Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie to wprowadza szybką, opłacalną i wydajną metodę ksenoprzeszczepu in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, obejmującej zarówno linie komórek B, jak i komórek T. Korzystając z zapłodnionych zarodków kurczaków, wstrzyknęliśmy komórki B-ALL i T-ALL pochodzące od pacjenta do układu naczyniowego zarodków 11 dni po zapłodnieniu (11dpf). Co ciekawe, cztery dni po wstrzyknięciu przeszczepione ludzkie komórki białaczki wykazywały znaczną przeżywalność, proliferację i kolonizację naczyń krwionośnych w rozwijającym się zarodku kurczaka. Do 15dpf wykryliśmy znaczny wzrost komórek B-ALL CD10/CD19+ i T-ALL CD4/CD8+ w próbkach krwi z układu naczyniowego zarodka, potwierdzając pomyślne wszczepienie. System ten ułatwia wydajną i powtarzalną ocenę zachowania komórek białaczkowych w żywym organizmie bez znacznych kosztów i ograniczeń etycznych związanych z innymi modelami zwierzęcymi. To szybkie podejście zapewnia wysokowydajną i biologicznie istotną platformę in vivo do oceny potencjalnych związków terapeutycznych. Zaprezentowany tutaj system in ovo patient-derived xenograft (PDX)-ALL oferuje obiecujące narzędzie do przedklinicznych badań przesiewowych leków, badań mechanistycznych i potencjalnie do spersonalizowanych podejść medycznych w badaniach nad białaczką.
Wprowadzenie
Błona kosmówkowo-omoczniowa pisklęcia (CAM) zaczyna nabierać kształtu w 7 dniu po zapłodnieniu po inkubacji i jest gotowa do 12 dnia. CAM znajduje się w centrum uwagi jako odpowiedni model in vivo do angiogenezy1 i wszczepiania komórek nowotworowych 2,3,4,5,6,7,8,9,10, w szczególności komórek nowotworowych związanych z krwią 11, ponieważ jest z natury z niedoborem odporności i ma dobrze rozwinięte unaczynienie. Co więcej, CAM jest również pożądanym systemem do badania inwazji guza i przerzutów, ponieważ przenosi szereg białek macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym kolagen, integrynę αVβ3, fibronektynę, lamininę i metaloproteinazę macierzy-2 (MMP-2)10.
Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) to nowotwór szpiku kostnego i krwi, który charakteryzuje się szybkim wzrostem liczby niedojrzałych limfocytów B i T. Jest to najbardziej rozpowszechniony nowotwór dziecięcy i główna przyczyna zgonów z powodu raka wśród dzieci. ALL jest uleczalna u >85% dotkniętych nią dzieci, ale dorośli i niemowlęta mają znacznie niższe wskaźniki wyleczeń, a nawrotowa/oporna na leczenie ALL ma 5-letnie przeżycie wynoszące <10%12. W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowych strategii leczenia w celu zapobiegania nawrotom lub oporności na leczenie ALL lub ich zatrzymania. Chociaż opracowano wiele modeli ksenoprzeszczepów, takich jak mysz i szczur13, metody te są czasochłonne (np. miesiące) i kosztowne oraz wymagają kompleksowych regulacji etycznych. Aby sprostać niezaspokojonym potrzebom klinicznym w zakresie nowatorskiej terapii ALL, konieczne jest opracowanie powtarzalnego, efektywnego czasowo i kosztowo modelu zwierzęcego, który mógłby rozszerzyć podstawowe badania in vitro .
W tym badaniu informujemy o pomyślnym ustanowieniu protokołu ksenoprzeszczepu in ovo , który niezawodnie wytwarza 3D kolonizację naczyń krwionośnych komórek B i T-ALL pacjenta, co jest potencjalnie wykorzystywane do projektowania nowej terapii, która może zatrzymać postęp ALL oraz do opracowania narzędzia predykcyjnego dla wyników leczenia ALL i ryzyka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przeprowadzono w oparciu o protokół zatwierdzony przez Komitet Etyki Uniwersytetu w Calgary (REB15-1143; w którym uzyskano świadomą zgodę od WSZYSTKICH uczestników) oraz Radę Etyki Badań Zdrowotnych Komitetu ds. Raka Alberty (HREBA. CC-17-0108_REN8). Do badania włączono pacjentów z ALL w momencie rozpoznania (przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii), u których występowały krążące blasty (wybuchy nie tylko w szpiku, ale także we krwi). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Inkubacja jaj
- Zaopatrz się w zapłodnione jaja kurze. Zdobądź ~10% więcej jaj niż jest to potrzebne, aby wziąć pod uwagę liczbę jaj uszkodzonych podczas transportu lub procedury krakingu.
- Zapłodnione jaja należy przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 12 °C, nie tracąc przy tym zdolności do życia.
- Przenieś jaja do nawilżonego (~50%-60%) inkubatora rolkowego w temperaturze 39 °C.
- Wysiaduj jaja w inkubatorze przez 10 dpf. Należy pamiętać, że dzień 1 rozpoczyna się w momencie przeniesienia jaj do inkubatora.
2. Izolacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z próbek krwi od pacjentów z ALL
- Wyizolować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem14,15.
- Zbierz 10 ml krwi obwodowej (lub szpiku) od pacjentów z B- i T-ALL do heparynizowanych probówek.
- Przenieść próbki krwi do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i rozcieńczyć trzykrotnie 2 objętościami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4.
- Nałożyć 1 objętość rozcieńczonych próbek krwi na 1 objętość pożywki o gradifikacji gęstości i odwirować w temperaturze pokojowej bez hamulca przy 300 x g przez 30 minut.
- Pobrać warstwę kożucha komórek jednojądrzastych (MNC) z granicy faz i przenieść ją do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety.
- Dodać 10 ml 1x PBS i wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pozostałe składniki surowicy (powtórz ten krok dwukrotnie).
- Dodać 2 ml 0,8% NH4Cl do osadu komórkowego, delikatnie wirować, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut, aby zlizować czerwone krwinki (w razie potrzeby powtórz ten krok).
- Umyj komórki w 1x PBS zgodnie z opisem w kroku 2.6.
- Ponownie zawiesić komórki w RPMI 1640 zawierającym 10% FBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego.
- Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej (10% DMSO w FBS), zamrozić je w temperaturze -80 °C i przechowywać w ciekłym azocie.
3. Amplifikacja lentiwirusa 2. generacji niekompetentnego replikacji przenoszącego mCherry
- Wysiew HEK293T ludzkich embrionalnych komórek nerkowych przy zbiegu ~60%-70% do 6-dołkowej płytki zawierającej DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
- Kotransfekcja komórek (1,5 x 106) za pomocą transferu FUW-Luc-mCherry-puro, opakowania pCMVΔr8,91 i wektorów obwiedni pVSV-G w stosunku 3:2:1 przy użyciu Lipofectaminy 3000 przez 2 dni.
- Zebrać supernatant zawierający lentiwirusa i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.
- Przenieść oczyszczony supernatant wirusowy do probówek wirówkowych, odwirować przy 20 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS lub pożywce wolnej od surowicy.
- Zmierz wielokrotność infekcji (MOI) za pomocą zestawu do miana lentiwirusa qPCR.
4. Znakowanie stale rosnących linii komórkowych ALL i komórek ALL pochodzących od pacjenta za pomocą mCherry
- Płytka 1 x 106 komórek/ml linii komórkowych B-(SEM) i T-ALL (MOLT3)16,17 oraz komórki B- lub T-ALL pochodzące od pacjenta na płytkach 6-dołkowych zawierających RPMI 1640 + 10% FBS.
- Zakażone komórki 300 μl preparatu lentiwirusowego o mianie wirusa 3,47 x 106 IU/ml w celu uzyskania MOI 1 na 1 x 106 komórek, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.
- Dodaj 1 μg/ml puromycyny do pożywki hodowlanej, aby wybrać stabilnie transdukowane komórki przez 2 dni.
- Wizualizuj komórki znakowane mCherry za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
5. Szczepienie ksenograficzne in ovo
- W dniu 10 (patrz powyżej sekcja dotycząca inkubacji jaj) zbadaj unaczynienie zarodków piskląt pod światłem, aby ocenić żywotność zarodka. Następnie delikatnie umyj jajka 70% etanolem, aby wysterylizować powierzchnię.
- Wwiercić się w komórkę powietrzną jaj, aby utworzyć małe (~2,0 cm średnicy) okienko za pomocą wiertarki ręcznej.
- Uszczelnić przezroczystą taśmą klejącą i umieścić z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 .
- W dniu 11 wstrzyknij 1 x 107 mKomórki ALL znakowane wiśnią do naczyń krwionośnych rozwijających się zarodków za pomocą igieł 34 G. Należy zauważyć, że okazało się, że trudno jest potwierdzić, czy WSZYSTKIE komórki zostały wstrzyknięte w identyczne miejsca w różnych zarodkach, ponieważ otwarcie okna w tych samych miejscach nie jest gwarantowane.
- Uszczelnij okna przezroczystą taśmą klejącą, wróć do inkubatora o stężeniu 5% CO2 i codziennie monitoruj żywotność zarodka.
- W 15 dniu wypreparuj naczynia krwionośne z zarodków, umieść je na szklanych szkiełkach i sfotografuj udane ksenoprzeszczepy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w zdolności fluorescencyjne.
UWAGA: Powyżej 15dpf (ponieważ pióra pokrywają całe ciało, a białko prawie zniknęło), należy przeprowadzić immunohistochemię, aby ocenić zmiany w proliferacji i kolonizacji WSZYSTKICH komórek w unaczynieniu zarodka pisklęcia.
6. Cytometria przepływowa
- W dniu 15 pobrać krew z układu naczyniowego zarodka kurczaka za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o sile 32 G, przenieść ją do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej heparynę i odwirować przy 226 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant (osocze) i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x PBS zawierającym 1% BSA (albumina surowicy bydlęcej).
- Wykonaj kroki 2.7 i 2.8, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek.
- Znakować komórki B-ALL ludzkimi przeciwciałami FITC-CD10 i ludzkimi przeciwciałami PE-CD19 oraz komórkami T-ALL odpowiednio ludzkimi przeciwciałami FITC-CD4 i ludzkimi przeciwciałami PE-CD8 w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 min.
- Przepłukać znakowane komórki dwukrotnie PBS zawierającym 1% BSA, odwirować przy 226 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 1x PBS i przeanalizować metodą cytometrii przepływowej.
- Ustaw napięcie rozproszenia w przód (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) odpowiednio na 400 V i 360 V. Dostosuj wzmocnienia detektora dla kanałów FITC i PE odpowiednio na 450-500 V i 400-450 V.
UWAGA: Strategia bramkowania: (a) bramkowanie z rozproszeniem światła (FSC vs. SSC): użyj FSC-A vs. SSC-A do identyfikacji populacji z pośrednim rozproszeniem do przodu (wielkość) i niskim rozrzutem bocznym (ziarnistość), co odpowiada regionowi limfoblastów. Należy pamiętać, że ten krok pomaga wykluczyć zanieczyszczenia i bardziej ziarniste komórki, takie jak monocyty lub granulocyty; b) wybór podkoszulka (FSC-H vs. FSC-A): wykonaj dyskryminację dubletową poprzez bramkowanie na FSC-H vs. FSC-A, zapewniający, że analizowane są tylko zdarzenia z pojedynczej komórki18. - Określ ilościowo komórki C-ALL CD10/CD19+ B-ALL i CD4/CD8+ T-ALL, zliczając zdarzenia w ćwiartce 2 (Q2; FITC/PE+) FITC vs. Działki PE18. Present oznacza ± SEM trzech niezależnych eksperymentów (n = 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ustalić, czy wszczepienie ludzkich komórek ALL w rozwijające się zarodki kurczaka zakończyło się sukcesem, amplifikowano lentiwirus 2. generacji z niekompetentną replikacją przenoszący mCherry i wykorzystano je do znakowania linii komórkowych B- i T-ALL, SEM i MOLT316,17, odpowiednio. Jak pokazano na rysunku 1A, ~ 50% komórek B - (lewy górny lewy panel) i T - (prawy górny róg dwa panele) WSZYSTKIE komórki były oznaczon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zidentyfikowano trzy kluczowe etapy ksenoprzeszczepuin ovo w celu zapobieżenia skażeniu mikrobiologicznemu i maksymalizacji przeżywalności zarodków kurczaków: tj. (1) sterylizacja powierzchni skorupki jaja 70% etanolem przed wykonaniem okienka oraz (2) szczelne uszczelnienie okienka skorupki jaja taśmą wiolonczelową, aby zapobiec parowaniu zawartości zarodka kurzego podczas inkubacji, oraz (3) użycie cienkiej igły (np. 34 G) i wstrzyknięcie WSZYSTKICH komórek w minimalnej objętości (np. 100 μL) w celu zapewnien...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy dr Andrew Kungowi z Columbia University za udostępnienie FUW-Luc-mCherry-puro. Prace te były wspierane przez granty CIHR (PJT-174983) dla KYL oraz z National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) do KYL i M-YJ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igły 34 G | BD Perisafe | ||
| Cytometr przepływowy Attune NxT | Rybak termiczny | ||
| Strzykawka BD Perisafe (32 g) | BD Perisafe | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Millipore Sigma | A9647 (wersja angielska) | |
| Pożywka do zamrażania komórek | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Wirówka (Wirówka Allegra X-22R) | Beckman Coulter | ||
| Rękawiczki jednorazowe | Rękawice diagnostyczne nitrylowe Royal Touch300 | ||
| Mikroskop preparacyjny | Leica MZ16FA | ||
| DMEM (DMEM) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Zobacz materiał D12345 | |
| Inkubator do jaj, inkubator rolkowy Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Alkohol etylowy (95%) | VWR Polska | BDH1158-4LP | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Roztwór Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MiliporeSigma | Przekaźnik GE17-1440-02 | |
| Przeciwciało FITC-CD10 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-46656 FITC | |
| Przeciwciało FITC-CD4 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-19641 FITC | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Mikrosystemy Leica | ||
| Wiertarka ręczna (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, WIRGINIA, STANY ZJEDNOCZONE | CRL-3216 | |
| Hemocytometr | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń | Millipore Sigma | Zobacz materiał H3149 | |
| Probówki heparynizowane | Odkurzacz BD | BD 366480 | |
| Lipofektamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Zestaw miana multipleksowego lentiwirusa (zestaw miana lentiwirusa qPCR) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ amonowy | Millipore Sigma | A9434 (wersja angielska) | |
| Mikroskop odwrócony Olympus IX71 | Olympus | ||
| Przeciwciało PE-CD19 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-19650 PE | |
| Przeciwciało PE-CD8 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-1177 PE | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma | Zobacz materiał P3813 | |
| Pipety (regulowana objętość) | Eppendorf powiedział: | ||
| Puromycyna | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| Silnik RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Taśma klejąca do wiolonczeli | 3 mln | ||
| Sterylne płytki 6-dołkowe | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Sterylne probówki wirówkowe | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Sterylne kolby hodowlane (75T) | VWR Polska | 10062-872 | |
| Sterylne probówki Falcon (15 ml) | SARSTEDT (w języku angielskim) | 62.554.502 | |
| Sterylne probówki Falcon (50 ml) | SARSTEDT (w języku angielskim) | 62.547.254 | |
| Filtr sterylny (0,45 &mikro; m filtr) | VWR Polska | 76778-974 | |
| Sterylne kleszcze | VWR Polska | 82027-404 | |
| Szkiełka podstawowe sterylne | VWR Polska | 48300-031 | |
| Sterylne końcówki do pipet | VWR Polska | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Sterylne strzykawki | Strzykawka BD | 309628? | |
| Błękit trypanowy | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Zobacz materiał T10282 |
Bibliografia
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (5), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK activity as a determinant of tumor growth and dormancy: Regulation by p38. Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M. L., et al. The CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Li, M., et al. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. J Vis Exp. (104), e52411(2015).
- Pontel, L. B., et al. Acute lymphoblastic leukemia necessitates GSH-dependent ferroptosis defenses to overcome FSP1-epigenetic silencing. Redox Biol. 102408, (2022).
- Oriol, A., et al. Outcome after relapse of acute lymphoblastic leukemia in adult patients included in four consecutive risk-adapted trials by the PETHEMA Study Group. Haematologica. 95 (4), 589-596 (2010).
- Xin, Q., Chen, Z., Wei, W., Wu, Y. Animal models of acute lymphoblastic leukemia: Recapitulating the human disease to evaluate drug efficacy and discover therapeutic targets. Biochem Pharmacol. 198, 114970(2022).
- Gilmore, M. J., Prentice, H. G., Blacklock, H. A., Janossy, G., Hoffbrand, A. V. A technique for rapid isolation of bone marrow mononuclear cells using Ficoll-Metrizoate and the IBM 2991 blood cell processor. Br J Haematol. 50 (4), 619-626 (1982).
- Boyer, T., et al. Flow cytometry to estimate leukemia stem cells in primary acute myeloid leukemia and in patient-derived xenografts, at diagnosis and follow-up. J Vis Exp. (133), e56976(2018).
- Kang, S. M., et al. Genome-wide loss-of-function genetic screening identifies opioid receptor mu1 as a key regulator of L-asparaginase resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 36 (42), 5910-5913 (2017).
- Lee, J. K., et al. HAP1 loss confers L-asparaginase resistance in ALL by downregulating the calpain-1-Bid-caspase-3/12 pathway. Blood. 133 (20), 2222-2232 (2019).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
