Method Article

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

DOI:

10.3791/68124

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University, 3Johns Hopkins Translational ImmunoEngineering Center, Johns Hopkins University, 4Department of Dermatology, Johns Hopkins University, 5Department of Oncology, Johns Hopkins University, 6Department of Pathology, Johns Hopkins University, 7Convergence Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Johns Hopkins University School of Medicine, 8Bloomberg Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 9Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 10Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 11Departments of Neurosurgery and Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, 12Departments of Materials Science & Engineering and Chemical & Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono nową technikę obrazowania multipleksowego opartą na kodach kreskowych DNA, opartą na kodetekcji przez indEX, która analizuje proteomikę przestrzenną mikrośrodowisk tkankowych. Skuteczne obrazowanie wymaga repertuaru dobrze zaprojektowanych i odpowiednio zwalidowanych paneli przeciwciał, ale obecnie istnieje bardzo niewiele próbek z zatopioną w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. FFPE ma kilka zalet w porównaniu ze świeżo mrożonymi próbkami, takich jak powszechna dostępność, łatwość obsługi i przechowywania oraz możliwość tworzenia mikromacierzy tkankowych (TMA). W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowania panelu przeciwciał do wizualizacji i analizy tkanek FFPE z mysiego modelu czerniaka leczonego nanocząstkami, które dostarczają plazmidowe DNA kodujące sygnały immunologiczne do przeprogramowania mikrośrodowiska guza. Opisujemy również potok analizy obrazu przy użyciu narzędzi obliczeniowych typu open source do opisywania tkanek, segmentacji komórek, przetwarzania danych proteomicznych, fenotypowania populacji komórek i ilościowego określania wskaźników przestrzennych. Protokół oferuje zastosowania do projektowania paneli przeciwciał w mysim FFPE i generowania nowatorskich informacji na temat proteomiki przestrzennej złożonych mikrośrodowisk tkankowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak skóry jest najczęstszym nowotworem skóry, z różnymi wskaźnikami choroby i śmiertelności na całym świecie w zależności od czasu diagnozy i podstawowej opieki zdrowotnej1. W ciągu ostatniej dekady zwiększona wiedza biologiczna na temat czerniaka pomogła przyspieszyć rozwój nowych modeli nowotworów do leczenia guzów litych2. Niedawny rozwój immunoterapii doprowadził do rewolucyjnej koncepcji leczenia nowotworów opartej na aktywacji endogennego układu odpornościowego 3,4.

Mikrośrodowisko guza (TME) jest bardzo złożone, składa się z różnych komórek odpornościowych, fibroblastów związanych z rakiem, perycytów, komórek śródbłonka i różnych komórek rezydujących w tkance5. W przeszłości do badania TME zastosowano kilka technik, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie pojedynczych komórek, które pogarszają kontekst przestrzenny, ponieważ są wymagane do zniszczenia tkanki nowotworowej. Tradycyjne obrazowanie mikroskopowe, takie jak immunofluorescencja (IF) i immunohistochemia (IHC), umożliwia wizualizację biomarkerów białkowych bez niszczenia tkanek próbki. Podejścia te są jednak ograniczone do dwóch lub trzech biomarkerów i nie są w stanie zapewnić pełnego zrozumienia relacji przestrzennych i strukturalnych w obrębie kompleksu TME 6.

Aby rozwiązać ten problem, opracowano kilka technik obrazowania multipleksowego, które umożliwiają przestrzenną wizualizację złożonego TME 7,8,9,10. Jednym z nich jest CoDetection-by-inDEXing, przemianowany na system PhenoCycler, oparty na przeciwciałach sprzężonych z oligonukleotydami DNA11. System może zapewnić obrazowanie pojedynczych komórek i analizę ponad 100 biomarkerów próbek ludzkich. Jednak dostępnych jest bardzo niewiele zinwentaryzowanych przeciwciał do wizualizacji i analizy próbek mysich, w szczególności próbek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)12. FFPE oferuje kilka zalet w porównaniu z konserwacją Fresh Frozen (FF), takich jak łatwość obsługi i przechowywania, dobrze zachowana morfologia w czasie oraz, co najważniejsze, możliwość przygotowania mikromacierzy tkanek/guzów (TMA), które pozwalają na wizualizację kilku próbek na jednym szkiełku. Niedawno zaprojektowaliśmy i opracowaliśmy mysi panel przeciwciał FFPE CODEX/PhenoCycler i z powodzeniem zastosowaliśmy go do wizualizacji i analizy proteomiki przestrzennej genetycznie przeprogramowanych próbek mysiego czerniaka13.

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie przewodnika krok po kroku dotyczącego projektowania mysiego panelu przeciwciał FFPE oraz opisanie procesu koniugacji przeciwciało-kod kreskowy, barwienia tkanek i obrazowania. Dodatkowo przedstawiamy szczegółowy potok analizy obrazu z wykorzystaniem narzędzi open source, takich jak pakiety QuPath i R. Po zastosowaniu tego protokołu naukowcy dowiedzą się, jak zaprojektować niestandardowy panel przeciwciał sprzężonych, wykonać obrazowanie multipleksowe za pomocą urządzenia Phenocycler-Fusion i uzyskać nowy wgląd w proteomikę przestrzenną czerniaka TME. Co więcej, protokół ten można dostosować do badania różnych mikrośrodowisk immunologicznych guza i połączyć z istniejącymi technikami transkryptomiki przestrzennej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, przy użyciu zatwierdzonych numerów protokołów MO18M388 i MO21M384.

1. Selekcja przeciwciał

  1. Zaprojektuj panel przeciwciał w oparciu o tkankę będącą przedmiotem zainteresowania i obfitość danego biomarkera. Wybierz klony przeciwciał na podstawie udanych wcześniejszych zastosowań barwienia immunofluorescencyjnego (IF) i immunohistochemicznego (IHC) w literaturze. Bezpieczne wersje tych przeciwciał wolne od nosicielstwa.
    UWAGA: Oczyszczone przeciwciało wolne od nośnika jest ważne dla koniugacji kodu kreskowego. Unikaj wszelkich konserwantów na bazie białka, takich jak BSA, gluten, glicerol itp. Jeśli przeciwciało bez nosicielstwa jest niedostępne, poproś dostawcę o niestandardowe przeciwciało lub użyj zestawu do usuwania BSA, aby uzyskać przeciwciało bez nośnika. Azydek sodu nie zakłóca koniugacji przeciwciał. Izotypy IgG są zalecane zamiast izotypów IgM.
  2. Zweryfikuj te wybrane klony na tkance będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą konwencjonalnego obrazowania immunofluorescencyjnego (IF)11. Użyj podwójnego obrazowania IF, aby potwierdzić swoistość niektórych klonów (np. Wykonaj obrazowanie podwójnego IF za pomocą FOXP3 i CD4, aby potwierdzić barwienie regulatorowych limfocytów T).
    UWAGA: Zawsze, gdy jest to możliwe, ważne jest, aby do walidacji IF używać tej samej tkanki, która będzie używana do barwienia. Wybierz odpowiedni roztwór do pobierania antygenu. W tym protokole użyliśmy buforu AR9 dostarczonego przez Akoya Biosciences do pobrania wszystkich epitopów tkankowych FFPE czerniaka myszy. Inne rozwiązania do odzyskiwania antygenu, takie jak AR6 lub Universal, mogą być stosowane w zależności od wymagań epitopów.

2. Koniugacja i potwierdzenie przeciwciał

  1. Przypisz zweryfikowane przeciwciała do kodów kreskowych, które mają komplementarne reportery dołączone do fluoroforów ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) lub AF750 (Cy7). Antygeny o niskiej liczebności zwykle wytwarzają niższe sygnały; sprzęgnąć takie przeciwciała z kanałami o niskiej autofluorescencji, takimi jak AF647 (Cy5). Koniuguj antygeny o wysokiej ekspresji do ATTO550 (Cy3) i AF750 (Cy7) ze względu na możliwość autofluorescencji.
    UWAGA: Ten krytyczny krok uwzględnia czułość kanału i obfitość antygenu. Stosowanie kanału AF488 do tkanek FFPE nie jest zalecane ze względu na jego wyższą autofluorescencję.
  2. Do koniugacji przeciwciało-kod kreskowy (4,5 h) należy zaopatrzyć się w zestaw do koniugacji przeciwciał. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, z wyjątkiem roztworu redukcyjnego 1, który należy przechowywać w temperaturze -20 °C w postaci małych fiolek jednorazowego użytku.
    1. Zmierz stężenie przeciwciał za pomocą spektrofotometru.
    2. Sprzęganie przeciwciał należy rozpocząć od nałożenia 500 μl roztworu blokującego filtr do kolumny filtrującej MWCO o mocy 50 kDa w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z filtrem. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadmiar płynu z kolumny za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Roztwór redukcyjny 1 to fiolka z roztworem jednorazowego użytku, która wystarcza na trzy koniugacje przeciwciał jednocześnie. Nie używać ponownie roztworu po rozmrożeniu; Wyrzuć pozostały odczynnik. Nie używaj filtra nad kolumną filtrującą MWCO o mocy 50 kDa, ponieważ może to spowodować słabe oczyszczanie i koniugację.
    3. Użyć równoważnej objętości 50 μg roztworu przeciwciała i dodać go do filtra MWCO o mocy 50 kDa. W razie potrzeby dostosuj całkowitą objętość do 100 μl za pomocą PBS. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie przygotować główną mieszankę redukcyjną, używając 19,8 μl roztworu redukcyjnego 1 + 825 μl roztworu redukcyjnego 2 dla trzech koniugacji przeciwciał.
    4. Odrzucić przepływ i dodać 260 μl głównej mieszanki redukcyjnej na wierzch każdej jednostki filtrującej. Wirować roztwór w jednostce filtrującej przez 2-3 sekundy i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie przekraczać 30 minut inkubacji, aby uniknąć nadmiernej redukcji przeciwciał, ponieważ powoduje to ich uszkodzenie i może spowodować nieudaną koniugację.
    5. Po 30 minutach inkubacji wirować w temperaturze 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i wylać płyn na dno. Dodać 450 μl roztworu koniugacyjnego na wierzch kolumny i wirować w temperaturze 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania należy przygotować roztwór kodu kreskowego CODEX. Poruszaj się szybko po pobraniu kodu kreskowego z temperatury -20 °C, ponieważ kod kreskowy zaczyna się pogarszać.
      UWAGA: Kody kreskowe są zwykle dostarczane w małych szklanych fiolkach zawierających produkty liofilizowane (płatki lub proszek) przechowywane w temperaturze -20 °C. Fiolki te mogą być używane do koniugacji 50 μg przeciwciała na raz. Zaleca się, aby nie koniugować więcej niż trzech przeciwciał jednocześnie.
    6. Ostrożnie zlokalizuj liofilizowany kod kreskowy na dnie szklanej fiolki (może być również przyklejony do ścianek). Postukaj szklaną fiolką o stół, aby sprowadzić ciała stałe na dno. Zlokalizowanie liofilizowanego produktu jest niezbędne podczas rozpuszczania go w 10 μl wody klasy biologicznej molekularnej bez nukleaz. Po dodaniu 10 μl wody wolnej od nukleaz, dodaj 210 μl roztworu koniugacyjnego do każdego kodu kreskowego. Rozpuść cały liofilizowany materiał i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Uchylenie.
    7. Po zakończeniu wirowania w kroku 2.2.5 wyrzuć przepływowy płyn i dodaj odpowiedni roztwór kodu kreskowego z kroku 2.2.6 na górze każdej jednostki filtrującej. Zaoszczędź 1 μg początkowego niesprzężonego przeciwciała; zostanie to przeprowadzone wraz ze sprzężoną próbką przeciwciała o pojemności 5 μl podczas walidacji elektroforezy żelowej.
    8. Oznacz każdą probówkę odpowiednią nazwą przeciwciała i kodu kreskowego. Zamknij pokrywkę i mieszaj roztwór, wirując przez 2-3 s. Inkubować reakcję koniugacji przeciwciało-kod kreskowy przez 2 godziny w temperaturze RT.
    9. Po 2 godzinach inkubacji usunąć 5 μl sprzężonego przeciwciała i umieścić w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, aby potwierdzić koniugację za pomocą elektroforezy żelowej.
    10. Odwirować pozostały roztwór sprzężonego przeciwciała o stężeniu 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4°C. Dodać 450 μl roztworu oczyszczającego na wierzch kolumny, wirować przy 12 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić przepływ. Powtórz ten etap oczyszczania 2 razy, dodając za każdym razem 450 μl roztworu oczyszczającego i odkręcając go w dół.
    11. Po 3odwirowaniu wyrzuć przepływ. Górny filtr będzie zawierał przeciwciała sprzężone z kodem kreskowym.
    12. Aby zebrać sprzężone przeciwciało, oznacz nową rurkę zewnętrzną, w której znajduje się kolumna filtra, odpowiednim przeciwciałem i kodem kreskowym. Odetnij pokrywkę z zewnętrznej probówki przed odwirowaniem. Dodaj 100 μl roztworu do przechowywania przeciwciał do każdej jednostki filtrującej i umieść nowo oznakowaną rurkę zewnętrzną do góry nogami na górze kolumny filtrującej.
    13. Odwrócić kolumnę filtracyjną, aby zebrać sprzężone przeciwciało do zewnętrznej probówki i wirować w dół przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powinno to zebrać około 120 μl sprzężonego roztworu przeciwciała. Przenieść do sterylnej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 18-24 miesiące.
      UWAGA: Aby uniknąć barwienia jądrami o wysokim poziomie tła po koniugacji, zaleca się, aby nie stosować tych przeciwciał przez co najmniej 2 dni.
  3. Wykonać potwierdzenie koniugacji za pomocą elektroforezy żelowej, jak opisano w opublikowanym już protokole13.
    UWAGA: Proces ten potwierdza jedynie powodzenie chemicznej reakcji koniugacji stosowanej do koniugacji kodów kreskowych z przeciwciałami. Jest to opcjonalne, ponieważ walidacja przeciwciał jest możliwa tylko po udanym barwieniu i obrazowaniu tkanki.

3. Przygotowanie próbki mysiego FFPE

  1. Uzyskać próbki tkanek FFPE od samic myszy C57BL / 6J, którym wszczepiono guzy boczne B16F10. Leczyć myszy wstrzyknięciami donowotworowymi nanocząstek na bazie poli(β-aminoestrów) zawierających plazmidy 4-1BBL i IL-12, wraz z dootrzewnowym dostarczaniem anty-PD1 w 9, 11, 16 i 18 dni po implantacji14. Złóż w ofierze myszy w 20 dniu i napraw guzy w 10% formalinie, osadzonej w parafinie, a następnie przekrój w rdzeniu Johns Hopkins Oncology Tissue Services.
  2. Dokładnie rozważ specyfikacje obszaru obrazowania podane w instrukcji obsługi i zamontuj próbki 5 μm na szkiełku wewnątrz obszaru obrazowania. Udało nam się zamontować cztery różne próbki guza na jednym szkiełku.
    UWAGA: Konieczne jest korzystanie z zalecanych prowadnic dostępnych do obrazowania, takich jak szkiełka samoprzylepne Leica Apex lub szkiełka samoprzylepne Fisherbrand Superfrost Plus. Pomoże to celi przepływowej mocno przylegać do szkiełka.

4. Barwienie i obrazowanie tkanek FFPE

  1. Weryfikacja i optymalizacja stężenia przeciwciał i czasów ekspozycji: Aby zweryfikować powodzenie koniugacji przeciwciało-kod kreskowy, należy wybarwić badaną tkankę 6-9 sprzężonymi przeciwciałami. Uruchom urządzenie do obrazowania multipleksowego i zanotuj każde stężenie przeciwciał i czas ekspozycji. Dostosuj rozcieńczenia i czasy ekspozycji zgodnie z potrzebami, a następnie uruchom 6-9 nowych przeciwciał z wcześniej zweryfikowanymi i zanotuj wszelkie korekty. Wykonaj poniższe czynności, aby wybarwić i obrazować.
  2. Barwienie i obrazowanie tkanek
    1. Dzień przed barwieniem upiecz szkiełka z bibuły FFPE w piekarniku o temperaturze 60 °C przez noc. Następnego dnia schłodzić szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem etapów deparafinowania i ponownego nawodnienia tkanek.
    2. Deparafinizację tkanki należy rozpocząć od inkubacji w roztworze ksylenu 2x po 5 minut.
    3. Aby nawodnić tkankę, przenieś ją przez dwie rundy roztworu 100% etanolu przez 5 minut każda. Następnie przepuszczaj go przez serię roztworów alkoholowych od 90% do 70%, 50% i 30% przez 5 minut każdy. Na koniec umyj chusteczkę wodą destylowaną dwa razy przez 5 minut każde.
      UWAGA: Mniej toksyczne alternatywy dla ksylenu, takie jak roztwór Neoclear, mogą być stosowane do etapów deparafinowania. Przeprowadzić deparafinizację i ponowne nawodnienie pod wyciągiem.
    4. Rozcieńczyć 10x bufor AR9 do 1x za pomocą wody destylowanej. Napełnij słoik Coplin 50 ml buforu 1x AR9, upewniając się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w buforze do odzyskiwania antygenu.
    5. Napełnij szybkowar wodą tak, aby poziom znajdował się w połowie wysokości słoika Coplin, a następnie inkubuj pod wysokim ciśnieniem przez 20 minut.
      UWAGA: Możliwe jest użycie specjalistycznego szybkowaru lub komory demonstracyjnej w celu lepszego pobierania antygenu poprzez ustawienie go na 120 °C na 10 minut.
    6. Po wykonaniu kroku szybkowaru schładzaj szkiełka przez 45-60 min. Opłucz szkiełko wodą destylowaną 2x po 2 minuty. Następnie przenieść szkiełko do słoika zawierającego 1x PBS.
    7. Aby zminimalizować autofluorescencję, wykonaj etap wybielania tkanki przed barwieniem przeciwciałami. Świeżo przygotuj roztwór wybielający (25 ml 1x PBS + 0,8 ml 1M NaOH + 4,5 ml H2O2) przy użyciu zalecanych odczynników i stężeń. Inkubować szkiełka w plastikowym pojemniku zawierającym roztwór wybielający między dwiema lampami LED przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzaj ze świeżym roztworem wybielającym przez kolejne 45 minut.
    8. Rozpocznij przygotowywanie roztworu koktajlu przeciwciał podczas tego etapu wybielania, zwłaszcza jeśli w panelu znajduje się kilka przeciwciał o różnych rozcieńczeniach. Wyjmij wszystkie cztery blokery (G, S, J i N) i umieść je na lodzie, ponieważ niektóre potrzebują czasu, aby rozmrozić się od -20 °C.
    9. Po fotowybielaniu umyj tkankę 1x PBS, 2x po 2 minuty. Przenieś chusteczkę do słoików zawierających bufor nawadniający i myj 2x po 2 min każdy.
    10. Przenieść szkiełka tkankowe do buforu barwiącego i pozostawić do zrównoważenia przez 30 minut. Jeśli nie zostanie przygotowany na etapie bielenia, przygotuj w tym czasie roztwór koktajlu przeciwciał.
    11. Przygotuj 300 μl roztworu koktajlu przeciwciał do wybarwienia dwóch szkiełek (zwykle, jeśli używasz plastikowej komory do hybrydyzacji, 100-120 μl koktajlu przeciwciał wystarcza do zabarwienia każdego szkiełka).
    12. Zabarwić szkiełka, nakładając na noc roztwór koktajlu przeciwciał do komory wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała wykazują pozytywny sygnał po zabarwieniu przez noc w temperaturze 4 °C. Jednak czas barwienia i temperatura każdego przeciwciała mogą się różnić i muszą być zoptymalizowane. Najczęściej stosowanymi warunkami barwienia są 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby możliwe jest również barwienie kilku przeciwciał początkowo w różnych temperaturach, a następnie pozostałych przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przemyć tkankę PBS, jeśli konieczne jest barwienie sekwencyjne.
    13. Następnego dnia wykonaj utrwalenie po barwieniu. Wyjąć plastikową komorę i przechowywać zebrany koktajl przeciwciał w temperaturze 4 °C. Umyć szkiełka 2x w buforze barwiącym przez 2 minuty każde. Następnie przenieść szkiełka do 40 ml roztworu utrwalającego po barwieniu (4 ml 16% paraformaldehydu + 36 ml buforu do przechowywania) i inkubować przez 10 minut. Płukać PBS 3x przez 2 minuty każdy.
    14. Przenieś szkiełka do lodowatego metanolu na 5 minut, a następnie spłucz PBS 3x przez 2 minuty każde. Nanieść końcowy roztwór utrwalający (20 μl jedna tubka + 1 ml PBS) na szkiełka podstawowe pod komorą wilgotnościową. Zwykle wystarczy 200 μl roztworu utrwalającego na szkiełko. Pozostaw utrwalacz na 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy końcowe płukania w PBS po 2 minuty każde.
      UWAGA: Nie wyjmuj wcześniej rurki utrwalającej z -20 °C; Tylko rozmrozić przed nałożeniem.
    15. W przypadku natychmiastowego obrazowania przetrzyj szkiełko wokół tkanki za pomocą niestrzępiącej się chusteczki i nałóż celę przepływową, naciskając ją przez 30 sekund za pomocą sprzętu do montażu komór przepływowych. W przypadku późniejszego obrazowania należy przechowywać szkiełko (bez stosowania kuwety przepływowej) w buforze magazynowym w temperaturze 4 °C. Gdy szkiełka będą gotowe do zobrazowania, przenieś je z bufora pamięci masowej do PBS na 10 minut przed zastosowaniem komórki przepływowej.
  3. Rozpocznij przygotowanie bufora biegowego 1x z dodatkiem w oparciu o pożądane cykle w eksperymencie. Przygotuj o niskiej (1:4) i wysokiej zawartości DMSO (9:1), mieszając jako 1-częściowy DMSO z 4-częściowym buforem roboczym i 9-częściowy DMSO z 1-częściowym buforem roboczym wymaganym dla pożądanych cykli. Zaoszczędź około 20 ml 1x buforu z dodatkiem do przygotowania płytki reporterowej. Aby obliczyć wymagany bufor 1x z addytywnymi i wysokiego/niskiego DMSO, skonsultuj się z menedżerem urządzenia.
  4. Zacznij przygotowywać talerz reporterski. Najpierw należy przygotować reporterowy roztwór podstawowy wymagany dla całkowitej liczby cykli. Oznaczyć czarne lub bursztynowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1 ml nazwami cykli. Dodać 250 μl reporterowego roztworu podstawowego i 5 μl każdego reportera do odpowiedniej probówki. Następnie przenieś roztwór na czarną 96-dołkową płytkę i zamknij ją folią klejącą.
  5. Uruchom urządzenie, użyj menedżera instrumentu, aby ustawić parametry i czasy ekspozycji (zgodnie z Tabelą 1), a następnie uzyskaj obrazy. Rysunek 1 podsumowuje procesy przed i po barwieniu.

5. Adnotacja tkanek i segmentacja komórek

  1. Skonfiguruj projekt i obszar roboczy.
    1. Zainstaluj najnowszą wersję oprogramowania do cyfrowej analizy patologicznej (np. QuPath w wersji 0.5.1 lub nowszej). Kliknij Utwórz projekt , aby wybrać folder docelowy dla przestrzeni projektu.
    2. Kliknij Dodaj obrazy > Wybierz pliki, a następnie przejdź do pliku QPTIFF (utworzonego z multipleksowego obrazowania immunofluorescencyjnego). Ustaw typ obrazu na Fluorescencja, zachowaj wszystkie inne ustawienia domyślne i kliknij przycisk Importuj.
    3. Jeśli używasz QuPath, kliknij dwukrotnie nowy obraz, aby otworzyć obszar roboczy. Kliknij pozycję Plik > Zapisz okresowo, aby śledzić zmiany wprowadzone w projekcie. Przełącz ustawienia widoczności i wyświetlania znaczników za pomocą opcji Jasność i kontrast (ikona półksiężyca) w pobliżu środka paska narzędzi.
      UWAGA: Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz na liście obrazów, aby zmienić jego nazwę. Będzie to ważne później podczas wizualizacji klasyfikacji fenotypów.
  2. Opisz pełny wycinek tkanki, przedział śródnowotworowy i przedział zrębu.
    1. Użyj pędzla i/lub narzędzia do różdżki, aby narysować adnotację wokół całego przekroju tkanki. Zdefiniuj tę adnotację jako Full_Tissue. Wyklucz nakrytą skórę i/lub wszelkie obszary, które nie powinny być analizowane. Aby utworzyć negatywną adnotację i/lub zmniejszyć granicę adnotacji, przytrzymaj Alt podczas korzystania z jednego z narzędzi adnotacji.
    2. Zduplikuj pełną adnotację tkanki. Wybierz Adnotację na karcie Adnotacje, a następnie przejdź do pozycji Obiekty > Adnotacje... > Powiel zaznaczone adnotacje.
    3. Włącz kanał SOX10. W zduplikowanej adnotacji zmniejsz granicę adnotacji, aby uchwycić przedział wewnątrznowotworowy za pomocą narzędzia Alt + pędzel/różdżka. Zdefiniuj tę adnotację jako guz (ryc. 2).
    4. Wybierając pełną adnotację tkanki, przejdź do Obiekty > Adnotacje... > Rozwiń adnotacje. Zdefiniuj promień rozwinięcia jako 1 μm i kliknij przycisk Uruchom.
    5. Zmień nazwę nowej adnotacji na Full_Tissue_Expansion. Wybierz adnotację guza, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wstaw w hierarchii.
    6. Ponownie wybierz adnotację guza, przejdź do Obiekty > adnotacje... > Zrób odwrotnie. Zdefiniuj tę nową adnotację jako Stroma. Powtórz dla wszystkich odcinków tkanki.
  3. Uruchom segmentację komórek i wyeksportuj wyniki.
    1. Przejdź do zakładki Obraz , aby znaleźć szerokość i wysokość obrazu w pikselach (Rysunek 3A).
    2. Pobierz rozszerzenie StarDist pod adresem https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Przeciągnij plik qupath-extension-stardist-[wersja].jar do okna QuPath, a następnie kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu okna QuPath. W obszarze Rozszerzenia zdefiniuj katalog użytkownika QuPath jako lokalizację folderu StarDist.
    3. Pobierz pliki skryptów StarDist groovy i plik modelu StarDist z https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (skrypty StarDist zostały pierwotnie zorganizowane z Akoya Biosciences).
    4. Dla każdej sekcji tkanki zaznacz zarówno adnotacje Guza , jak i Zrąb (użyj Ctrl, aby zaznaczyć wiele adnotacji). Na górnym pasku ustawień kliknij Automatyzuj > edytor skryptów , aby otworzyć interfejs skryptów. Otwórz odpowiedni skrypt segmentacji komórek StarDist (plik groovy), który odpowiada rozmiarowi piksela obrazu. Po wyświetleniu monitu o wybranie pliku segmentacji komórek otwórz plik stardist_cell_seg_model.pb.
    5. Po segmentacji komórek zapisz obraz. Przejdź do opcji Zmierz > Eksportuj pomiary, a następnie wybierz odpowiednie obrazy. Przypisz Typ eksportu jako Komórki i Separator jako .csv, a następnie wybierz lokalizację pliku wyjściowego . Kliknij pozycję Wypełnij obok opcji Kolumny, aby uwzględnić interesujące Cię dane. Ważne kolumny do wyeksportowania to Obraz, Identyfikator obiektu, Rodzic, Środek ciężkości X, Środek ciężkości Y i Obszar jądra.
      UWAGA: Identyfikator obiektu jest używany w kolejnych krokach do ponownego mapowania klasyfikacji z powrotem na multipleksowy obraz immunofluorescencyjny w oprogramowaniu do cyfrowej analizy patologicznej. Kolumna Nadrzędna wskazuje nazwę adnotacji, do której należy komórka. Dane X i Y są używane do analiz przestrzennych.
    6. Dla każdego znacznika pochodzenia, który ma być używany w grupowaniu/fenotypowaniu, wybierz jedną wartość średnią do wyeksportowania. W przypadku znaczników jądrowych (np. SOX10 i FOXP3) należy wyeksportować opcję Nucleus: Mean. W przypadku markerów cytoplazmatycznych/błoniastych (np. CD45, CD3, CD4) wyeksportuj opcję Cytoplazma: Średnia.

6. Wstępne przetwarzanie i normalizacja danych proteomicznych

  1. Otwórz wyeksportowany plik CSV. Dla każdego markera, który ma być używany w grupowaniu/fenotypowaniu, należy obciąć nazwę nagłówka kolumny, aby zawierał tylko znacznik. Na przykład zmień nazwę SOX10: Jądro: Średnia na SOX10 i CD3: Cytoplazma: Średnia na CD3.
  2. Zainstaluj najnowszą wersję języków R i RStudio. Pobierz plik Marker Normalization.R z https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis i uruchom skrypt. Najpierw polega to na odfiltrowaniu komórek według wielkości jądra.
  3. Dla każdego markera przeprowadzana jest normalizacja min-max, tak aby najniższa wartość MFI w zakresie wyrażenia była ustawiona na 0, a wartość MFI w 99,7. percentylu była ustawiona na 1. Wszystkie intensywności powyżej 99,7 percentyla są obcięte na 1. Po zakończeniu zapisz nowy plik CSV wygenerowany ze znormalizowanymi danymi.

7. Grupowanie i fenotypowanie

  1. Wybierz algorytm grupowania komórek zgodnie z profilami wyrażeń znaczników. W https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis dostępne są skrypty języka R do klastrowania przy użyciu narzędzia Seurat w wersji 4.415 i FlowSOM w wersji 2.13.9 (narzędzie do klastrowania i wizualizacji)16.
  2. Komórki fenotypowe zgodnie z profilami ekspresji markerów kluczowych markerów linii. W przedstawionym tutaj protokole wykorzystano 14 markerów linii do grupowania i fenotypowania: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 i CD31.
    1. Zdefiniuj komórki nowotworowe jako SOX10hi. Zdefiniuj limfocyty T CD4 jako CD45mod-hi / CD4hi / CD8low / FOXP3low. Zdefiniuj limfocyty T CD8 jako CD45mod-hi / CD8hi / CD4niskie. Zdefiniuj limfocyty Treg jako CD45mod-hi/CD4hi/CD8low/FOXP3hi. Zdefiniuj inne limfocyty T jako CD45mod-hi / CD3hi / CD4niski / CD8niski.
    2. Zdefiniuj makrofagi M1 jako CD45mod-hi/F4/80hi/CD68hi/CD86hi/CD163low / CD206low. Zdefiniuj makrofagi M2 jako CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86niski/CD163hi/CD206niski, CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86niski/CD163niski/CD206hi, lub CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86niski/CD163hi/CD206hi. Zdefiniuj inne makrofagi jako CD45mod-hi / F4 / 80hi / CD68mod-hi / CD86niski/ CD163niski / CD206niski lub CD45mod-hi / F4 / 80hi / CD68mod-hi / CD86hi / CD163hi / CD206hi.
    3. Zdefiniuj komórki dendrytyczne jako CD45mod-hi/CD11chi/CD86mod-hi. Zdefiniuj komórki NK jako CD45mod-hi/NK1.1hi. Zdefiniuj inne komórki odpornościowe jako CD45mod-hi , które nie spełniły warunków opisanych powyżej. Zdefiniuj komórki śródbłonka jako CD31mod-hi. Usuń wszystkie inne profile wyrażeń.

8. Ponowne mapowanie klasyfikacji fenotypów i przeprowadzanie kontroli jakości

  1. Pobierz skrypt Remapping Classifications.groovy z https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (ten skrypt został zaadaptowany z postu na https://forum.image.sc/ autorstwa petebankheada).
  2. Otwórz fenotypowany plik CSV i upewnij się, że wszystkie etykiety na karcie Obraz dokładnie odpowiadają nazwie pliku obrazu w oprogramowaniu do cyfrowej analizy patologicznej, które będzie używane do ponownego mapowania. Aby szybko zmienić dużą liczbę etykiet w pliku CSV, użyj funkcji Zamień wszystko.
  3. Jeśli używasz QuPath, uruchom plik groovy mapowania klasyfikacji, klikając Automatyzuj > Edytorze skryptów.
  4. Na karcie Adnotacje kliknij ikonę Trzy kropki obok przycisku Automatyczne ustawianie, a następnie kliknij opcję Wypełnij istniejące obiekty > Wszystkie klasy (w tym podklasy) > Tak.
  5. Przewiń w dół na liście znaczników, aby wyświetlić różne klasyfikacje fenotypów i dostosować schemat kolorów zgodnie z potrzebami. Kliknij dwukrotnie dowolną komórkę, aby wyświetlić jej fenotyp (obok znacznika Klasyfikacja) i klaster (obok znacznika Nazwa). Sprawdź reprezentatywne pola widzenia, aby określić dokładność przypisań fenotypu i w razie potrzeby zrewiduj strategię fenotypowania (Rysunek 3B).

9. Kwantyfikacja gęstości i analiza przestrzenna

  1. Po sfinalizowaniu fenotypowania uzyskaj obszary adnotacji w oprogramowaniu do cyfrowej analizy patologii na karcie Adnotacje. Przekonwertuj wartości powierzchni na mm2, a następnie podziel liczby przez obszary opisu, aby obliczyć gęstości.
  2. Pobierz skrypt SPIAT Spatial Analysis.R z https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis i uruchom. Zbieraj dane dotyczące średnich minimalnych odległości (AMD), kompozycji sąsiedztwa i znormalizowanych wyników mieszania (NMS).
  3. Generuj dane liczbowe w oprogramowaniu do analizy statystycznej, aby przedstawić wyniki. Generując pojedynczą mapę cieplną dla średnich minimalnych odległości warunków leczenia, należy uśrednić wyniki uzyskane z różnych odcinków tkanki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół projektowania panelu przeciwciał dla mysiej tkanki FFPE, wykonywania multipleksowego obrazowania immunofluorescencyjnego oraz analizy obrazów w celu oceny ilościowej proteomiki i relacji przestrzennych. Zwalidowany panel zawiera 27 przeciwciał, które dostarczają markerów do wizualizacji komórek czerniaka (SOX10), leukocytów (CD45), limfocytów T (CD3, CD4, CD8, FOXP3), limfocytów B (CD20), makrofagów i podtypów (F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), komórek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powodzenie obrazowania zależy od dobrze zaprojektowanego i zwalidowanego panelu przeciwciał. Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne próbek FFPE stanowi wyzwanie ze względu na wysoką autofluorescencję i trudności w odzyskaniu epitopów zamaskowanych przez zatapianie parafiny. Biorąc jednak pod uwagę, że FFPE oferuje kilka zalet w porównaniu z próbkami FF, konieczne jest zaprojektowanie i walidacja paneli przeciwciał FFPE. Pierwszym krokiem jest sfinalizowanie klonów przeciwciał, które wykazują pozytywne sygnały po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.S. dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Emerson Collective LLC i National Institutes of Health. J.J.G. dziękuje również za finansowanie z National Institutes of Health. J.C.S. ma powiązania z Palleon Pharmaceuticals Inc., które obejmują dotacje finansowe. S.Y.T. i J.J.G. mają powiązania z OncoSwitch Therapeutics, które obejmują akcje lub akcje. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. i K.M.L. mają zgłoszony patent. Wszyscy pozostali autorzy twierdzą, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby być postrzegane jako mające wpływ na badania przedstawione w tym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.S. wyraża uznanie dla Fundacji Dermatologicznej i Nagrody Rozwoju Kariery Dermatopatologicznej za rozwój kariery Autora. Autorzy dziękują Hsin-Pei Lee z National Cancer Institute's Cancer Data Science Laboratory za pomoc w technikach analizy obliczeniowej. Badania te zostały sfinansowane przez Emerson Collective i National Institutes of Health (R37CA246699, P41EB028239 i R01CA228133). Ponadto rdzeń Johns Hopkins Oncology Tissue Services (OTS) jest wspierany przez National Institutes of Health (P30CA006973).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% paraformaldehyd (PFA)Nauki o mikroskopii elektronowejNr kat.: # 15710Wymagane podczas procesu barwienia tkanek
Filtr MWCO 50kDaMiliporyUFC50509625 kDa i 100 kDa powodują awarię
Kody kreskowe i reporterzy AkoyaAkoya BiosciencesZróżnicowaneKażdy kod kreskowy może być użyty do koniugacji 50 ug przeciwciała wolnego od nośnika i jest dostarczany z dwiema fiolkami reporterów
Zestaw do koniugacji przeciwciałAkoya Biosciences7000009Zestaw do koniugacji służy do tworzenia niestandardowych przeciwciał sprzężonych z kodami kreskowymi. Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do dziesięciu koniugacji. Zestaw składa się z jednego pudełka podzestawu przechowywanego w temperaturze 4 & stopni; C i jedno pudełko podzestawu przechowywane w temperaturze -20 & st. C. Opcja 4 ° Podzestaw C zawiera roztwór blokujący filtr, roztwór redukcyjny 2, roztwór sprzęgający, roztwór oczyszczający i roztwór do przechowywania przeciwciał. Opcja -20 ° Podzestaw C zawiera roztwór redukcyjny 1.
Beta2MG powiedział:Biblioteka ab214769 powiedział:
Płyta CD11bSpecyfikacja techniczna #41028
CD11C powiedział:Specyfikacja techniczna #39143SF
Płyta CD163CST #68922BF
Płyta CD20Specyfikacja techniczna #45839
Płyta CD206CST #87887
Płyta CD3Specyfikacja techniczna #24581
Płyta CD31Specyfikacja techniczna #92841
Płyta CD38Specyfikacja techniczna #68336BF
Płyta CD4Biblioteka ab271945 powiedział:
Płyta CD45Specyfikacja techniczna #98819
Płyta CD68CST #29176
Płyta CD8Invitrogen #14-0808-82
Płyta CD86CST #20018
DimetylosulfotlenekAvantor/VWRBDH1115-4LP
Misje obserwacji ludności (EOME)Biblioteka ab222226 powiedział:
Probówki Eppendorf PCREppendorf powiedział:E0030124286Wymagany sklep 5 μ Przeciwciało sprzężone L do potwierdzenia koniugacji za pomocą elektroforezy żelowej
Etanol 200 proof
Rozmiar F4/80Specyfikacja techniczna # 25514
FoxP3 powiedział:Specyfikacja techniczna #72338
Gran-BCST #79903SF
Piec grzewczy
Komora hybrydyzacyjnaSłuży do barwienia tkanek koktajlem przeciwciał
Nadtlenek wodoruSigma#216763Niezbędny do przygotowania roztworu wybielającego
Szybkowar instant pot lub komora demaskatorska ARCNatychmiastowa doniczka lub Biocare Medical
Czołg Ki-67Akoya Biosciences
LAG3 powiedział:Specyfikacja techniczna #80282BF
Klasa LMP2Biblioteka ab243556 powiedział:
Metanol
MHC-II (Przekaźnik Miniaturowy)eBionauka #14-5321-82
NK1.1CST #24395SF
Plama jądrowaAkoya Biosciences7000003
Biblioteka PDL1Specyfikacja techniczna #85095
DNA plemników łososia, ścięte (10 mg/mL)InvitrogenZobacz materiał AM9680Może być stosowany jako alternatywa dla odczynnika testowego (Akoya) na etapie przygotowania płytki reporterowej.
SOX-10 powiedział:Księga Abcam  ab245760 powiedział:
Zestaw do barwienia do PhenoCycler-FusionAkoya Biosciences7000017Zestaw próbek PhenoCycler-Fusion zawiera i odczynniki niezbędne do barwienia tkanek przy użyciu przeciwciał sprzężonych z kodami kreskowymi PhenoCycler, a także komórki przepływowe do obrazowania całego preparatu. Każdy zestaw wystarcza na 10 eksperymentów PhenoCycler-Fusion. Składa się z jednego podzestawu przechowywanego w temperaturze 4 stopni; C, kolejny przy -20 & C i pakiet 10 komór przepływowych utrzymywanych w temperaturze pokojowej. Podzestaw przechowywany w temperaturze 4 & deg; C zawiera bufor hydracyjny, bufor barwiący, bufor magazynujący, bloker N i bloker J. Podzestaw przechowywany w temperaturze -20 ° C zawiera G Blocker, S Blocker i odczynnik utrwalający.
Zakład T-betSpecyfikacja techniczna #53753
TIM-3 powiedział:CST #72911
Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNazInvitrogen10977015Wymagane do rozpuszczenia kodów kreskowych podczas koniugacji przeciwciał

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schadendorf, D., et al. Melanoma. Lancet. 392 (10151), 971-984 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathol. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Marzagalli, M., Ebelt, N. D., Manuel, E. R. Seminars in cancer biology. 59, 236-250 (2019).
  4. De Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  5. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  6. Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by codex tissue imaging. Front Immunol. 12, 687673(2021).
  7. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  8. Keren, L., et al. Mibi-tof: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Sci Adv. 5 (10), eaax5851(2019).
  9. Lin, J. R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method. Nat Comm. 6 (1), 8390(2015).
  10. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  11. Black, S., et al. Codex multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  12. Aung, T. N., Bates, K. M., Rimm, D. L. High-plex assessment of biomarkers in tumors. Mod Pathol. 37 (3), 100425(2024).
  13. Surwase, S. S., et al. Highly-multiplexed immunofluorescence phenocycler panel for murine ffpe yields insight into tumor microenvironment immunoengineering. Lab Invest. 105 (1), 102165(2024).
  14. Luly, K. M., Green, J. J., Sunshine, J. C., Tzeng, S. Y. Biomaterial-mediated genetic reprogramming of merkel cell carcinoma and melanoma leads to targeted cancer cell killing in vitro and in vivo. ACS Biomater Sci Eng. 9 (11), 6438-6450 (2023).
  15. Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F., Regev, A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 33 (5), 495-502 (2015).
  16. Van Gassen, S., et al. Flowsom: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry Part A. 87 (7), 636-645 (2015).
  17. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 36 (5), 411-420 (2018).
  18. Watson, S. S., et al. Microenvironmental reorganization in brain tumors following radiotherapy and recurrence revealed by hyperplexed immunofluorescence imaging. Nat Comm. 15 (1), 3226(2024).
  19. Greenwald, N. F., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning. Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).
  20. Goldsborough, T., et al. Instanseg: An embedding-based instance segmentation algorithm optimized for accurate, efficient and portable cell segmentation. arXiv. , (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunofluorescenceDNA Barcode ImagingFFPE SpecimensMurine MelanomaSpatial ProteomicsAntibody Panel DesignTissue MicroenvironmentImage Analysis PipelineCell PhenotypingTumor Microenvironment

Related Articles