jest nieostry, należy wypróbować następujące kroki:
    1. Sprawdzić przyczepność taśmy; jeśli poluzowała się, może to spowodować przesunięcie igły i wpłynąć na ostrość obrazu.
    2. Ponownie przymocować igłę za pomocą dodatkowej taśmy, aby zwiększyć stabilność.
    3. Wymienić standardowe igły. Użyć wcześniej zgiętych końcówek igieł dentystycznych, aby poprawić ich dopasowanie do płytki.
  2. Jeśli komórki wykazują nasycony sygnał, należy wypróbować następujące kroki:
    1. Zmniejszyć intensywność lasera oraz ustawienia wzmocnienia (gain).
    2. Zweryfikować czas inkubacji odczynników. Jeśli przekracza on zalecenia producenta, może to doprowadzić do nasycenia sygnału, co utrudni detekcję napływu jonów wapnia.
  3. W celu rozwiązywania problemów należy zastosować następujące dodatkowe sugestie:
    1. Regularna kalibracja: Upewnić się, że sprzęt obrazujący jest regularnie kalibrowany w celu utrzymania ostrości i jakości detekcji sygnału.
    2. Dokumentowanie zmian: Prowadzić dziennik wszelkich modyfikacji wprowadzonych do protokołu, aby umożliwić przyszłe odniesienie i ułatwić rozwiązywanie problemów.
    3. Korekty reaktywne: Jeśli problemy nadal występują, rozważyć testy z różnymi stężeniami odczynników lub alternatywnymi metodami detekcji sygnału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Różnicowanie komórek SH-SY5Y w neurony sensoryczno-podobne
Obrazy z przesiewu wysokotreściowego (high-content screening) wykazują, że protokół różnicowania neuronalnego zmienia morfologię komórek SH-SY5Y. Komórki neuronów sensoryczno-podobnych (komórki zróżnicowane) wykazują zaokrąglone ciało komórki, z którego odchodzi rozbudowana sieć neurofilamentów. Tworzą one rozgałęzienia bardziej wydłużonych wypustek neurytowych łączących sąsiednie neurony, co jest zgodne z cechami dojrzałych neuronów (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nocyceptory to wyspecjalizowane podzbiory neuronów czuciowych, które pośredniczą w bólu. Komórki te wyrażają kanały jonowe bramkowane napięciem i ligandowe, takie jak TRPV1, których aktywacja prowadzi do napływu wapnia i uwalniania neuropeptydów i neuroprzekaźników regulujących przekaźnictwo nocyceptywne. W tym miejscu opisujemy protokół różnicowania SH-SY5Y w czuciowe komórki neuronalne w celu oceny napływu wapnia wywołanego kapsaicyną 8,9. Co ważne, wykazaliśmy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

MCB, AMCT i VOZ posiadają patent na proces identyfikacji jednostek molekularnych zaangażowanych w ból związany z chorobą zwyrodnieniową stawów (BR102018008561-1).

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Grant numer 2015/50040-4 i 2020/13139-0, São Paulo Research Foundation i GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 i 2024/04023-0.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas all-trans retinowyTocris695
BDNFTocris TOCR-2837
BDNFSigma-AldrichB3795
Butterfly typ 23GA sterylnyBeckton Dickinson Asepto38833814Zestaw żył skóry głowy
KapsaicynaSigma-AldrichM2028
D-glukozaSigma-AldrichG5767
DMEM/F12Gibco12500062Podłoże podstawowe
D-rybozaSigma-AldrichR7500
D-treozaSigma-AldrichT7392
Fluo-8 Zestaw do oznaczania topnika wapniaAbcamab112129Bez mycia
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaGibcoA5670801
Wysoka zawartość Badania przesiewowe Urządzenia molekularne Oprogramowanie
LASXOprogramowanie do mikroskopiiLeica Microsystems
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsMikroskop konfokalnyLeica TCS SP8
15140130Gibco
(35/10 mm)Greiner bio-one627965
Kolagen typu ICorning
SH-SY5YMerck94030304-1VLLinia komórkowa nerwiaka zarodkowego
Szalka Petriego Ogon szczura 354236

Bibliografia

  1. Bierhaus, A., et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).
  2. Hudson, B. I., et al. Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders. Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).
  3. Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior. Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).
  4. Bufalo, M. C., et al. Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds. Cells. 11 (2), 247(2022).
  5. Frias, B., Merighi, A. Capsaicin, nociception and pain. Molecules. 21 (6), 797(2016).
  6. Lam, D., et al. RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose. PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).
  7. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  8. Li, F., et al. TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception. Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).
  9. Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain. Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).
  10. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  11. Vetter, I., et al. Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).
  12. Dekker, L. V., et al. Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).
  13. Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death. J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).
  14. Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).
  15. Tominaga, M., et al. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzbudzenie kapsaicynkana TRPV1glikowany kolagentest wapniowy Fluo 8mikroskopia konfokalnar nicowanie SH SY5Ysygnalizacja pronocyceptywna
Produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.