Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu ostrego uszkodzenia płuc u prosiatka noworodkowego, odtwarzającego wczesne środowisko przedwcześniackich płuc

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68058

⸱

31 października 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje opracowanie modelu noworodkowego prosięta ostrego urazu płuc, który modeluje wczesne zdarzenia patogenne występujące w przedwczesnym płucu, w tym niewystarczającą ilość surfaktantu, hiperoksję, wentylację pod wysokim ciśnieniem oraz stan zapalny, aby ułatwić zrozumienie molekularnych czynników wyzwalających dysplazję oskrzelowo-monową oraz poprawić terapeutyczne tłumaczenie.

Streszczenie

Przedwczesny poród jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności dziecięcej. Dysplazja oskrzelowo-monowa (BPD) jest ciężką konsekwencją skrajnego przedwczesnego porodu, prowadzącą do zmian wzrostu płuc oraz długotrwałych efektów rozwojowych. Patogeneza BPD jest wieloczynnikowa, w tym wentylacja mechaniczna, hiperoksja i stan zapalny są głównymi czynnikami rozwoju choroby. Obecnie nie istnieje leczenie BPD. W tym badaniu przedstawiono wykonalny i powtarzalny nowy model ostrego uszkodzenia płuc (ALI), naśladujący bodźce kliniczne doświadczane przez ludzkie przedwczesne płuca. Model noworodka ALI z wieloma uderzeniami – łączący wyczerpanie surfaktantów, hiperoksję, wentylację pod wysokim ciśnieniem oraz podawanie lipopolisacharydów wewnątrztchawicowych (LPS) prowadzi do zaburzeń natlenienia, zaburzeń funkcji płuc, stanu zapalnego przy infiltracji neutrofili oraz histologicznego uszkodzenia płuc. Jego główne zalety to wykorzystanie szkodliwych bodźców znanych z patogenezy BPD oraz ich niskie wymagania w utrzymaniu. Generuje wysoko wartościowe ALI, spełniające kryteria American Thoracic Society ALI. Modele dużych zwierząt, takie jak ten model prosiatka, są kluczowe dla zrozumienia wczesnych czynników patogennych, identyfikacji celów terapeutycznych oraz ułatwienia klinicznego przeniesienia do pacjentów.

Wprowadzenie

Skrajne wcześniaki są główną przyczyną zgonów u dzieci przed ukończeniem piątego rokużycia. Najczęstszym ciężkim powikłaniem przedwczesnego porodu jest dysplazja oskrzelowo-monowa (BPD), przewlekła choroba płuc, której czynniki wieloczynnikowe obejmują stan zapalny, stres oksydacyjny związany z hiperoksją oraz uraz wywołany respiratorem2. To mikrośrodowisko prowadzi do upośledzenia wzrostu płuc, co może mieć długotrwały wpływ na wzrost i rozwój wcześniaków3. Obecnie nie istnieje leczenie BPD.

Najnowszy przegląd systematyczny dotyczący wykorzystania komórek mezenchymalnych stromalnych jako potencjalnego leczenia BPD wykazał, że dane przedkliniczne dotyczyły wyłącznie gryzoni4. Zjawisko to jest powszechne ze względu na szeroką dostępność, łatwość obsługi i utrzymanie modeli gryzoni. Jednak powielanie badań na modelach dużych zwierząt jest kluczowe dla zapewnienia sukcesu w wysiłkach translacyjnych dotyczących nowych i nadchodzących terapii dla wcześniaków. Wiele badań klinicznych kończy się niepowodzeniem z powodu niewystarczających badań przedklinicznych5, co spowalnia rozwój terapii dla pacjentów. Chociaż preferowanym modelem przedklinicznym jest użycie modelu naczelnego nieludzkiego do przygotowania się do badań klinicznych na ludziach, jest to pracochłonne, kosztowne i trudno dostępne. Model noworodkowego prosięta jest korzystny, ponieważ wykorzystuje leki i sprzęt podobny do opieki noworodkowej, naśladując kliniczne środowisko intensywnej terapii noworodków, co zwiększa wykonalność translacji klinicznej. Ponadto układ odpornościowy płuc wieprzowych bardzo przypomina układ odpornościowy ludzkiego 6,7,8,9, dzieląc ponad 80% genetycznej zmienności receptora toll-podobnego 4,10, z makrofagami reagującymi na lipopolisacharydy (LPS)11,12 oraz produkcją tlenku azotu13 – potencjalnymi czynnikami zapalnymi w ludzkim płucach14. Ponadto surfaktant płucny pochodzący ze świń to klinicznie udokumentowane leczenie stosowane w ostrych chorobach płuc u wcześniaków urodzonych15 lat.

Protokół ten przedstawia nowy model jednodniowego ostrego urazu płuc (ALI) dla dużych zwierząt u nowo narodzonych prośiąt z spójnymi, standaryzowanymi i przekładalnymi wynikami, zgodnie z kryteriami ALI Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej ALI 16,17,18. Powtarzane płukania płuc solą fizjologiczną w celu wyczerpania powierzchniowo czynnego z wentylacją pod wysokim ciśnieniem oraz późniejszego LPS lub innej ekspozycji toksycznej były stosowane u dorosłych świń do wywołania uszkodzenia płuc18. Jednak podobne modele dostępne u noworodkowych prośiąt są rzadkościąw 19,20. Protokół ten opisuje, jak wywołać uszkodzenie płuc za pomocą dostosowanego protokołu wyczerpania powierzchniowo czynnego: płucapłukają 21,22,23 pod wentylacją hiperoksyczną i wysokociśnieniową, a następnie wywołują zapalenie za pomocą LPS bezpośrednio do płuc. Model ten jest przygotowany do podawania leczenia według wyboru lokalnie (śródtchawica - IT) lub systemowego (dożylnie dożylnie) po wywołanym urazie płuc, z monitorowaniem jego efektu przez 5 godzin. Cała struktura bardzo przypomina stan przedwczesnych płuc niemowląt. Zużycie powierzchniowo czynnego powoduje zespół niewydolności oddechowej, charakteryzujący się brakiem powierzchniowo czynnego przy urodzeniu. Ta dolegliwość może być powiązana z barotraumą, traumą elektrodelectową oraz problemami z natlenieniem, które wymagają wysokiego poziomu tlenu i wentylacji mechanicznej. Na koniec, większość wcześniaków rodzi się w środowisku zapalnym z powodu zapalenia chorioamnionitis, czyli infekcji, co próbowano powtórzyć poprzez podanie LPS w tym modelu prosiatka. Ten model wielohitowy ALI tworzy podobne bodźce kliniczne, z jakimi mierzą się ludzkie przedwcześniaki płuca, które dostarczą bezcennych informacji na temat wczesnych procesów patogennych BPD oraz potencjalnej optymalizacji terapii dla skutecznego tłumaczenia klinicznego24.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane przez certyfikowany personel zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi przepisami (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) po zatwierdzeniu przez regionalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami oraz Służbę Opieki nad Zwierzętami i Weterynaryjną (protokół OHRIe-3731). Do tego modelu użyto nowo narodzonych prosiatek obu płci, 0–3 dni, z mieszanką Yorkshire, Landrace i Duroc. Szczegółowy opis kroków (numer kroku w nawiasach) przygotowania, znieczulenia, zarządzania płynami i lekami stosowanych przez cały czas trwania eksperymentu (1-3), procedur chirurgicznych (4) w tym okresu stabilizacji (5) przed wywołaniem wielokrotnego urazu płuca (7), z obserwacją po urazie i wentylacją konserwacyjną (6, 8) kończącą się eutanazją i zakończeniem eksperymentu (10). Przedstawiona jest również opcjonalna standaryzowana procedura leczenia śródtchawicowego (9). Łączny czas od farmy do zakończenia eksperymentu i pobrania próbek wynosi około 12-15 godzin. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Włącz i skalibruj monitory oraz respirator przed przybyciem prosiaczka. Upewnij się, że karty pamięci są włożone do monitora do ciągłego zapisywania danych podczas eksperymentu.
  2. Ustaw respirator z maksymalnym ciśnieniem wdechowym () 15 cmH2O, dodatnim ciśnieniem wydechowym na końcu (PEEP) 6 cmH2O, przepływem wdechowym 8 L/min, częstością oddechu (RR) 30/min, czasem wdechowym (T insp) 0,4 s, udziałem tlenu wdechowego (FiO2) 1,0 oraz podłącz nowy obwód wentylacyjny i nawilżacz.
  3. Przygotuj sterylne opaski chirurgiczne, zasłony, materiały eksploatacyjne (w tym leki – patrz Tabela materiałów), cewniki oraz wydrukowany CRF. Zwiększ temperaturę w sali operacyjnej do 25 °C lub wyższej, w zależności od tego, co zespół badawczy uzna za konieczne. Włącz koc grzewczy/materac z wodą do 39 °C. Przygotuj system ogrzewania z wymuszonym powietrzem, gotowy do użycia w razie potrzeby dodatkowej regulacji temperatury.
  4. Włóż 1 L worek soli fizjologicznej do ciepłej kąpieli wodnej (39 °C), aby przygotować płukanie płuc.
  5. Ustaw pompy infuzyjne leków (ketamina i propofol) i dodaj nowe worki z laktacyjnymi Ringerami w temperaturze pokojowej oraz Dextrozą do pomp płynów.
  6. Prosiaczek zostaje z lochą na lokalnej farmie i ma do niej swobodny dostęp, dopóki nie zostanie odebrana przez członka zespołu badawczego. Zwróć uwagę na płeć, wiek, wielkość miotu i czas urodzenia.
    UWAGA: W zatwierdzonym pojeździe transportowym uczelni z wykwalifikowanym kierowcą przez cały czas transportu obecny jest doświadczony członek zespołu. Prosiaczko umieszcza się w dużym, zamkniętym, miękkim transporterze, który pozwala mu bezpiecznie, swobodnie się poruszać i leżeć w swobodny sposób (w razie potrzeby z gumową termoforem owiniętą kocami). Dzięki temu prosiaczko pozostaje spokojne (często zasypia) w tym kojącym otoczeniu. Transporter z prosiakiem jest zabezpieczany pasem bezpieczeństwa. Członek zespołu ma za zadanie delikatnie uspokajać prosiaczka i unikać głośnych dźwięków, aby ograniczyć poziom stresu prosiaczka do minimum.
  7. Po przybyciu do instytucji badawczej minimalizuj hałas i delikatnie trzymaj prosiaczka, zakładając na jego twarz nos stożek znieczulony.

2. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Ta sekcja obejmuje indukcję i utrzymanie znieczulenia (zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucjonalne).

  1. Zainicjuj przepływO2 bez izofluranu podczas zakładania stożka nosowego. Gdy prosiatko się uspokoi, rozpocznij izofluran i zwiększ go do podania 3% izofluranu (około 60 s). Monitoruj oddech uważnie i odpowiednio dostosowuj izofluran.
  2. Sprawdź brak reakcji prosiaczka mocnym szczypnięciem palca.
  3. Gdy prosiaczko przestanie reagować, zważ i zmierz je, aby podać odpowiednie dawkowanie leków.
  4. Wstrzyknięcie buprenorfiny HCL (0,04 mg/kg) drogą domięśniową (IM) z igłą 25 g w tylną nogę w celu przeciwbólu.
  5. Przymocuj pulsoksymetr do prawego górnego kopyta (preduktalnego), nieinwazyjnego mankietu do pomiaru ciśnienia krwi (do czasu kanulacji tętnicy udowej) oraz elektrody EKG.
  6. Włóż angiocaty 24 G do obu uszu. Przymocuj zestawy przedłużaczy 6" z przepłukaną solą fizjologiczną z czterodrożnymi zaworami zaworowymi. Wspieraj ucho gumką do języka, aby uniknąć niedrożności pozycji.
  7. Pobierz krew z założonego cewnika do ucha do pomiaru poziomu glukozy (BG) za pomocą skalibrowanego glukometru zgodnie z zaleceniami producenta.
  8. Rozpocznij dożylne podawanie D5W (dożylnie) w dawce 5 mL/kg/h i dostosuj poziom glukozy we krwi, aby osiągnąć poziom glukozy 4-5 mmol/L.
  9. Podawaj bolusowe zastrzyki z leków przeciwbólowych/znieczulających do drugiej żyły ucha.
    UWAGA: Krytyczne zrozumienie właściwości i skutków ubocznych tych leków jest niezbędne do ich optymalnego i bezpiecznego stosowania.
    1. Podaj bolus 2 mg/kg dożylnie rozcieńczonej ketaminy (10 mg/mL) oraz bolus 5 mg/kg dożylnie propofolu (10 mg/mL, 1%) podawany w kilku mniejszych dawkach bólu. Uważaj na możliwość wystąpienia bezdechu po podaniu bolusu propofolu. Kontynuuj ostrożne podawanie bolusów propofolu (łącznie 5 mg/kg), aż prosięcie przestanie reagować na test szczypnięcia twardego palca i zostanie ustalona ciągła infuzja propofolu.
    2. Odstaw podawanie izofluranu (po rozpoczęciu infuzji propofolu dożylnie) i kontynuuj ciągłą znieczulenie dożylne przez resztę eksperymentu.
  10. Rozpocznij ciągłą infuzję następującego schematu znieczulenia z ostrożną dawką w zależności od tętna i ciśnienia krwi, w tym odruchu odstawienia, aby osiągnąć stabilną głębokość operacji znieczulenia:
    1. Propofol (10 mg/mL) w dawce 10-30 mg/kg (równowartość 1-3 mL/kg/h) dożylnie.
    2. Ketamina (100 mg/mL) w dawce 5-10 mg/kg (równowartość 0,05-0,1 mL/kg/h) dożylnie.
      UWAGA: Linie infuzyjne do analgezji/znieczulenia są podłączone do cewnika ucha po przeciwnej stronie infuzji D5W. Może być konieczna korekta całkowitego spożycia płynów i temperatury otoczenia, aby zapewnić odpowiednie wsparcie i homeostazę.

3. Płyny, leki i monitorowanie

UWAGA: Ta sekcja zawiera informacje o utrzymaniu nawodnienia, dostarczaniu glukozy, analgezji/znieczuleniu oraz zapewnieniu właściwej analizy danych eksperymentalnych, obaw lub problemów.

  1. Upewnij się, że całkowita ilość płynu połączonego (LRS i D5W) dożylnie dla homeostazy wynosi zazwyczaj 5-8 mL/kg/h.
    1. Podawaj D5W do cewnika żylnego ucha w dawce 5-10 mL/h (korygowane co godzinę na podstawie wartości glukozy we krwi w tętnicy (BG) – cel 4-5 mmol/L).
    2. Podawaj LRS przez cewnik żylny kości udowej w tempie 1-6 mL/kg/h, aby utrzymać homeostazę płynów. Aby zapobiec zakrzepnięciu zarówno dostępu tętniczego, jak i żylnego, przymocuj do przetwornika worek infuzyjny NS z heparyną pod ciśnieniem i utrzymuj ciśnienie w zakresie 250-300 psi.
    3. Zadbaj o odpowiednią głębokość znieczulenia ogólnego i stosowanie znieczulenia ogólnego przez cały czas trwania operacji oraz przed rozpoczęciem okresu stabilizacji (krok 5.1) i wywołaniem rozluźnienia mięśni.
  2. Monitorowanie różnych parametrów (praca na pełen etat dla jednej osoby przez cały eksperyment).
    UWAGA: Monitorowanie i dokumentowanie parametrów życiowych, ustawień respiratora, interwencji, pobranych próbek, leków, wraz z dawkami i godzinami, w gotowym wydrukowanym CFR (patrz Plik Uzupełniający 1) przez cały eksperyment. Zarejestrowane dane ciągłe z monitora ciśnienia i wentylatora są zapisywane na koniec eksperymentu do późniejszej analizy.
    1. Monitoruj saturację tlenem (SpO2) – upewnij się, że pulsoksymetr jest predukcyjny (prawy górny kopyto).
    2. Monitoruj tętno (HR) – podłącz elektrody EKG do prosiaczka.
    3. Aby monitorować temperaturę, włóż nawilżony termometr odbytniczy na głębokość 3-4 cm i przymocuj go taśmą do ogona. Utrzymuj temperaturę odbytniczą prosiatka na poziomie 38-39 °C, regulując podkładkę grzewczą i temperaturę otoczenia w pomieszczeniu (25 °C). Jeśli używasz elektrycznego źródła ciepła, upewnij się, że między prosiakiem a matą grzewczą jest dodatkowy koc, aby uniknąć oparzeń.
      UWAGA: Użyj dodatkowego źródła ogrzewania, takiego jak system ogrzewania wymuszonym powietrzem (np. koc nałożony na prosiaczka), jeśli homeostaza temperatury nie jest osiągnięta wystarczająco.
    4. W przypadku pomiaru ciśnienia krwi należy wykonać nieinwazyjne monitorowanie z odpowiednim mankietem do czasu po operacji, następnie określić inwazyjne ciśnienie krwi, w tym średnie ciśnienie tętnicze (MAP) i ciśnienie żylne centralne (CVP), a następnie dokumentować w CRF.
      UWAGA: Upewnij się, że kopuły przetworników tętnic i żylnych są umieszczone i zerowane na poziomie serca, aby uzyskać dokładne odczyty.
    5. Pobieranie krwi w określonych terminach za pomocą centralnego cewnika tętnicznego lub żylnego. Wykonanie analizy gazodenów krwi 0,1 mL heparynowej krwi tętniczej za pomocą przenośnego analizatora krwi (urządzenie, które może oceniać co najmniej pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, mleczan, kreatyninę, Na, K, Cl – należy odnotować na CRF), aby kontrolować wentylację i kontrolę metaboliczną przez cały eksperyment.
    6. Przeprowadz pobieranie próbek biologicznych do przyszłych eksperymentów i analiz: pobieraj bieżącą krew, osocze i mocz w odpowiednich momentach podczas protokołu eksperymentalnego, zgodnie z celami badania. Pobierać także próbki końcowe, w tym płyn płukający oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF), tkankę płucną oraz inne tkanki16,17, zgodnie z celami badania.
      1. Ograniczenie anemii iatrogennej i hipowolemii:
        1. Powoli pobieraj krew (równowartość trzykrotności objętości martwej przestrzeni) do strzykawki, odkładaj na bok i pobieraj wystarczającą objętość do przyszłych badań eksperymentalnych (0,4-1,5 mL)25 , takich jak markery stresu zapalnego i oksydacyjnego. Dostosuj objętości próbek do masy ciała, poziomu hemoglobiny i stabilności prosięta.
          UWAGA: Krew z martwej przestrzeni jest przekazywana zwierzęciu, a linia jest przepłukiwana solą fizjologiczną o co najmniej takiej objętości, jaką pobrano do pobierania próbek krwi (gazy ± krew do przyszłych eksperymentów), aby oczyścić linię krwi, ograniczając możliwe zatkanie się krwi spowodowane zakrzepem.
    7. Rejestruj wszystkie parametry życiowe i parametry wentylacyjne w CRF w regularnych odstępach co 15-30 minut, częściej podczas indukcji znieczulenia i operacji lub jeśli prosiatko jest niestabilne.
    8. Zwracaj uwagę na zmiany w lekach od początku znieczulenia przez cały eksperyment, notując czas rozpoczęcia i zakończenia oraz modyfikacje dawki.
    9. Oceń głębokość znieczulenia, obserwując uszczypanie palca/pasa wieńcowego pod kątem odruchu odstawienia, początkowo z regularną częstotliwością. Po osiągnięciu pełnego rozluźnienia mięśni monitoruj tętno i ciśnienie krwi w celu kontynuowania głębokiej oceny znieczulenia.
    10. Celuj w następujące wartości, jeśli nic innego, przez cały eksperyment: tętno: 120-180 uderzeń na minutę, MAP: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH2O, temperatura ciała: 38-39 °C, poziom glukozy: 4-5 mmol/L, PaCO2: 35-45 mmHg, skoryguj RR (maksymalnie 60 oddechów/min), objętość pływów (VT): 7 mL/kg, dostosuj.

4. Zabieg chirurgiczny (czas: ~30-40 min)

  1. Utrzymuj wentylację podczas operacji.
    1. Utrzymuj RR na poziomie 30 oddechów/min, celuj w VT wydechowy na poziomie 10 mL/kg skorygowanej przez, stały PEEP 6 cmH2O,T insp 0,4 s, a FiO2 na 1,0.
  2. Ustal pole sterylne, wykonując preferowany aseptyczny peeling skóry szyi w celu tracheotomii oraz pachwiny dla dostępu do naczyń udowych, stosując standardowe techniki szorowania.
    1. Wykonaj nacięcie szyi.
      1. Wykonaj nacięcie skóry na szyi skalpelem pomiędzy chrząstką chrząstką a wcięciem mostka (przybliżony rozmiar 10 cm). Użyj przecięcia, aby odizolować tchawicę.
      2. Przełóż dwa 12-calowe wiązki pępowinowe pod tchawicę.
      3. Wykonaj nacięcie o średnicy 5 mm między pierścieniami tchawicowymi a najbardziej przednią częścią tchawicy, tuż poniżej chrząstki chrząstki chrząstki krzywożółtej. Wprowadź rurkę tchawicową (ETT). Pierwszy węzeł zawiąż na tchawicy najbliżej nacięcia.
      4. Napompuj mankiet ETT, delikatnie go schowaj, aż mankiet zostanie zatrzymany przez krawat. Dociągnij pierwszy krawat i zabezpiecz drugi do ETT. Metoda ta zapewnia, że czubek znajduje się powyżej carina, co potwierdza się auskultywacją symetrycznych i obustronnych dźwięków oddechowych.
        UWAGA: Oskrzel prawego płata czaszki powstaje blisko rozgałęzienia tchawicy. Należy uważać na zablokowanie tego oskrzela, jeśli ETT zostanie umieszczone zbyt głęboko. Jeśli wystąpią problemy z wentylacją lub nagłe zmiany, rozważ wyregulowanie rurki. Dziób współczulny i nerwy krtani leżą w tej części szyi. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć stymulacji lub urazu tych nerwów.
    2. Wykonaj nacięcie w pachwinie.
      1. Palpować tętnicę udową, wykonać powierzchowne nacięcie skóry w prawym pachwinie skalpelem (około 8-10 cm).
      2. Użyj przecięcia, aby odizolować tętnicę udową i żyłę.
      3. Przewlecz dwa szwy (3.0 jedwabu) pod każdą tętnicą udową i żyłą, aby je odizolować26. Przygotuj cewniki do założenia.
        1. Dla cewnikowania prawej żyły udowej unieś oba szwy, aby zatkać przepływ krwi. Zwiąż żyłę udową dystansowo od proponowanego miejsca wszczepienia.
          1. Wkładaj cewnik całkowicie, lekko odchylając stylet i przywiązując dystans, aby go zabezpieczyć na miejscu. Zdejmij stylet i przymocuj zestaw przedłużaczy o średnicy 6 cali za pomocą trójstopniowego zaworu zacinającego zaparowanym solą fizjologiczną.
          2. Przed założeniem cewnika odciągnij niewielką ilość krwi, aby zapewnić prawidłowość. Zabezpiecz cewnik w naczyniu za pomocą szwu bliższego, zapobiegając wyślizgowi cewnika.
          3. Przyłącz port wtórny do podawania płynu podtrzymującego i wlewu leków. Podłącz główny port do centralnego ciśnienia żylnego.
        2. Do cewnikowania tętnicy prawej kości udowej należy stosować te same kroki na tętnicy udowej, co na żyłę opisaną w krokach 4.2.2.3.1.1 do 4.2.2.3.1.3.
          1. Przyłącz pierwszy port 3-drożnego zaworu do inwazyjnego monitorowania ciśnienia krwi i usuń nacięcia pachwiny i szyi za pomocą chirurgicznych zszywek.
    3. Wykonaj wszczepienie cewnika pęcherza nadłonowego w celu uzyskania dostępu do moczu.
      1. Pęcherz powierzchownie znajduje się w dolnej części brzucha, nieco na lewo od linii środkowej strzałkowej. Oczyść brzuch techniką aseptyczną.
      2. Wprowadź sterylny cewnik angio-cewnik o masie 18 G (2") równolegle do ściany brzucha, czaszkę do najniższej pary sutków (5-6 cm poniżej pępka), skierowany w stronę pępka, a jedną ręką wywieraj lekki nacisk po obu stronach pęcherza, aby ustabilizować i nieco powiększyć (opcjonalny protokół aspiracji nadłonowej można znaleźć gdzie indziej27).
      3. Gdy przepływ moczu zostanie potwierdzony, przyklej cewnik taśmą do jamy brzusznej, aby umocnić jego położenie. Przymocuj zestaw przedłużenia o dużym przełęcie do cewnika. Umieść dalszy koniec w probówce 50 mL umieszczonej pod zwierzęciem.

5. Stabilizacja i standaryzowana rekrutacja płuc po operacji (Czas: ~30-60 min)

UWAGA: Stabilizacja rozpoczyna się po zakończeniu wszystkich zabiegów chirurgicznych. Odpowiednia głębokość analgezji/znieczulenia jest niezbędna przed rozluźnieniem mięśni, ponieważ zapewnia, że parametry życiowe, takie jak MAP i tętno, są w normie i nie występują odruchy odstawienia. MAP i tętno będą monitorowane na bieżąco przez cały protokół, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.

  1. Podaj bolus rokuronia (0,3 mg/kg) dożylnie (przez dostęp do żyły uchowej D5W) i rozpocznij ciągłą infuzję rokuronia (5,5 mg/kg/h) w celu rozluźnienia mięśni przed manewrem rekrutacji płuc. Infuzja ta będzie kontynuowana przez cały czas trwania eksperymentu, aby ustandaryzować procedurę płukania i zapobiec asynchronii z respiratorem.
  2. Wykonaj ustandaryzowany manewr rekrutacji płuc.
    1. Stopniowe zwiększanie PEEP: zaczynamy od PEEP 6 cmH2O, zwiększając o 1 cmH2O co minutę, aż osiągniemy PEEP 10 cmH2O. Dostosuj, aby utrzymać VT na poziomie 10 mL/kg.
    2. Pozostań na PEEP 10 cmH2O przez 2 minuty, po czym powrót do PEEP 6 cmH2O w odwrotny sposób (jak w kroku 5.2.1), utrzymując VT 10 mL/kg.
    3. Gdy stan jest stabilny przy VT 10 mL/kg na PEEP 6 cmH2O, zapisz ustawienia oddechowe, parametry fizjologiczne i pobierz gazopomiar tętnicze (punkt czasowy VT 10 mL/kg na CRF).
      1. Upewnij się, żePaO2 wynosi >400 mmHg (oczekiwana odpowiedź na hiperoksję u zwierzęcia z zdrowymi płucami). FiO2 1.0 jest stosowane w początkowych fazach eksperymentu, aby zapewnić odpowiednią odpowiedź na hiperoksję jako kryterium włączenia.
      2. Jeśli nie zostanie to osiągnięte:
        1. Sprawdź położenie rurki tchawicowej, ustawienia respiratora, podawanie tlenu oraz prawidłową technikę pobierania krwi. Powtórz manewr rekrutacji płuc raz, aby zapewnić prawidłową rekrutację.
        2. Jeśli nadal nie będzie poprawy, należy wykluczyć zwierzę i natychmiast je uśpić (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi) ze względu na potencjalny wewnętrzny problem płuc (niezdrowe płuca spowodowane wcześniejszą ekspozycją nieeksperymentalną – czyli na farmie).
      3. Reguluj RR, aby utrzymać PaCO2 w zakresie 35-45 mmHg.
      4. Obniż, aby osiągnąć VT 7 mL/kg, utrzymując FiO2 1.0 i PEEP 6 cmH2O.
      5. Po stabilizacji należy zapisywać punktowe odczyty bazowe VT 7 mL/kg na arkuszu CRF z parametrami fizjologicznymi i próbkami, w tym gazami tętniczymi i żylnymi. Stabilizacja obejmuje parametry życiowe, jak w krokach 3.2.10, oraz wartości gazów we krwi: PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 mmol/L.

6. Wentylacja dla zwierząt kontrolnych

  1. Stosuj wentylację kontrolowaną objętością z objętością pływową 7 mL/kg, PEEP 6 cmH2O oraz FiO2 1,0. Nie wywołuj uszkodzeń płuc u zwierząt kontrolnych (tzn. nie wykonuj usuwania powierzchniowo czynnych ani instylacji endotoksyny).
  2. Kontynuuj wentylację przez około 90 minut, aby dopasować się do średniego czasu potrzebnego do wywołania uszkodzenia płuc u zwierząt doświadczalnych (patrz krok 7 i rysunek 1). Po tym okresie przejdź bezpośrednio do kroku 10.

7. Wywołanie ostrego urazu płuc (model wielouderzeniowy)

  1. Wykonaj wyczerpanie powierzchniowo czynnych (Czas: 1-2 godziny)
    1. Przed rozpoczęciem płukania płuc włącz aparat ssący i upewnij się, że jest gotowy do użycia. Umieść wiadro z płukaniem na miejscu. Umieść podkładki chłonne pod głową zwierzęcia i pod stołem chirurgicznym, aby wychwycić cały płyn wyciekły i odzyskany podczas płukania.
      1. Waż podpaski przed i po płukaniu. Ustaw respirator na PEEP 5 cmH2O, 25 cmH2O, RR 25/min oraz FiO2 1.0. Utrzymuj te regulacjonowane ciśnienie ustawienia wentylacyjne przez cały proces płukania. Spodziewaj się, że VT spadnie o około 35%-45% podczas pełnego płukania.
    2. Odłącz obwód wentylacyjny od ETT i podłącz urządzenie lejka płukającego (patrz Plik Uzupełniający 1).
    3. Wprowadź do płuc 30 mL/kg ciepłej soli izotonicznej (NS), delikatnie wlewając NS do lejka umieszczonego około 30 cm nad prosiakiem.
    4. Masuj klatkę piersiową, naciskając obustronnie na boczną stronę, aby uzyskać mechaniczne "ściskanie". Pomagaj przeprowadzić sól fizjologiczną do płuc i krążyć ją w aparacie płuczącym. Pozwól sobie 2-3 sekundy między masażami.
      UWAGA: Unikaj masowania zbyt szybko lub zbyt powoli, aby zapobiec niewystarczającemu usuwaniu powierzchniowo czynnego lub upośledzeniu powrotu żylnego. Nie przekraczaj 30 sekund na jeden nabój płukania.
      1. Usuwaj płyn płukający, opuszczając lejek poniżej prosiatka. Lekko odłącz lejek od ETT, aby płyn mógł odpłynąć do wiadra zbierającego na podłodze.
      2. Wykonuj aktywne ssanie nie dłużej niż 10 sekund. Wprowadź cewnik ssący do ETT podczas kontynuacji masażu klatki piersiowej, aby ułatwić odpływ płynów. Monitoruj MAP i tętno, a jeśli którykolwiek z parametrów znacząco spadnie, przyłącz wentylację wcześniej.
      3. Podłącz ponownie obwód wentylacyjny. Jeśli nadmiar płynu pozostaje w ETT, wykonaj drugie ssanie.
    5. Pozwól prosiakowi odpoczywać co najmniej 3 minuty między cyklami płukania, aby zmniejszyć stres i ryzyko nietolerancji.
    6. Rozpocznij kolejną rundę lawowania, gdy SpO2 wróci do 100%. JeśliSpO 2 nie wróci do 100%, sprawdź PaO2przez gazy krwi po ustabilizowaniu sięSpO 2
      1. Jeśli PaO2 >100 mmHg – powtórz płukania płuc (kroki 7.1.2-7.1.6).
      2. Jeśli PaO2 <100 mmHg – poczekaj 15 minut, utrzymując wentylację płukania, a następnie powtórz analizę gazometryki we krwi.
      3. Jeśli PaO2 >100 mmHg – kontynuuj płukanie i przejdź do kroku 7.1.6, aby ponownie ocenić zakres urazu.
    7. Potwierdzenie, że uszkodzenie spowodowane wyczerpaniem powierzchniowo czynnym osiąga się, gdy PaO2 pozostaje <100 mmHg przez 15 minut. Zatrzymaj płukanie i przejdź do kolejnego kroku.
  2. Wprowadź endotoksynę śródtchawicową (Czas: 15 min)
    1. Przygotuj lipopolisacharyd (LPS) z Escherichia coli (1,5 mg/kg) poprzez rozcieńczenie w NS do objętości 2 mL w strzykawce o pojemności 3 mL.
      UWAGA: Dobrać odpowiedni szczep i dawkę, uwzględniając potencjalne zmienności efektów zależne od szczepu.
    2. Odczekaj 15 minut po ostatnim płukaniu płuc, a następnie wszczep LPS wewnątrztchawicowo (IT) z prosiakiem leżącym na plecach.
    3. Poprawa jednorodnego rozkładu LPS w płucach niedwinnych wykonując następujące kroki:
      1. Zamień standardowy koniec ETT na adapter portu Y, aby umożliwić jednoczesną wentylację i podanie LPS przez cewnik przez boczny port z zaworami.
      2. Stosuj PEEP 10 cmH2O przez 1 minutę. Dostosuj, aby utrzymać VT na poziomie 7 mL/kg i ustaw RR na 40 oddechów na minutę.
      3. Włóż cewnik przez boczny port do ETT na głębokość z wymierzoną głębią, tak aby końcówka wychodziła 1-2 mm poza ETT.
      4. Wstrzyknij LPS przez cewnik. Przepłukaj cewnik 1 mL NS, a następnie podaj 9 mL bolus powietrza, aby zapewnić pełne podanie.
      5. Wyjmij cewnik i zamknij boczny port.
      6. Kontynuuj wentylację PEEP 10 cmH2O(dostosuj, aby utrzymać VT 7 mL/kg) przez 3 minuty po podaniu LPS.
      7. Odłącz obwód respiratora od ETT na 30 sekund, aby odwrócić ewentualną niezamierzoną rekrutację tkanki płucnej.
      8. Podczas odłączenia dostosuj ustawienia respiratora do FiO2 0,5, PEEP 6 cmH2O, utrzymując VT 7 mL/kg oraz zwiększ RR do 40-60 oddechów/min, aby uzyskać PaCO2 na poziomie 35-45 mmHg.
      9. Po ustabilizowaniu VT na poziomie 7 mL/kg, należy zapisać pomiary fizjologiczne punktu 0 godzin i wypełnić arkusz CRF. Dostosuj RR na podstawie PaCO2 z analizy gazów we krwi.

8. Wentylacja podczas okresu obserwacji (Czas: ~6 h)

  1. Przełącz na wentylację kontrolowaną objętością z FiO2 na 0,5 i PEEP na 6 cmH2O. Dostosuj w razie potrzeby, aby utrzymać VT na poziomie 7 mL/kg (nie ustawiaj maksymalnego). Dostosuj RR do maksymalnie 60 oddechów na minutę, aby utrzymać normalne PaCO2.
  2. Stosuj godzinne pomiary gazów we krwi, aby kierować korektami RR w dalszej części eksperymentu. Stale dostosowuj, aby utrzymać VT na poziomie 7 mL/kg.
  3. Stosuj te parametry wentylacji równomiernie zarówno do zwierząt kontrolnych, jak i wielorazowych przez cały 6-godzinny okres obserwacji (patrz Rysunek 1).

9. Procedura leczenia – opcjonalna (Czas: ~10-20 min)

  1. W przypadku potencjalnych badań interwencyjnych należy podać środek terapeutyczny metodą klinicznie istotną, taką jak dookolotna (IT), dożylna (IV), podskórna, domięśniowa lub donastopowska. Wybierz termin leczenia na podstawie projektu eksperymentalnego. Jeśli nie podają się leczenia, przejdź do kroku 10. Przykład administracji IT przedstawiono poniżej:
    1. Ustaw prosiaczka w pozycji lewej po boku.
    2. Utrzymuj PEEP na poziomie 6 cmH2O. Dostosuj, aby uzyskać VT na poziomie 7 mL/kg.
    3. Włóż cewnik do bocznego portu z zaworem na ustaloną długość (zgodnie z krokiem 7.2.3.3). Podawaj połowę zamierzonej dawki lub objętości interwencji. Następnie podano bolus 1 mL NS i 9 mL powietrza. Ogranicz całkowitą objętość do 2,5 mL/kg, aby zminimalizować ryzyko zatkania wentylacji po podaniu bolusu.
    4. Uszczelnij boczny port z zaworami zaślepnikiem zakrętką, aby zapobiec przecieku wentylacji.
    5. Przestaw prosiaczka do lewego bocznego leżenia i powtarzaj kroki 9.1.3-9.1.4.
    6. Wróć prosiaczka do pozycji leżącej. Dostosuj, aby utrzymać VT na poziomie 7 mL/kg.
    7. Kontynuuj wentylację zgodnie z krokiem 8.

10. Eutanazja i zakończenie eksperymentu

  1. Wykonaj ostateczne zapisy fizjologiczne i pobranie próbek po 6 godzinach wentylacji w trakcie okresu obserwacji (krok 8).
  2. Uśpienie zwierzęcia podano dożylnie 120 mg/kg Pentobarbitalu sodu (240 mg/mL) w bolusie (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  3. Zapewnij śmierć zwierzęcia bez oznak życiowych (tętno, ciśnienie krwi i oddychanie). Auskultytuj na brak tętna i dźwięków oddechowych stetoskopem potwierdzającym śmierć. Śmierć potwierdza się także końcowym pobraniem tkanek serca i płuc.
  4. Zbieranie próbek tkanek i płynów ustrojowych do dalszej analizy biochemicznej, molekularnej i/lub histologicznej 14,17 do przyszłych eksperymentów.
  5. Zapisz wszystkie dane w sprzęcie monitorującym i respiratorze, upewnij się, że kopie zapasowe są przesyłane na lokalny i współdzielony dysk oraz wyłącz cały sprzęt.
  6. Utylizuj wszystkie ostre przedmioty i materiały biologicznie niebezpieczne zgodnie z wytycznymi lokalnych przepisów.
  7. Czyść wszystkie powierzchnie preferowanym środkiem antyseptycznym.
  8. Umyj wszystkie instrumenty i pozostawij do wyschnięcia na noc.

Wyniki

Punkty końcowe tego modelu są zgodne z kryteriami Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej dla ALI (minimum 3 z 4), które obejmują fizjologiczne, histologiczne, zapalne oraz zmiany bariery naczyniowa-pęcherzykowo-naczyniowatej16,17. Dodatkowe punkty końcowe mogą być uwzględniane w zależności od badania oraz według uznania każdej grupy badawczej chcącej wdrożyć ten model. Umiarkowane uszkodzenie płuc definiuje się jako stosunek częściowego udziału tlenu we krwi tętniczej do udziału tlenu wdechowanego (PaO2/FiO2, znany również jako stosunek P/F) < 200 mmHg, a ciężkiego < 100 mmHg17. Indeks tlenu (OI) oblicza się według następującego wzoru: OI = (średnie ciśnienie w drogach oddechowych (mAWP) * %O2)/PaO 2, a wartości od 8 do 16 klasyfikuje się jako umiarkowane urazy28. W porównaniu z grupą kontrolną, zwierzęta z wieloma uderzeniami wykazywały poważne do umiarkowane uszkodzenia płuc z powodu obniżonego indeksu tlenowania, stosunku P/F oraz obniżonej podatności układu oddechowego (Rysunek 2). Wyraźne oznaki urazu histologicznego były widoczne przy wyniku 5-modalnego histologicznego uszkodzenia płuc16,17 (Rysunek 3), z napływem neutrofilów do przestrzeni pęcherzykowej i śródmiąższowej, białkowymi zanieczyszczeniami wypełniającymi przestrzenie powietrzne oraz pogrubieniem przegrody pęcherzykowej pęcherzyka. Napływ neutrofili do BALF wskazuje na procesy zapalne wraz ze zwiększonym poziomem cytokiny IL-6 w tkance płucnej (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ostrego uszkodzenia płuc u noworodkowych prosięt. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Umiarkowany do ciężki ALI obserwuje się po urazie wielokrotnym zagranym przedstawionym w tym protokole. (A,B) W modelu wielouderzeniowym przedstawionym tutaj (czerwona linia) w porównaniu z kontrolną (niebieska linia) uzyskuje się podwyższony indeks tlenowania (między 8-12) i niski stosunek PaO2/FiO 2 (P/F) w porównaniu do grupy kontrolnej (niebieska linia), co odpowiada umiarkowanym do ciężkiego uszkodzenia płuc. (C) Funkcja płuc jest upośledzona u zwierząt z wieloma uderzeniami, co tutaj wykazano jako >50% spadek zgodności układu oddechowego. Liczba zwierząt (N): kontrolna (N = 5) oraz wielorazowa (szczep LPS O55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Wszystkie użyte wartości oznaczają ± SD. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-3
Rysunek 3: Model ALI z wieloma uderzeniami wykazuje heterogeniczne uszkodzenie histologiczne. (A,B) Obserwuje się makroskopowe dowody na fragmentaryczne uszkodzenie płuca, które preferencyjnie wpływa na tylną centralną część płuca wielouderzeniowego. (C,D) Reprezentatywne obrazy (100x) przekrojów płuc barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) pokazujące napływ neutrofilowy w przestrzeni pęcherzykowej i śródmiąższowej oraz pogrubienie pęcherzyka i przegrody w płucu wielouderzeniowym. (E,F) Reprezentatywne obrazy (400x) przekrojów płuc barwionych H&E podkreślają upośledzenie integralności strukturalnej, infiltrację neutrofilową oraz osadzanie się zanieczyszczeń w przestrzeni pęcherzyka płucnego wielouderzeniowego. Niebieskie kwadraty oznaczają powiększony obszar w (E,F). pasek na skali oznacza 100 mm (C,D) i 50 mm (E,F). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Model wielokrotnych uderzeń pokazuje odpowiedź zapalną po ALI. (A) Napływ neutrofilów z neutrofilami sięgającym ponad 75% udziałów wszystkich komórek w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym (BALF) 6 godzin po wywołanym urazie płuc (wielokrotne uderzenia) w porównaniu do zwierząt kontrolnych. (B) Prozapalna cytokyna IL-6 jest podwyższona w płynie płuczącym oskrzelowo-pęcherzykowym (BALF) oraz (C) tkance płucnej 6 godzin po indukowanym ALI. Liczba zwierząt (N) zmienia się w zależności od dostępnego materiału w momencie analizy. Dla BALF (B) zastosowano enzymatyczny test immunosorbentny, natomiast dla tkanki płucnej (C) zastosowano technologię multipleksowego laserowego kulki. Wszystkie wartości są oznaczone jako średnie ± SD. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Formularz monitorowania przypadku dla modelu ostrego urazu płuc noworodkowego prosiętka. Kliknij tutaj, aby pobrać tę fotografię.

Dyskusja

Model ALI dla noworodków obejmuje model wielohitowy, obejmujący płukanie płuc w celu usunięcia surfaktantów (naśladując zespół niedoboru oddechowego prowadzący do atelectotraumy), wysoką ekspozycję na tlen (prowadzącą do powstawania reaktywnych form tlenu), wentylację mechaniczną (baro/volu-trauma), a także podawanie LPS jako bodziec zapalny, odzwierciedlając różne składniki uważane za zaangażowane w patogenezę BPD u wcześniaków2. Podczas procesu wyczerpywania powierzchniowo czynnego dochodzi do celowego wzrostu ciśnienia i tlenu, co przyczynia się do urazu. Ekspozycja na hiperoksję przy FiO2 1.0 trwa około 3 godzin, a wysokie ciśnienie jest dodawane przez około 90 minut podczas fazy wywołanego uszkodzenia płuc (płukanie wyczerpaniem powierzchniowo czynnym i instalacja endotoksyny). Wysoki poziom tlenu podczas resuscytacji (wysoki FiO2 0,9 vs. niski FiO2 0,3) u wcześniaków bardzo wcześniaków powodował wyższy stres oksydacyjny i stan zapalny, przy ekspozycji na hiperoksję krótszą niż 1 godzinę29. Po wyczerpaniu powierzchniowo czynnych w modelu prosiatka płuca ulegają zapadaniu się/co prowadzi do niedobrotowej atelectazy, a zdolność do utrzymania przechodności pęcherzyka jest zmniejszona w celu odpowiedniej wentylacji i natlenienia. W związku z tym, mimo że ustawienia są obniżone w okresie obserwacji, usunięcie powierzchniowo czynnego powoduje konieczność stosowania wyższego ciśnienia, aby osiągnąć objętość pływową 7 mL/kg. Płuca będą w stanie produkować surfaktant z upływem czasu, a zakres trwającego procesu szkodliwego może się z czasem zmniejszać. Jednak ten nowy model noworodkowego prosiatka ALI wykazuje niewielką regenerację (Rysunek 2) funkcji płuc (zgodność) i natlenienia (stosunek PF) podczas okresu obserwacji przez 6 godzin po wywołanym urazie płuc. Model ten bardzo przypomina najczęstsze początkowe warunki poporodowe, z jakimi borykają się bardzo wcześniaki, co czyni go bardzo istotnym dla wysiłków translacyjnych. Model ten powoduje umiarkowane (100-200 mmHg) do ciężkiego (<100 mmHg) ostre uszkodzenie płuc, definiowane przez stosunek P/F28. Efekt LPS przy stanie zapalnym osiąga szczyt w ciągu 1 do 2 godzin po urazie30 godzin. Model ten może być wykorzystywany jako fundament, którym inne grupy mogą manipulować poprzez zmianę długości obserwacji lub leczenia dostosowanego do ich programu badawczego.

Kluczowe kroki w protokole

Pomimo priorytetowego traktowania dostępności, ten model dużych zwierząt pozostaje złożony, wymagając wysoko wykwalifikowanego zespołu współpracy, aby doprowadzić eksperyment do końca. W protokole są kluczowe etapy wymagające dodatkowej ostrożności. Te kwestie są kluczowe dla zapewnienia sukcesu tego złożonego ramowego eksperymentu.

Transport zwierzęcia

Wczesne odłączenie od matki ma być dla zwierzęcia niezwykle stresującym okresem, co może prowadzić do niemożności utrzymania stabilności sercowo-naczyniowej i możliwej śmierci podczas transportu. Jednak protokół transportu (patrz krok 3) przedstawiony tutaj pozwalał na bardzo spokojne zwierzęta (niektóre nawet zasypiały), pozwalając na pełne eksperymenty. Chociaż trudno jest jednoznacznie zalecić maksymalny czas transportu, prosięta były w stanie komfortowo wytrzymać transport trwający około 60 minut, według naszego doświadczenia.

Optymalizacja wentylacji

Respirator musi być ustawiony tak, aby kompensować zgodność obwodu i zapewnić pełną objętość pływową do płuc. Jest to szczególnie istotne podczas wyczerpania powierzchniowo czynnego, ponieważ prosiatko może stać się hemodynamicznie niestabilne, jeśli objętość pływowa zostanie utracona w obwodzie. Naukowcy muszą potwierdzić, że dostępny respirator pozwoli na odpowiednią dawkę objętości pływowej dla noworodka. Respiratory dla dorosłych często nie są w stanie osiągnąć odpowiednich objętości pływów noworodków. stosuje się do utrzymania wartości objętości wydechowej pływów (7 mL/kg stosowane w tym protokole, jak wcześniej opisali inni 14,19,20,21,31,32, z wyjątkiem płukania płuc - patrz następna sekcja). Ustandaryzowane zastosowanie adaptera rurki endotracowej z bocznym portem zaworowym podczas podawania LPS lub w jakimkolwiek leczeniu IT pozwala utrzymać ciśnienie w drogach oddechowych poprzez unikanie odłączenia od obwodu wentylacyjnego.

Standaryzowana strategia rekrutacji płuc po operacji

Niedróba może rozwijać się w płucach prosiaków podczas etapu przygotowawczego i chirurgicznego. Po rozluźnieniu mięśni wykonano33 manewry "rekrutacji płuc", aby zapewnić prawidłowe napowietrzanie płuc. Po manewrze rekrutacyjnym oczekuje się, że ciśnienie częściowe tlenu we krwi tętniczej przekroczy 400 mmHg, biorąc pod uwagę prawidłową odpowiedź hiperoksyczną w zdrowych, otwartych płucach. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, badacz musi rozważyć, czy płuca nie zostały odpowiednio zrekrutowane z powodu nieoptymalizowanych warunków eksperymentalnych, czy też czy prosiatko może mieć istniejącą wcześniej chorobę (na przykład, jeśli prosięcie pochodzi z farmy, gdzie mogą wystąpić nieznane ekspozycje). Protokół pozwala przetestować pierwsze wyjaśnienie poprzez ponowne uruchomienie manewru rekrutacyjnego, aby sprawdzić, czy można osiągnąć ten cel. Jeśli po raz drugi nie osiągnie 400 mmHg PaO2, należy rozważyć wykluczenie zwierzęcia jako stan istniejący wcześniej, który mógłby niewłaściwie wpłynąć na wyniki eksperymentalne.

Wystarczająca ilość płynów i homeostaza metaboliczna są niezwykle ważne

To ograniczy ważne skutki zakłócające związane ze słabym nawodnieniem i kontrolą metaboliczną. Te nowo narodzone prosięta, zwykle rodzone w dużym miocie, nie wszystkie mają podobną możliwość karmienia. W związku z tym mogą być narażone na pewien poziom odwodnienia poporodowego przed użyciem w eksperymencie. Całkowite spożycie płynów na poziomie 5-8 mL/kg/h wystarczy, aby utrzymać dobrą objętość wewnątrznaczyniową14,34. Zapewnienie kontroli metabolicznej odbywa się przy utrzymaniu poziomu glukozy we krwi w zakresie 4-5 mmol/L (normalny zakres fizjologiczny dla nowo narodzonych prośi35,36). Wysoki poziom mleczanu we krwi to kolejne określenie używane do niskiego dostarczania tlenu i może być odzwierciedlać niski stan płynu wewnątrznaczyniowego przed niedotleniem. Odpowiednia ilość płynów i dobrze nawodnione zwierzę wytrzymują płukania wyczerpanego surowca czynnego ze stabilnością sercowo-naczyniową i nie powodują ciężkiej kwasicości. Wartości referencyjne hemoglobiny i innych parametrów biochemicznych różnią się w zależności od wieku i gatunku37,38. Niższa hemoglobina może wpływać na natlenienie, które wymaga optymalnego i zachowawczego pobierania krwi39,40. Każde pobranie krwi jest rekompensowane równą ilością NS. Do stosowania odpowiedniego cyklu płynów stosowano poziomy elektrolitów we krwi, moczniku i kreatyniny.

Zapewnienie odpowiedniego czasu na regenerację podczas zabiegu płukania płuc

Podczas płukania płuc potrzebne jest ważne okno rekonwalescencji trwające co najmniej 3-5 minut między każdym płukaniem, aby umożliwić prawidłowy powrót żylny i uniknąć niebezpiecznego zatkania wątroby41, krwotoku wątrobowego oraz niewydolności prawego serca. Zjawisko to zaobserwowano u kilku zwierząt w ramach eksperymentalnej kohorty. Właściwe i proaktywne zarządzanie płynami jest niezbędne do utrzymania stabilności klinicznej. Tworząc niewielkie środowisko intensywnej terapii dla tego modelu prosiatka, kluczowe jest posiadanie klinicysty, neonatologa lub starszego technika weterynaryjnego, który może ułatwić przekazywanie wiedzy członkom zespołu, aby rozpoznać ważne sytuacje i ich plany awaryjne.

Zalecane rozwiązania problemu

Prosiaczko będzie poddawane znieczuleniu ogólnemu i analgezji przez cały czas trwania operacji i eksperymentów. Jedna osoba jest zaangażowana w monitorowanie prosiaczka przez cały eksperyment. Każde zwierzę różni się wrażliwością i reakcją na środki znieczulającye. Monitorowanie stanu zwierzęcia bezpośrednio po podaniu znieczulenia za pomocą pomiarów życiowych i godzinowych gazów jest kluczowe. Dostarczy informacji o poziomie znieczulenia i stabilności metabolycznej, a także o ocenie fizykalnej w razie potrzeby. Istnieje zmienność liczby płukań płuc (od 6 do 20), a tym samym czasu (od 28 do 115 min), potrzebnego do osiągnięcia wyczerpania powierzchniowo czynnego.

Potencjalne problemy i rozwiązania podczas indukcji, stabilizacji i operacji znieczulenia: (1) Jeśli pojawi się bezdech, należy wyłączyć gaz znieczulający i wspierać oddychanie respiratorem w formie maski do czasu powrotu spontanicznego oddychania. (2) Jeśli występują objawy hipowolemii spowodowane wysokim tętnem, niskim MAP lub niskim CVP, należy podać płyn o ilości 10 mL/kg NS oraz rozważyć zwiększone spożycie płynu podtrzymującego (UP). (3) Gdy niedociśnienie ze spadkiem MAP do 30-40 mmHg nie ustępuje po podaniu płynów, należy zmniejszyć lub zatrzymać pompy znieczulone, a oznaki perfuzji i niedociśnienia ponownie oceniać po 10-15 minutach. Analiza gazometryki krwi pod kątem poziomu hemoglobiny w celu oceny możliwego krwawienia wewnętrznego. (4) Jeśli objawy oddechowe wskazują na odmę opłucnową (ostre desaturowanie lub bradykardia >20%), prosiatko jest natychmiast uśpione.

Ograniczenia

Model przedstawiony tutaj przedstawia krótkoterminowe (6 godzin) ALI noworodka w modelu dużego zwierzęcia. Przewlekłość urazów prowadzących do BPD jest ważnym czynnikiem do rozważenia. Model ten może nie w pełni oddawać tego aspektu patogenezy, a dane informujące o postępie urazu płuc po 6 godzinach pozostają nieokreślone. Niemniej jednak spójność tego modelu stanowi solidną podstawę do dalszego rozwoju (wydłużenie długości i modyfikacja protokołu), umożliwiając wszechstronność grupom badawczym, które go wdrożą. Pomimo nacisku na dostępność i wykonalność tego modelu dużego zwierzęcia podczas jego powstawania, niezbędne są konkretne umiejętności, aby eksperyment przebiegł sprawnie. Wiedza kliniczna z solidnymi podstawami fizjologii oraz wiedzą pozwalającą radzić sobie z szybkimi zmianami/pogorszeniem za pomocą leków, infuzji itp. jest niezbędna do wdrożenia i pomyślnego zakończenia we wczesnych fazach. Ten zestaw umiejętności można następnie przekazać członkom zespołu w celu dalszego utrzymania modelu przez dłuższy czas. Dodatkowo, zespół złożony z technika weterynaryjnego, techników laboratoryjnych oraz starszych doktorantów, z którym nawiązano silną komunikację i współpracę, może zapewnić odpowiednie pokrycie wszystkich elementów każdego eksperymentu. Oczekuje się, że co najmniej trzech członków zespołu będzie potrzebnych do przeprowadzenia eksperymentu od początku do końca, gdy workflow zostanie zoptymalizowany.

Znaczenie i potencjalne zastosowanie

Tłumaczenie kliniczne opiera się na solidnych badaniach podstawowych na poziomie przedklinicznym. Jednak wiele badań klinicznych kończy się niepowodzeniem z powodu niezgodności między modelem przedklinicznym a fizjologią człowieka, co podkreśla znaczenie blisko spokrewnionych modeli dużych zwierząt w wzmacnianiu potencjału translacyjnego. Stworzenie nowego modelu noworodkowego prosięta urazu płuc jest kluczowe dla lepszego zrozumienia wczesnych zdarzeń patogennych, tworząc sprzyjające warunki rozwojowi BPD w ludzkim przedwczesnym płucu. Model przedstawiony tutaj odtwarza ważne aspekty środowiska intensywnej terapii (hiperoksję, wentylację pod wysokim ciśnieniem oraz brak surfaktantu) dla wcześniaków w pierwszych dniach życia, co jest ściśle modelowane. Ten wszechstronny, nowy model wielouderzeniowy noworodkowych prosiętek dostarczy nieocenionych informacji o wczesnych procesach patogennych z BPD, poszerza wiedzę o kandydatach terapeutycznych oraz optymalizuje ich dostarczanie terapii dla skutecznej translacji klinicznej. Będzie to doskonały wektor współpracy, sprzyjając ramom testowania hipotez dla badań dowodzących koncepcję od bezpieczeństwa po skuteczność oraz generowanie wiedzy. Stanowiąc podstawę przyszłych badań, model ten znacząco przyczyni się do rozwoju klinicznych działań translacyjnych w przypadku ostrych urazów płuc obserwowanych u wcześniaków.

Oświadczenia

Wszyscy inni autorzy nie mają konkurujących interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Martinowi Postowi ze Szpitala dla Chorych Dzieci w Toronto, który hojnie pożyczył nam respirator noworodkowy używany przez cały ten projekt. Dziękujemy również Danowi DeVette i jego zespołowi z Animal Care and Veterinary Service, Heart Institute, University of Ottawa, za wszelką pomoc podczas rozwoju tego modelu. Prace te były wspierane przez fundusz innowacji CHAMO CHEO, Sieć Komórek Macierzystych, stowarzyszenie księżniczki Lovisy [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], Fundację Davida i Astrid Hagelén oraz Szwedzką Fundację Serca i Płuc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ostrze skalpela #10Nacięcie skóry
1 ml strzykawkiBectonDicksonBD309659Slip tip 
Strzykawki 10 mlBectonDicksonBD302995Płukanie strzykawek na tętnice i żyły
18 g angiocewnika & nbsp;InsyteKanylacja pęcherza moczowego
Strzykawki po 20 mlBectonDicksonBD302830Bolus płynu, jeśli jest potrzebny
22 g igieł do strzykówBectonDicksonStrzykawka do uzupełnienia
Angiocewniki 24 GInsyte160465Dostęp do ucha IV oraz tętnica udowa i żyła
25 g igieł do strzykawkiBectonDicksonIntramuskularne (IM) zastrzyki bupenorfiny
3 ml strzykawekBectonDicksonIniekcja leków i monitorowanie usuwania martwej przestrzeni linii
Jedwabne krawaty 3-0EthiconA304HUżywany do zabezpieczania cewników tętnicowych i żylnych
Zawory czterokierunkoweDiscofix, BraunD500456020podłączone do przewodów płynów i monitorujących do płukania i pobierania próbek
Zestaw przedłużaczy 6"Technologie infuzji SAIExt-6podłączone do dożylnych/tętnicowych linii 
Zestaw przedłużaczy 60"BBV6223Linie infuzyjne leku
Adapter dostępu AirLife Neo-Verso Y do rurek endotchealnychVyaireCSC300Służył do podawania materiału wewnątrztrachealnego
Bupenorfina, 0,3 mg/mLCDMV128140Bolus domięśniowy jako środek przeciwbólowy
Dekstroza, 5%BaxterJB0063Utrzymanie poziomu glukozy we krwi
Zasłony jednorazowe3M3M1050Sterylne zasłony polowe
Elektrody EKG3M220790Elektrody jednorazowego użytku do EKG
Cewnik do podania cewnika z rurki tchawicowej (ETT)
Rurka tchawicowa 3,5 Teleflex5-10107Stosowany do tracheostomii
Epinefryna, 1 mg/mLHospira07541L01Rozcieńczony sterylną solą fizjologiczną do 0,1 mg/mL w celu resuscytacji, jeśli zajdzie taka potrzeba
Analizator gazów we krwi Epoc Simens10736398System analizy krwi epoc z gospodarzem NXS
Przykładowe karty EpocSimensBD309659Wkłady gazowe z krwią
Formalina, 10% buforowanaFisher ScientificSF100-4Fiksacja płuc
Poduszka grzewczaKent ScientificTPZ-814EAKoc cyrkulacyjny z wodą
Pompy dożylne (dożylne) x 3Sigma AldrichZ401358Wlew ketaminy/propofolu i rokuronia
Ketamina, 10 mg/mLWetochinol112170Ciągła infuzja (rozcieńczona bezpłodną solą fizjologiczną) w pompce strzykawkowej w celu utrzymania znieczulenia  
Ketamina, 100 mg/mLWetochinol112170Używany jako bolus do indukcji znieczulenia ogólnego oraz pompa strzykawkowa do utrzymania znieczulenia itd.;
Dzwoniki laktacyjneBaxterJB2323Utrzymanie objętości krwi
Sprzęt płukający: lejek, złącze 3-drożne, złącze ETT, rura 4 stopyN/aN/aDomowej roboty rurki do płukania
Lipopolisacharyd, LPS (O55:B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mgUraz płuc po drugim uderzeniu
MR850 Nawilżacz oddechowyFisher i PaykelMR850JXX*
Pentobarbital sodowy (euthanyl), 240 mg/mLWetochinol381Bolus dożylny do humanitarnej eutanazji
Przetwornik ciśnieniaMcCarthy Zapasy WeterynariańskieV6402dla ciśnienia tętnic/żył na Surgivet
Propofol, 10 mg/mLUżywany jako bolus do indukcji znieczulenia ogólnego oraz pompa strzykawkowa do utrzymania znieczulenia itd.;
PulsoksymetrMaismoNEOPT-500
Rokuronium, 10 mg/mLAuropharma2498820Stosowany po operacji i przed rozpoczęciem indukcji urazu płuc, po czym następuje ciągła infuzja
Sól fizjologiczna, 0,9%BaxterJB1324Płukanie linii krwi i reanimacja objętości krwi
Woda sterylnaN/aN/aDla nawilżacza powietrza
cewnik ssący 10 CH/25 cmMediplast608810251Stosowane do płukania płata płucnego oskrzelowo-pęcheolowego
cewnik ssący 6 CH/40 cmMediplast60880640Usuń nadmiar soli fizjologicznej podczas płukania
Narzędzia chirurgiczne: uchwyt skalpela, kleszcze przeciwkomarowe, kleszcze do kciuka, nożyczki Metzenbauma, zszywki, nożyczki chirurgiczne, retraktory, gaza, misa ze stali nierdzewnejN/AN/APakiet chirurgiczny autoklawowany
Surgivet: mankiet NIBP, sonda temperatury,   2x inwazyjne ciśnienie, EKG, pulsoksymetrMcCarthy Zapasy Weterynariańskiev9203zawiera: nieinwazyjny mankiet do pomiaru ciśnienia krwi (NIBP), termometr, 2x inwazyjne ciśnienie krwi (BP), elektrokardiografię (EKG) oraz pulsoksymetr
Pompy strzykawkowe x 3Pompy znieczulające
Taśmazabezpieczenie kłuków wenkłutowych do ucha
Taśma umblikalnaEthiconzabezpiecza rurkę tchawicową wewnątrz tchawicy
Respirator (Servo-I)GetingePotrzebne są ustawienia noworodkowe dla odpowiedniej objętości pływów
Obwód wentylacyjnyFisher i PaykelRT265z nawilżaczem powietrza
Zacisk zamykający rurkę vorseN/aN/aZamyka rurki podczas płukania

Bibliografia

  1. Perin, J., et al. regional, and national causes of under-5 mortality in 2000-19: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet Child Adolesc Health. 6 (2), 106-115 (2022).
  2. Thebaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  3. Demauro, S. B., et al. Early motor development in infants with moderate or severe bronchopulmonary dysplasia. J Neonatal Perinatal Med. 15 (1), 55-62 (2022).
  4. Augustine, S., et al. Mesenchymal stromal cell therapy in bronchopulmonary dysplasia: Systematic review and meta-analysis of preclinical studies. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2079-2093 (2017).
  5. Contopoulos-Ioannidis, D. G., Ntzani, E., Ioannidis, J. P. Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med. 114 (6), 477-484 (2003).
  6. Haworth, S. G., Hislop, A. A. Adaptation of the pulmonary circulation to extra-uterine life in the pig and its relevance to the human infant. Cardiovasc Res. 15 (2), 108-119 (1981).
  7. Rendas, A., Branthwaite, M., Reid, L. Growth of pulmonary circulation in normal pig--structural analysis and cardiopulmonary function. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 45 (5), 806-817 (1978).
  8. Starbaek, S. M. R., et al. Animal models for influenza a virus infection incorporating the involvement of innate host defenses: Enhanced translational value of the porcine model. ILAR J. 59 (3), 323-337 (2018).
  9. Schneberger, D., Aharonson-Raz, K., Singh, B. Pulmonary intravascular macrophages and lung health: What are we missing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (6), L498-L503 (2012).
  10. Thomas, A. V., Broers, A. D., Vandegaart, H. F., Desmecht, D. J. Genomic structure, promoter analysis and expression of the porcine (sus scrofa) TLR4 gene. Mol Immunol. 43 (6), 653-659 (2006).
  11. Islam, M. A., et al. Age-related changes in phagocytic activity and production of pro-inflammatory cytokines by lipopolysaccharide stimulated porcine alveolar macrophages. Cytokine. 60 (3), 707-717 (2012).
  12. Kapetanovic, R., et al. The impact of breed and tissue compartment on the response of pig macrophages to lipopolysaccharide. BMC Genomics. 14, 581(2013).
  13. Chen, L., He, H., Fernandez Mondejar, E., Hedenstierna, G. Cyclooxygenase inhibitor blocks rebound response after no inhalation in an endotoxin model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284 (1), H290-H298 (2003).
  14. Spengler, D., Rintz, N., Krause, M. F. An unsettled promise: The newborn piglet model of neonatal acute respiratory distress syndrome (nards). Physiologic data and systematic review. Front Physiol. 10, 1345(2019).
  15. Tridente, A., De Martino, L., De Luca, D. Porcine vs. bovine surfactant therapy for preterm neonates with RDS: Systematic review with biological plausibility and pragmatic meta-analysis of respiratory outcomes. Respir Res. 20 (1), 28(2019).
  16. Kulkarni, H. S., et al. Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: An official American Thoracic Society workshop report. Am J Respir Cell Mol Biol. 66 (2), e1-e14 (2022).
  17. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  18. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (3), L379-L399 (2008).
  19. Preuss, S., et al. Inositol-trisphosphate reduces alveolar apoptosis and pulmonary edema in neonatal lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol. 47 (2), 158-169 (2012).
  20. Spengler, D., et al. Novel therapeutic roles for surfactant-inositols and -phosphatidylglycerols in a neonatal piglet ARDS model: A translational study. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (1), L32-L53 (2018).
  21. Von Bismarck, P., et al. Improved pulmonary function by acid sphingomyelinase inhibition in a newborn piglet lavage model. Am J Respir Crit Care Med. 177 (11), 1233-1241 (2008).
  22. Van Kaam, A. H., et al. Response to exogenous surfactant is different during open lung and conventional ventilation. Crit Care Med. 32 (3), 774-780 (2004).
  23. Lachmann, B., Robertson, B., Vogel, J. In vivo lung lavage as an experimental model of the respiratory distress syndrome. Acta Anaesthesiol Scand. 24 (3), 231-236 (1980).
  24. Thebaud, B., et al. Benefits and obstacles to cell therapy in neonates: The incubator (innovative neonatal cellular therapy for bronchopulmonary dysplasia: Accelerating translation of research). Stem Cells Transl Med. 10 (7), 968-975 (2021).
  25. Davies, M. W., Mehr, S., Morley, C. J. The effect of draw-up volume on the accuracy of electrolyte measurements from neonatal arterial lines. J Paediatr Child Health. 36 (2), 122-124 (2000).
  26. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Gottingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
  27. Stenersen, E. O., et al. A piglet perinatal asphyxia model to study cardiac injury and hemodynamics after cardiac arrest, resuscitation, and the return of spontaneous circulation. J Vis Exp. (191), e64788(2023).
  28. Force, A. D. T., et al. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  29. Vento, M., et al. Preterm resuscitation with low oxygen causes less oxidative stress, inflammation, and chronic lung disease. Pediatrics. 124 (3), e439-e449 (2009).
  30. Vincent, D., et al. Intratracheal E. coli lipopolysaccharide induces platelet-dependent bronchial hyperreactivity. J Appl Physiol (1985). 74 (3), 1027-1038 (1993).
  31. Preuss, S., et al. 18:1/18:1-dioleoyl-phosphatidylglycerol prevents alveolar epithelial apoptosis and profibrotic stimulus in a neonatal piglet model of acute respiratory distress syndrome. Pulm Pharmacol Ther. 28 (1), 25-34 (2014).
  32. Von Bismarck, P., et al. Surfactant "fortification" by topical inhibition of nuclear factor-kappa b activity in a newborn piglet lavage model. Crit Care Med. 35 (10), 2309-2318 (2007).
  33. Pape, A., et al. Neuromuscular blockade with rocuronium bromide increases the tolerance of acute normovolemic anemia in anesthetized pigs. Eur Surg Res. 48 (1), 16-25 (2012).
  34. Gasthuys, E., et al. Repetitive urine and blood sampling in neonatal and weaned piglets for pharmacokinetic and pharmacodynamic modelling in drug discovery: A pilot study. Lab Anim. 51 (5), 498-508 (2017).
  35. Noblet, J., Dourmad, J. Y., Etienne, M., Le Dividich, J. Energy metabolism in pregnant sows and newborn pigs. J Anim Sci. 75 (10), 2708-2714 (1997).
  36. Keibl, C., Kerbl, M., Schlimp, C. J. Comparison of Ringer's solution with 0.4% glucose or without in intraoperative infusion regimens for the prevention of hypoglycemia in juvenile pigs. Lab Anim. 48 (2), 170-176 (2014).
  37. Perri, A. M., O'sullivan, T. L., Harding, J. C., Wood, R. D., Friendship, R. M. Hematology and biochemistry reference intervals for Ontario commercial nursing pigs close to the time of weaning. Can Vet J. 58 (4), 371-376 (2017).
  38. Egeli, A. K., Framstad, T., Morberg, H. Clinical biochemistry, haematology and body weight in piglets. Acta Vet Scand. 39 (3), 381-393 (1998).
  39. Linderkamp, O., et al. Blood volume in newborn piglets: Effects of time of natural cord rupture, intra-uterine growth retardation, asphyxia, and prostaglandin-induced prematurity. Pediatr Res. 15 (1), 53-57 (1981).
  40. Talbot, R. B., Swenson, M. J. Blood volume of pigs from birth through 6 weeks of age. Am J Physiol. 218 (4), 1141-1144 (1970).
  41. Berger, D., et al. Effect of PEEP, blood volume, and inspiratory hold maneuvers on venous return. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 311 (3), H794-H806 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neonatalny model prosi ciadysplazja oskrzelowo p ucnaniedob r surfaktantuekspozycja na hiperoksjwentylacja wysokoci nieniowapodawanie lipopolisacharyduzapalenie p ucanaliza gazometrii krwiinfiltracja neutrofili
Opracowanie modelu ostrego uszkodzenia płuc u prosiatka noworodkowego, odtwarzającego wczesne środowisko przedwcześniackich płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.