Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcji prawej komory w eksperymentalnych modelach tętniczego nadciśnienia płucnego

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68248

⸱

27 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pulmonary Investigation, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentacja szczegółowych metod oceny funkcji prawej komory poprawi jakość i wiarygodność badań nad nadciśnieniem płucnym, oferując solidne ramy dla przyszłych badań i zwiększając odtwarzalność w różnych laboratoriach.

Streszczenie

Nadciśnienie płucne (PH) jest przewlekłym schorzeniem związanym ze zmniejszonym przeżyciem, co czyni go krytycznym obszarem badań. Eksperymentalne modele PH znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat jego patofizjologii i ułatwiły projektowanie małych badań obserwacyjnych i klinicznych. Kluczowe znaczenie ma jednak ustanowienie ustandaryzowanych metodologii w celu zapewnienia porównywalności między różnymi badaniami eksperymentalnymi i grupami badawczymi. Standaryzacja nie tylko zwiększa odtwarzalność, ale także sprzyja współpracy między zespołami badawczymi.

W tym filmie przedstawiamy kroki metodologiczne wymagane do dokładnej analizy parametrów funkcjonalnych PH. Obejmują one ocenę echokardiograficzną, inwazyjne nakłucie prawej komory (RV) i obliczenie wskaźnika Fultona. W odniesieniu do echokardiografii szczegółowo przedstawiono pomiar czasu przyspieszenia tętnicy płucnej i współczynnika czasu wyrzutu płucnego, a także obliczanie wydajności RV. Jeśli chodzi o pomiary inwazyjne, opisano podstawowe procedury, w tym protokoły znieczulenia, optymalne ułożenie zwierząt, konfigurację wentylacji mechanicznej, precyzyjne otwieranie ściany klatki piersiowej, wizualizację RV i techniki nakłuwania RV.

Metodologia rozwarstwiania komór (wskaźnik Fultona) jest szczegółowo wyjaśniona, podobnie jak obliczanie stosunku RV do lewej komory do przegrody, skorygowane o masę ciała zwierzęcia. Wierzymy, że szczegółowa prezentacja tych metod poprawi jakość i wiarygodność badań nad pH, oferując solidne ramy dla przyszłych badań i zwiększając odtwarzalność w różnych laboratoriach.

Wprowadzenie

Właściwy pomiar czynnościowy funkcji prawej komory (RV) u małych zwierząt stał się niezbędny ze względu na wzrost liczby badań z wykorzystaniem modeli zwierzęcych w naukach o układzie oddechowym i sercowo-naczyniowym. Istnieje kilka modeli zwierzęcych nadciśnienia płucnego (PH), wykorzystujących monokrotalinę1, hipoksję2 lub Sugen + hipoksję3. Służyły one skutecznie do odkrywania nowych szlaków patofizjologicznych1,4 oraz badania nowych potencjalnych metod leczenia farmakologicznego5 i niefarmakologicznego6 w przypadku PH. Niemniej jednak, niezależnie od czynnika sprawczego prowadzącego do fenotypu PH, istnieją obawy dotyczące pomiaru czynnościowego wydolności RV, głównie dlatego, że funkcja RV zazwyczaj (1) stanowi główny punkt końcowy przyjmowany w badaniach przedklinicznych7; (2) dostępne są różne rodzaje sprzętu do przeprowadzania echokardiografii i inwazyjnej punkcji komory RV; (3) wymagane jest doświadczenie w znieczulaniu i pewna wiedza na temat inwazyjnej wentylacji mechanicznej u małych zwierząt, a także umiejętność rozpoznania odpowiedniego okna do oceny RV.

Zgodnie z zasadą 3R w badaniach przedklinicznych (replacement, reduction, refinement), redukcja (reduction) dąży do rozszerzenia metod pomagających w uzyskaniu porównywalnych poziomów informacji, co zwiększa powtarzalność8. W związku z tym liczba zwierząt w badaniach zostanie ograniczona przede wszystkim dzięki strategiom takim jak odpowiedni projekt doświadczenia, prawidłowa ocena statystyczna oraz wymiana praktyk i wiedzy. W niniejszym badaniu metodologicznym przedstawiono trzy różne techniki stosowane po indukcji PAH (Rycina 1). Pierwszą z nich jest nieinwazyjny pomiar funkcji RV za pomocą echokardiografii przezklatkowej. Obrazy uzyskuje się w przekrojach długiej i krótkiej osi przyściannej. Średnicę drogi odpływu RV, czas przyspieszenia przepływu w tętnicy płucnej (PAT) oraz czas wyrzutu płucnego (PET) ocenia się za pomocą dopplerowskiego pomiaru fali impulsowej. Oblicza się stosunek PAT/PET, który służy jako pośredni wskaźnik nadciśnienia tętniczego płucnego (PAH)9,10. Drugą metodą jest inwazyjna punkcja RV. Zazwyczaj wykorzystuje się system akwizycji danych fizjologicznych, który stale rejestruje dane na komputerze z dedykowanym oprogramowaniem. Inwazyjne ciśnienie skurczowe prawej komory (RVSP) oraz średnie ciśnienie w tętnicy płucnej są często stosowane jako główne punkty końcowe w różnych badaniach7. Trzecią metodą jest wskaźnik przerostu prawej komory, nazywany również wskaźnikiem Fulton'a11, który stanowi stosunek masy RV do sumy masy lewej komory (LV) i przegrody międzykomorowej (S) (RV/LV + S), skorygowany o masę ciała zwierzęcia. Przedstawienie szczegółowych metod oceny funkcji RV podniesie jakość i wiarygodność badań nad PH, oferując solidne ramy dla przyszłych analiz i zwiększając powtarzalność wyników w różnych laboratoriach.

Schemat blokowy procesu modelu nadciśnienia płucnego; obejmuje metody indukcji PAH, ECHO, RVSP oraz indeks RVH.
Rysunek 1: Schemat blokowy. Ilustracja podsumowująca protokoły opisane w niniejszym artykule. Skróty: ECHO = echokardiografia; LV = lewa komora; PAH = nadciśnienie tętnicze płucne; RV = prawa komora; RVH = przerost prawej komory; RVSP = prawokomorowe ciśnienie skurczowe; S = przegroda międzykomorowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyczną ds. Wykorzystania Zwierząt (CEUA) Federalnego Uniwersytetu w Rio de Janeiro w ramach postępowania nr 043/22. Wszystkie procedury były zgodne z Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi oraz Przewodnikiem Narodowej Akademii Nauk USA ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE11.

1. Przygotowanie zwierząt i protokół eksperymentalny

  1. Obliczyć liczbę zwierząt zgodnie z wcześniej opisaną metodą12.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że różnice w RVSP pomiędzy grupą CTRL a PAH osiągnęły wielkość efektu d = 3,95, przy założeniu stosunku wielkości próby równego 1 oraz mocy statystycznej (1-β = 0,8) niezbędnej do zidentyfikowania istotnych różnic (α = 0,05), w niniejszym protokole konieczne było zastosowanie trzech zwierząt na grupę.
  2. Przydzielić losowo (sześć) samców szczurów Wistar (220 ± 10 g) do grupy otrzymującej dożylnie (i.p.) wtryskiwanie monokrotaliny (60 mg/kg; grupa PAH, n = 3) lub roztworu soli fizjologicznej (1 mL/kg; grupa CTRL, n = 3).
  3. W 28. dniu zmierzyć parametry sercowo-naczyniowe, a następnie poddać zwierzęta eutanazji poprzez upuszczenie krwi po przecięciu aorty brzusznej.

2. Echokardiografia

  1. Konfiguracja systemu elektrokardiograficznego
    1. Sprawdź, czy kabel zasilający jest prawidłowo podłączony do urządzenia i gniazda sieciowego. Naciśnij MOC przycisk na panel sterowania przez kilka sekund, aż system się uruchomi.
    2. Upewnij się, że przetwornik jest prawidłowo podłączony.
    3. Wybierz PACJENT z bazy danych, aby zarejestrować identyfikator zwierzęcia aby rozpocząć procedurę.
    4. Wyłącz przetwornik, naciskając przycisk zamrażać przycisk (Równowaga statyczna; diagram ΣFx=0; ilustracja równowagi sił; edukacyjny koncept fizyczny.) na panel sterowania podczas przygotowania zwierzęcia, aby zachować żywotność urządzenia.
  2. Procedura elektrokardiograficzna
    1. Skonfigurować aparat do znieczulenia, ustawiając stężenie izofluranu na 2,5% i przepływ tlenu na 1 L/min.
    2. Umieść zwierzę w komorze aparatury do znieczulania. Po sedacji ułóż zwierzę w pozycji grzbietnej, przymocuj przednie łapy do stołu operacyjnego za pomocą taśmy klejącej i nałóż maskę aparatury do znieczulania na pysk zwierzęcia. Aby zapobiec wybudzeniu zwierzęcia, należy pamiętać o przełączeniu przycisku aparatury do znieczulania z KOMORA do Maska.
      1. Ocenić poziom znieczulenia poprzez ewaluację średnicy, położenia i reakcji źrenic na światło, położenia błony nictytującej oraz ruchu w odpowiedzi na stymulację ogona. Rozpocząć eksperymenty w momencie, gdy ustaną reakcje na bodziec dźwiękowy (klaskanie w dłonie), stymulację wibrysów oraz reakcja na zacisk ogona.13.
    3. Użyj gazy nasączonej wodą z detergentem, aby zwilżyć sierść na klatce piersiowej znieczulonego zwierzęcia. Usuń sierść z klatki piersiowej zwierzęcia za pomocą żyletki zamocowanej w kleszczykach Kelly’ego. Nałóż obfitą ilość żelu przewodzącego na klatkę piersiową zwierzęcia.
    4. Naciśnij 2D przycisk na panel sterowania.
    5. Umieść przetwornik między trzecią a piątą przestrzenią międzyżebrową, aby uzyskać obraz w osi krótkiej. Skieruj przetwornik w stronę lewego barku zwierzęcia (90° kąt względem mostka), wykonując obraz przekroju poprzecznego na poziomie podstawy serca, co pozwala na wizualizację prawej komory (RV), zastawki aorty, zastawki płucnej oraz lewego przedsionka (Rycina 2A).
    6. Naciśnij zamrażać przycisk (Schemat techniki mikroskopowej z elementami optycznymi do analizy emisji i badania dopasowania spektralnego.) na panel sterowania aby zamrozić obraz i nacisnąć przycisk zapisz przycisk (Równowaga statyczna; równanie ΣFx=0; schemat metody; wektory sił; zasady badania równowagi.) na panel sterowania aby zapisać obraz.
    7. Po znalezieniu odpowiedniego kąta należy pozostać w tej pozycji i nacisnąć fala tętna przycisk (PW) na panel sterowania w celu uzyskania trybu spektralnego Dopplera falowego (Rycina 2B).
    8. Użyj trackball na panel sterowania aby przesunąć żółty kursor (w lewo lub w prawo/w górę lub w dół) na ekranie i ustawić go nad zastawką płucną.
    9. Naciśnij pięcioprzyciskowy (5) na panel sterowania aby uzyskać krzywą przepływu krwi przez zastawkę płucną.
      KROK KRYTYCZNY: Aby uzyskać wysokiej jakości obraz, należy upewnić się, że krzywa jest intensywnie biała, a sygnały akustyczne są głośne i wyraźne.
    10. Umieść przetwornik pomiędzy trzecią a piątą przestrzenią międzyżebrową, aby uzyskać obraz w osi długiej. Skieruj przetwornik w stronę prawego barku zwierzęcia (45°-60° kąt w stosunku do mostka), wykonując obraz przekroju podłużnego, który umożliwia wizualizację lewej komory, prawej komory, lewego przedsionka, zastawki mitralnej i zastawki aortalnej (Rysunek 2C).
    11. Naciśnij zamrozić przycisk (Symbol równowagi statycznej, schemat notacji matematycznej, ΣFx=0, edukacja inżynieryjna.) na panel sterowania aby zamrozić obraz i nacisnąć przycisk zapisz przycisk (Równowaga statyczna; równanie ΣFx=0; schemat metody; wektory sił; zasady badania równowagi.) na panel sterowania aby zapisać obraz.
    12. Naciśnij KONIEC EGZAMINU przycisk na panel sterowania aby zakończyć eksperyment i zapisać obrazy w bazie danych pacjentów.
  3. Analiza danych
    1. Konfiguracja systemu elektrokardiograficznego:
      1. Sprawdź, czy kabel zasilający jest prawidłowo podłączony do urządzenia i gniazdka elektrycznego. Naciśnij przycisk MOC przycisk przez kilka sekund, aż system się uruchomi.
      2. Wybierz WYSZUKIWANIE na ekranie i wybrać odpowiedni identyfikator zwierzęcia z bazy danych, aby rozpocząć analizę.
      3. Naciśnij SONOVIEW przycisk na panel sterowaniaKliknij raz w obrębie obrazu na ekranie, aby rozpocząć analizę.
        UWAGA: Obraz jest ograniczony linią przerywaną. Linia ta musi być ciągła po kliknięciu w celu rozpoczęcia analizy.
      4. Używając trackballwybrać obraz w osi krótkiej w trybie spektralnego Dopplera z impulsowaniem w prawym rogu ekranu.
      5. Naciśnij kalkulator przycisk (Wykres chromatogramu sekwencjonowania DNA przedstawiający piki nukleotydowe do analizy sekwencji.) na panel sterowania i wybierz parametr tętno (HR) na ekranie. Przy użyciu trackballumieść linię kursora od szczytu do szczytu dwóch krzywych. Powtórz tę czynność trzy razy, aby uzyskać wartość średnią.
      6. Naciśnij kalkulator przycisk (Chromatografia, rozdział prążków DNA, wyniki elektroforezy, analiza białek, schemat metody.) na panel sterowania; wybierz parametr zastawka pnia płucnego (PV) oraz parametr po czas przyspieszenia przepływu przez zastawkę płucną (PV AccT/ET) na ekranie. Przy użyciu trackballumieść linię kursora od początku do szczytu krzywej. Następnie umieść linię od początku do końca tej samej krzywej. Powtórz tę czynność trzy razy, aby uzyskać wartość średnią (Rycina 3A).
      7. Zapisz dane, naciskając przycisk zapisz przycisk (Równowaga statyczna; równanie ΣFx=0; schemat metody; wektory sił; zasady badania równowagi.) na panel sterowania.
      8. Używając trackballwybierz obraz w osi długiej w prawym rogu ekranu.
      9. Naciśnij kalkulator przycisk (Technika edycji genów, CRISPR-Cas9, metoda modyfikacji DNA, wykorzystywana w badaniach genetycznych, schemat.) na panel sterowania; wybierz parametr droga odpływu prawej komory (RVOT) i parametr po średnica drogi odpływu prawej komory (RVOT DIAM) na ekranie. Używając trackballprzesuń kursor z jednej ściany RV na drugą ścianę. Powtórz tę czynność trzy razy, aby uzyskać wartość średnią (Rycina 3B).
      10. Zapisz obrazy wraz z danymi, naciskając przycisk zapisz przycisk (Równowaga statyczna; równanie ΣFx=0; schemat metody; wektory sił; zasady badania równowagi.) na panel sterowania.
      11. Przenieś obrazy na zewnętrzny dysk twardy. Wybierz WYSZUKIWANIE na ekranie oraz odpowiednie identyfikacja zwierzęcia z bazy danych. Wybierz EKSPORT na ekranie i wybrać zewnętrzny dysk twardy.

Schemat echokardiografii i obrazy USG przedstawiające modele serca myszy w trybach 2D i Doppler.
Rycina 2: Okno parasternalne w echokardiografii przezklatkowej. Schematyczny obraz położenia przetwornika podczas pozyskiwania obrazów w przekroju poprzecznym oraz reprezentatywny obraz osi krótkiej w (A) trybie 2D i (B) trybie spektralnego Dopplera falowego oraz (C) osi długiej. Skróty: Ao = aorta; AV = zastawka aortalna; CTRL = kontrola; LA = lewy przedsionek; LV = lewa komora; MV = zastawka mitralna; PAH = nadciśnienie tętnicze płucne; RA = prawy przedsionek; RV = prawa komora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy ultrasonografii serca przedstawiające przepływ w PV i ocenę RVOT; analiza obrazowania medycznego.
Rycina 3: Analiza danych echokardiografii przezklatkowej. (A) Reprezentatywny obraz pozycji linii przerywanej służącej do obliczenia stosunku PAT/PET oraz (B) reprezentatywny obraz pozycji konektora do analizy średnicy odpływu prawej komory. Skróty: HR = częstośćtętna; PAT = czas przyspieszenia w tętnicy płucnej; PET = czas wyrzutu do tętnicy płucnej; PV AccT = czas przyspieszenia w zastawce płucnej; PV ET = czas wyrzutu w zastawce płucnej; PV AccT/ET = stosunek czasu przyspieszenia do czasu wyrzutu w zastawce płucnej; RVOT Diam = średnica traktu odpływu prawej komory; RVOT Area = pole przekroju traktu odpływu prawej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Ciśnienie skurczowe w prawej komorze

  1. Przygotowanie pomiaru ciśnienia skurczowego prawej komory
    1. Respirator mechaniczny: Ustaw w respiratorze mechanicznym następujące parametry: frakcja tlenu w mieszaninie wdechowej (FiO 2 ), 21%; objętość oddechowa, 8 mL/kg; częstotliwość oddechów, 70 bpm; oraz dodatnie ciśnienie końcowowydechowe (PEEP), 3 cmH2O.
    2. Monitor i przetwornik sygnału: Podłącz zestaw do żyły skórnej 19 G użyty do nakłucia do monitora, aby umożliwić wizualizację ciśnienia.
    3. Procedura zerowania przetwornika ciśnienia wielokanałowego rejestratora fizjologicznego:
      1. Podłącz przetwornik ciśnienia do odpowiedniego kabla hemodynamicznego i kanału monitora wieloparametrowego.
      2. Ustaw zarówno przetwornik ciśnienia, jak i końcówkę kaniuli do żyły skórnej na podobnej wysokości w stosunku do klatki piersiowej zwierzęcia.
      3. Naciśnij przycisk zero na ekranie monitora wieloparametrowego. Przesuwaj kaniulę do żyły skórnej podłączoną do przetwornika ciśnienia w górę i w dół, sprawdzając, czy wartości odpowiednio rosną i maleją.
        KROK KRYTYCZNY: Zestaw do żyły skórnej musi być wypełniony solą fizjologiczną z heparyną, aby zapewnić prawidłową transmisję sygnału. Należy unikać pęcherzyków powietrza w przewodzie, aby zapobiec zakłóceniom sygnału.
    4. Procedura kalibracji przetwornika ciśnienia wielokanałowego rejestratora fizjologicznego: Używając zewnętrznego analogowego sfigmomanometru, sprawdź, czy ciśnienie przyłożone do przetwornika ciśnienia jest zbliżone do wartości widocznej na ekranie monitora wieloparametrowego. Jeśli nie, skoryguj wzmocnienie kanału.
    5. W komputerze z otwartym dedykowanym systemem akwizycji ustaw oprogramowanie:
      1. Otwórz program i kliknij DataAcquisitionSystem na ekranie. Otworzy to okno, w którym można monitorować sygnał ciśnienia.
      2. W tym oknie kliknij białą strzałkę w lewym górnym rogu ekranu.
      3. Pojawi się okno z prośbą o konfigurację; kliknij OK.
      4. W nowym oknie przejdź do sekcji Physical Channel i kliknij Browse.
      5. Używając klawisza CTRL na klawiaturze, zaznacz wszystkie kanały z wyjątkiem „ai7” i kliknij OK.
      6. Poniżej sekcji Physical Channel znajdź Input Terminal Configuration ustawioną na default. Użyj strzałek bocznych, aby zmienić ją na RSE, a następnie kliknij OK.
      7. Otworzy się nowe okno, w którym można sprawdzić akwizycję sygnału i skalibrować linię bazową. Naciśnij Load Configuration, wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny, a następnie naciśnij Load Signals po prawej stronie okna.
      8. Odczekaj 5-10 s do pojawienia się sygnału na ekranie. Gdy będzie widoczny, kliknij Signal 0, wybierz Signal 6, a następnie kliknij Zero Baseline.
      9. Przejdź do katalogu plików i wybierz miejsce, w którym dane będą zapisywane podczas eksperymentu. Kliknij Current Folder w prawym dolnym rogu.
      10. Po ustawieniu wszystkich parametrów w oprogramowaniu kliknij OK. Powróć do głównego okna programu i kliknij Acquire. Program rozpocznie akwizycję sygnału.
      11. W prawym dolnym rogu wybierz sygnał zgodnie z konfiguracją (sygnał 6).
        UWAGA: Upewnij się, że sygnał na monitorze komputera odpowiada sygnałowi na monitorze przetwornika i fluktuuje podczas przesuwania zestawu do żyły skórnej. W przeciwnym razie wyeliminuj usterki transmisji sygnału przed kontynuacją.
  2. Procedura pomiaru ciśnienia skurczowego prawej komory
    1. Po echokardiografii podaj do jamy otrzewnej (i.p.) kombinację 87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny w celu znieczulenia zwierzęcia.
    2. Po sedacji zwierzęcia podaj 400 µL lidokainy podskórnie (s.c.) w okolicy tchawicy.
  3. Tracheotomia
    1. Po sedacji zwierzęcia umieść je w pozycji na plecach i przymocuj przednie łapy taśmą klejącą do stołu operacyjnego na źródle ciepła w celu utrzymania temperatury ciała (np. podgrzewany stół chirurgiczny).
    2. Oczyść obszar gardła 70% alkoholem. Następnie użyj gazy z detergentem i wodą, aby zwilżyć sierść na gardle znieczulonego zwierzęcia. Wygol sierść z gardła zwierzęcia za pomocą żyletki przymocowanej do kleszczy Kelly.
    3. Wykonaj nacięcie skóry, używając pęsety tkankowej z ząbkami i nożyczek.
    4. Obnaż tchawicę, odsuwając gruczoł podżuchwowy i wykonując tępą dyssekcję mięśni otaczających za pomocą pęsety tkankowej z ząbkami i zakrzywionych kleszczy Kelly.
    5. Ostrożnie przeprowadź nić chirurgiczną pod tchawicą, używając zakrzywionych kleszczy Kelly.
    6. Używając wolnych końców nici, delikatnie unieś tchawicę dla lepszej wizualizacji i wykonaj niewielkie nacięcie między dwoma pierścieniami chrzęstnymi za pomocą ostrza skalpela. Zachowaj ostrożność przy pierścieniach chrzęstnych, aby nie przeciąć krtani.
    7. Delikatnie wprowadź kaniulę do tracheotomii skośnym końcem skierowanym w dół, a po prawidłowym ustawieniu skieruj ją w górę, wprowadzając do około pięciu pierścieni, lecz nie głębiej.
      UWAGA: Jeśli w kaniuli do tracheotomii znajduje się śluz, należy go odessać strzykawką przed podłączeniem do respiratora mechanicznego.
    8. Zabezpiecz kaniulę nicią chirurgiczną, upewniając się, że pozostaje na miejscu.
    9. Podaj 2 mg/kg bromku pancuronium w celu sparaliżowania mięśni zwierzęcia.
      UWAGA: Bromek pancuronium można wstrzyknąć dożylnie przez cewnik w żyle ogonowej lub doprzewnowkowo.
    10. Podłącz zwierzę do respiratora mechanicznego, przetestowanego i skonfigurowanego w trybie wentylacji objętościowej.
    11. Po wykonaniu tracheotomii i podłączeniu zwierzęcia do respiratora przystąp do obnażenia serca.
  4. Kaniulacja
    1. Oczyść obszar klatki piersiowej 70% alkoholem. Następnie użyj gazy z detergentem i wodą, aby zwilżyć sierść na klatce piersiowej znieczulonego zwierzęcia. Wygol sierść z klatki piersiowej zwierzęcia za pomocą żyletki przymocowanej do kleszczy Kelly.
    2. Aby otworzyć jamę klatki piersiowej, wykonaj nacięcie skóry od podstawy wyrostka mieczowatego, kończąc około 0,5 cm poniżej miejsca tracheotomii.
    3. Przetnij mięśnie międzyżebrowe wewnętrzne i zewnętrzne, aby obnażyć żebra i mostek.
    4. Obnaż serce, przecinając mostek nożyczkami, i użyj kleszczy Kelly do odciągnięcia każdej strony jamy klatki piersiowej dla lepszego dostępu do RV (prawej komory).
      UWAGA: Zawsze tnij wzdłuż mostka, aby zminimalizować nadmierne krwawienie, które mogłoby upośledzić widoczność.
    5. Serce jest przykryte osierdziem. Usuń tę cienką błonę za pomocą pęsety, aby można było zróżnicować komory serca.
    6. Po wykonaniu tracheotomii, podłączeniu zwierzęcia do respiratora i obnażeniu serca przystąp do nakłucia prawej komory.
    7. Przed oceną RVSP upewnij się, że komputer jest włączony, program LabView jest otwarty, a linia bazowa skonfigurowana do akwizycji sygnału. Zlokalizuj RV, używając jako punktu odniesienia gałęzi międzykomorowej tętnic wieńcowych. Gałąź ta jest widoczna i wskazuje położenie przegrody międzykomorowej oddzielającej prawą i lewą komorę.
    8. W oprogramowaniu zweryfikuj, czy rozpoczęto akwizycję sygnału. Kliknij przycisk save na ekranie i wprowadź identyfikator zwierzęcia.
    9. Używając zestawu do żyły skórnej 19 G wypełnionego solą fizjologiczną z heparyną, wykonaj nakłucie nieco powyżej punktu odniesienia, upewniając się, że igła nie została wprowadzona zbyt głęboko.
      KROK KRYTY CNY: Zbyt głębokie wprowadzenie igły może spowodować nakłucie lewej komory, co doprowadzi do uzyskania wartości ciśnienia niezwiązanych z tętnicą płucną.
    10. Zweryfikuj dokładność nakłucia na podstawie uzyskanych wartości ciśnienia: RVSP u zwierząt kontrolnych wynosi 10-20 mmHg; RVSP u zwierząt z nadciśnieniem tętniczym płucnym wynosi do 60 mmHg; ciśnienie uzyskane >80 mmHg wskazuje, że kaniula prawdopodobnie dotarła do lewej komory (Rysunek 4B).
    11. Zarejestruj co najmniej 10 stabilnych szczytów fali ciśnienia, aby zapewnić wiarygodność danych.
    12. Po zakończeniu akwizycji sygnału podaj zwierzęciu heparynę w celu pobrania krwi poprzez nakłucie lewej komory lub żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki z heparyną.
      UWAGA: Heparynę można wstrzyknąć dożylnie przez cewnik w żyle ogonowej lub bezpośrednio do lewej komory.
    13. Po pobraniu krwi utul zwierzę poprzez upuszczenie krwi poprzez przecięcie żyły głównej dolnej i przystąp do pobrania organów do dalszych analiz.
    14. Zapisz sygnał w katalogu plików wybranym na początku eksperymentu. Prześlij obrazy na zewnętrzny dysk twardy, zaznaczając pliki w folderze komputera i wykonując kopiuj/wklej plików .bin na zewnętrzny dysk twardy.

4. Analiza danych

UWAGA: Sprawdź kod rutynowy użyty w programie MATLAB do analizy sygnału przetwornika dla RVSP (Supplemental File 1). Został on opracowany na podstawie potrzeb niniejszego projektu badawczego.

  1. Otwórz program, kliknij przycisk przeglądaj pastę (Ikona folderu ze strzałką wskazującą proces pobierania lub transferu.) na ekranie MATLAB i wybierz z wewnętrznego dysku twardego komputera plik zawierający odpowiedni kod.
  2. W lewym górnym rogu ekranu MATLAB zapoznaj się z listą plików zawierających kody dla każdego kanału rozpoznanego przez przetwornik.
  3. Wybierz kod dla konfiguracji kanału, która została wybrana na początku eksperymentu w celu wykrycia sygnału (kanał 6).
  4. Naciśnij przycisk uruchom (ikona przycisku odtwarzania dla wideo lub audio) i wybierz z zewnętrznego dysku twardego plik .bin do analizy.
    KROK KRYTYCZNY: W prawym dolnym rogu zmień typ archiwum z Wszystkie pliki MATLAB na Wszystkie pliki, w przeciwnym razie pliki .bin nie będą widoczne.
  5. Wybierz najlepszy obszar krzywej, klikając raz na początku i raz na końcu. Najlepszy obszar to ten z najbardziej jednorodnymi krzywymi, w których szczyty i doliny są wizualnie równe (Rycina 4A).
  6. Wybierz 10 s krzywej, klikając raz na początku (0 s) i raz na końcu (10 s) (Rycina 4A).
    UWAGA: Oś X reprezentuje czas w sekundach, a oś Y reprezentuje ciśnienie w mmHg.
  7. Skoryguj linię bazową, odejmując najniższą wartość doliny w oknie poleceń i naciskając klawisz ENTER na klawiaturze. Oprogramowanie generuje wszystkie dane automatycznie (Rycina 4A).
  8. Zapoznaj się z danymi przedstawionymi w dwóch kolumnach; pierwsza to czas wystąpienia szczytu, a druga to wartość szczytu (ciśnienie).
    UWAGA: Krzywe uzyskane z nakłucia reprezentują ciśnienia skurczowe (szczyt) i rozkurczowe (dolna wartość) prawej komory (RV). Analiza w MATLAB przedstawia obie wartości.
  9. Skopiuj i wklej dane ciśnienia skurczowego do pliku .txt i usuń wartości odnoszące się do czasu.
  10. Zmień wszystkie kropki na przecinki w pliku .txt, aby móc obliczyć średnią.
  11. Wybierz 10 wartości ciśnienia szczytowego i oblicz z nich średnią.

Etapy przetwarzania sygnału w programie MATLAB; wykresy w dziedzinie czasu; metoda analizy redukcji szumów.
Rycina 4: Analiza danych ciśnienia skurczowego w prawej komorze. (A) Reprezentatywne obrazy etapów wyboru obszarów krzywej podczas analizy. (B) Przykład krzywej wykazuje szczyt wynoszący około 80 mmHg, co wskazuje, że nakłucie było wystarczająco głębokie, aby dotrzeć do lewej komory. Po płynnym wycofaniu igły dotarto do jamy prawej komory. Można to zauważyć na krzywej pojawiającej się w pierwszym kroku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Wskaźnik przerostu prawej komory

  1. Procedura
    1. Na początku protokołu eksperymentalnego zmierz masę ciała zwierzęcia.
    2. Po pomiarze RVSP poddaj zwierzę eutanazji poprzez upuszczenie krwi i wyjmij narządy z jamy klatki piersiowej en bloc, aby wyizolować serce uśpionego zwierzęcia.
    3. Wypreparuj naczynia u podstawy serca (aortę, tętnicę płucną, żyłę główną i żyły płucne).
      KROK KRYTYCZNY: Należy uważać, aby nie usunąć uszek prawego i lewego przedsionka.
    4. Osusz serce gazą i zapisz masę całego suchego serca zmierzoną na wadze precyzyjnej.
    5. Wypreparuj lewy i prawy przedsionek, a następnie je odrzuć.
    6. Oddziel prawą komorę (RV) od lewej komory (LV) wraz z przegrodą (S).
    7. Osusz gazą każdy wypreparowany element i zapisz oddzielnie masę RV oraz LV + S zmierzoną na wadze precyzyjnej.
  2. Analiza danych
    1. Oblicz wskaźnik hipertrofii prawej komory jako wskaźnik Fultony, który pozwala na ocenę przerostu RV poprzez porównanie masy wolnej ściany RV z masą ścian LV + S skorygowaną o masę ciała:
      Wzór wskaźnika Fultony, masa RV podzielona przez masę LV + S, podzielone przez całkowitą masę ciała, fizjologia.
      UWAGA: Wskaźnik Fultony u zwierząt kontrolnych wynosi do 0,4 mg; wskaźnik Fultony u zwierząt z PAH wynosi >0,4 mg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do analiz statystycznych każda zmienna została poddana testowi normalności i wariancji za pomocą testu Shapiro-Wilka. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe. Do porównania stężeń cząstek w grupie kontrolnej (CTRL) i grupie z nadciśnieniem tętniczym płuc (PAH) zastosowano nieparowany test t (p<0,05).

Zmiany echokardiograficzne w modelu zwierzęcym PAH
Rysunek 4 pokazuje, że stosunek PAT/PET był niższy u zwierząt z P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

TNP jest postępującą chorobą charakteryzującą się nadmierną przebudową naczyń krwionośnych, która sprzyja wzrostowi oporu naczyniowego płuc, co skutkuje zwiększonym obciążeniem następczym RV14. W związku z tym RVSP stanowi zmienną funkcjonalną, która bezpośrednio koreluje z ciężkością WWA15. Z biegiem czasu reakcją adaptacyjną RV jest kompensacyjny przerost koncentryczny (mierzony wskaźnikiem Fultona)16 i rozszerzenie komór (mierzone średnicą odpływu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu André Benedito da Silva za wsparcie w eksperymentach, Pani Verônice Cristina dos Santos za opiekę nad zwierzętami oraz Pani Lornie O'Brien za korektę gramatyki angielskiej. Badanie to było wspierane przez Państwową Fundację Badawczą w Rio de Janeiro (FAPERJ E-26/202.766/2018, E-26/010.001488/2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Alcohol 70%CzarnogóraALC70-001
Żel przewodzącyMercorCG-002
Roztwór soli fizjologicznej (NaCl 0,9%)BioPharmaSAL-009
Instruments
19 G zestawżył skóry głowyDescarpackSVS-19G
Zakrzywione kleszcze kellyABC instrumentos cirurgicosCKF-003
Kleszcze KellyABC instrumentos cirurgicosKF-004
Igły (18, 22 i 26 G)DescarpackNDL-MIX
szalka PetriegoGlassLabPD-150
ŻyletkaABC instrumentos cirurgicosRB-005
SkalpelABC instrumentos cirurgicosSC-006
NożyczkiABC instrumentos cirurgicosSCIS-007
Linia do szwówABC instrumentos cirurgicosSUT-008
Strzykawki (1, 3 i 5 ml)DescarpackSYR-135
Kaniula tracheostomijnaPęseta MedTechTC-010
ABC instrumentos cirurgicosTWZ-011
Drugs
Dextroketamina chlorowodorek 5%Cristá liaDXT-00587,5 mg/kg dootrzewnowy
Izofluran 1 ml/ml 240 mLCrist&aaostry; liaISO-2402,5% roztwór do inhalacji
Chlorowodorek lidokainy 1%Cristá liaLID-001400 &mikro; L podskórnie miejscowo
MonocrotalineSigma-AldrichC240160 mg/kg dootrzewnowy
bromek Pancuronium 2 mg/mlCrist&aaacute; liaPAN-0022 mg/kg dożylnie
Heparyna sodowa 5000 j.m./mlCrist&aaostry; liaHEP-5000rozcieńczony 1:4 w 1 ml
chlorowodorku ksylazyny 2%SyntecXYL-00212,5 mg/kg dootrzewnowo
Sprzęt
GraphPad Prism 9 GraphPadSoftware, IncGP9
Sieciowy wieloparametrowy monitor weterynaryjny LifeWindow 9xDigicare Zdrowie zwierzątLW9x
Oprogramowanie LabViewNational Instruments, Corp.Oprogramowanie LV-2019
MATLAB R2019a (wersja)MathWorks, Inc.MATLAB-2019
Monitor i przetwornik sygnałuMedTechMST-015
Waga precyzyjnaSartoriusPS-020
R540 Myszy& Maszyna do znieczulenia szczurówRWD Life Schience Co., LTDR540-ANA
ScaleOhausSCL-025
Wentylator mechaniczny Servo-i Getinge ABSERVO-IFiO2 = 21%; objętość oddechowa = 8 ml/kg, częstość oddechów = 70 uderzeń na minutę i PEEP = 3 cmH2O
Oprogramowanie SonoViewSystem SONOTEC Ultraschallsensorik Halle GmbHSV-2020
UGEO HM70A Samsung Eletrô nica da Amazô nia LTDAHM70A
G*Power 3.1.9.7Uniwersytet Dü sseldorf, Niemcygpower

Bibliografia

  1. Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
  2. Zhu, Z., et al. Echocardiographic assessment of right ventricular function in experimental pulmonary hypertension. Pulm Circ. 9 (2), 2045894019841987(2019).
  3. Bikou, O., Sassi, Y. The sugen/hypoxia rat model for pulmonary hypertension and right heart failure. Methods Mol Biol. 2803, 163-172 (2024).
  4. Hill, N. S., Gillespie, M. N., McMurtry, I. F. Fifty years of monocrotaline-induced pulmonary hypertension: What has it meant to the field. Chest. 152 (6), 1106-1108 (2017).
  5. Santos, R. T., et al. Pharmacological agents and potential new therapies in pulmonary arterial hypertension. Curr Vasc Pharmacol. 22 (3), 155-170 (2024).
  6. Tsai, J., Malik, S., Tjen, A. L. S. C. Pulmonary hypertension: Pharmacological and non-pharmacological therapies. Life (Basel). 14 (10), 1265(2024).
  7. Suen, C. M., et al. Regenerative cell therapy for pulmonary arterial hypertension in animal models: a systematic review. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 75(2019).
  8. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
  9. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circ Cardiovasc Imaging. 3 (2), 157-163 (2010).
  10. Trittmann, J. K., et al. PATET ratio by Doppler echocardiography: noninvasive detection of pediatric pulmonary arterial hypertension. Pediatr Res. 92 (3), 631-636 (2022).
  11. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Cereb Blood Flow Metab. 40 (9), 1769-1777 (2020).
  12. Lisboa Braga, C., et al. Therapeutic effects of hypoxia-preconditioned bone marrow-derived mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles in experimental pulmonary arterial hypertension. Life Sci. 329, 121988(2023).
  13. Heil, L. B. B., et al. The effects of short-term propofol and dexmedetomidine on lung mechanics, histology, and biological markers in experimental obesity. Anesth Analg. 122 (4), 1015-1023 (2016).
  14. Humbert, M., et al. ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Heart J. 43 (38), 3618-3731 (2022).
  15. D'Alto, M., et al. Right heart catheterization for the diagnosis of pulmonary hypertension. Heart Fail Clin. 14 (3), 467-477 (2018).
  16. Fulton, R. M., Hutchinson, E. C., Jones, A. M. Ventricular weight in cardiac hypertrophy. Br Heart J. 14 (3), 413-420 (1952).
  17. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (3), 233-270 (2015).
  18. Stenmark, K. R., Meyrik, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
  19. Mukherjee, M., et al. Guidelines for the echocardiographic assessment of the right heart in adults and special considerations in pulmonary hypertension: Recommendations from the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 38 (3), 141-186 (2025).
  20. Spyropoulos, F., et al. Echocardiographic markers of pulmonary hemodynamics and right ventricular hypertrophy in rat models of pulmonary hypertension. Pulm Circ. 10 (2), 2045894020910976(2020).
  21. Rajaram, S., et al. Comparison of the diagnostic utility of cardiac magnetic resonance imaging, computed tomography, and echocardiography in assessment of suspected pulmonary arterial hypertension in patients with connective tissue disease. J Rheumatol. 39 (6), 1265-1274 (2012).
  22. Chin, K. M., et al. Association of N-terminal pro brain natriuretic peptide and long-term outcome in patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 139 (21), 2440-2450 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadciśnienie płucneocena echokardiograficznanakłucie prawej komorywskaźnik Fultonaprzyspieszenie w tętnicy płucnejczas wyrzutu płucnegoprzerost prawej komorypomiary hemodynamicznedyssekcja komory
Ocena funkcji prawej komory w eksperymentalnych modelach tętniczego nadciśnienia płucnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.