Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie to wprowadza szybką, opłacalną i wydajną metodę ksenoprzeszczepu in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, obejmującej zarówno linie komórek B, jak i komórek T. Korzystając z zapłodnionych zarodków kurczaków, wstrzyknęliśmy komórki B-ALL i T-ALL pochodzące od pacjenta do układu naczyniowego zarodków 11 dni po zapłodnieniu (11dpf). Co ciekawe, cztery dni po wstrzyknięciu przeszczepione ludzkie komórki białaczki wykazywały znaczną przeżywalność, proliferację i kolonizację naczyń krwionośnych w rozwijającym się zarodku kurczaka. Do 15dpf wykryliśmy znaczny wzrost komórek B-ALL CD10/CD19+ i T-ALL CD4/CD8+ w próbkach krwi z układu naczyniowego zarodka, potwierdzając pomyślne wszczepienie. System ten ułatwia wydajną i powtarzalną ocenę zachowania komórek białaczkowych w żywym organizmie bez znacznych kosztów i ograniczeń etycznych związanych z innymi modelami zwierzęcymi. To szybkie podejście zapewnia wysokowydajną i biologicznie istotną platformę in vivo do oceny potencjalnych związków terapeutycznych. Zaprezentowany tutaj system in ovo patient-derived xenograft (PDX)-ALL oferuje obiecujące narzędzie do przedklinicznych badań przesiewowych leków, badań mechanistycznych i potencjalnie do spersonalizowanych podejść medycznych w badaniach nad białaczką.
Wprowadzenie
Błona kosmówkowo-omoczniowa pisklęcia (CAM) zaczyna nabierać kształtu w 7 dniu po zapłodnieniu po inkubacji i jest gotowa do 12 dnia. CAM znajduje się w centrum uwagi jako odpowiedni model in vivo do angiogenezy1 i wszczepiania komórek nowotworowych 2,3,4,5,6,7,8,9,10, w szczególności komórek nowotworowych związanych z krwią
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przeprowadzono w oparciu o protokół zatwierdzony przez Komitet Etyki Uniwersytetu w Calgary (REB15-1143; w którym uzyskano świadomą zgodę od WSZYSTKICH uczestników) oraz Radę Etyki Badań Zdrowotnych Komitetu ds. Raka Alberty (HREBA. CC-17-0108_REN8). Do badania włączono pacjentów z ALL w momencie rozpoznania (przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii), u których występowały krążące blasty (wybuchy nie tylko w szpiku, ale także we krwi). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Inkubacja jaj
- Zaopatrz się w zapłodnione jaja kurze. Zdobądź ~10% więcej jaj niż je....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ustalić, czy wszczepienie ludzkich komórek ALL w rozwijające się zarodki kurczaka zakończyło się sukcesem, amplifikowano lentiwirus 2. generacji z niekompetentną replikacją przenoszący mCherry i wykorzystano je do znakowania linii komórkowych B- i T-ALL, SEM i MOLT316,17, odpowiednio. Jak pokazano na rysunku 1A, ~ 50% komórek B - (lewy górny lewy panel) i T - (prawy górny róg dwa panele) WSZYSTKIE komórki były oznaczon.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zidentyfikowano trzy kluczowe etapy ksenoprzeszczepuin ovo w celu zapobieżenia skażeniu mikrobiologicznemu i maksymalizacji przeżywalności zarodków kurczaków: tj. (1) sterylizacja powierzchni skorupki jaja 70% etanolem przed wykonaniem okienka oraz (2) szczelne uszczelnienie okienka skorupki jaja taśmą wiolonczelową, aby zapobiec parowaniu zawartości zarodka kurzego podczas inkubacji, oraz (3) użycie cienkiej igły (np. 34 G) i wstrzyknięcie WSZYSTKICH komórek w minimalnej objętości (np. 100 μL) w celu zapewnien.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy dr Andrew Kungowi z Columbia University za udostępnienie FUW-Luc-mCherry-puro. Prace te były wspierane przez granty CIHR (PJT-174983) dla KYL oraz z National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) do KYL i M-YJ.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igły 34 G | BD Perisafe | ||
| Cytometr przepływowy Attune NxT | Rybak termiczny | ||
| Strzykawka BD Perisafe (32 g) | BD Perisafe | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Millipore Sigma | A9647 (wersja angielska) | |
| Pożywka do zamrażania komórek | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Wirówka (Wirówka Allegra X-22R) | Beckman Coulter | ||
| Rękawiczki jednorazowe | Rękawice diagnostyczne nitrylowe Royal Touch300 | ||
| Mikroskop preparacyjny | Leica MZ16FA | ||
| DMEM (DMEM) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Zobacz materiał D12345 | |
| Inkubator do jaj, inkubator rolkowy Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Alkohol etylowy (95%) | VWR Polska | BDH1158-4LP | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Roztwór Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MiliporeSigma | Przekaźnik GE17-1440-02 | |
| Przeciwciało FITC-CD10 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-46656 FITC | |
| Przeciwciało FITC-CD4 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-19641 FITC | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Mikrosystemy Leica | ||
| Wiertarka ręczna (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, WIRGINIA, STANY ZJEDNOCZONE | CRL-3216 | |
| Hemocytometr | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń | Millipore Sigma | Zobacz materiał H3149 | |
| Probówki heparynizowane | Odkurzacz BD | BD 366480 | |
| Lipofektamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Zestaw miana multipleksowego lentiwirusa (zestaw miana lentiwirusa qPCR) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ amonowy | Millipore Sigma | A9434 (wersja angielska) | |
| Mikroskop odwrócony Olympus IX71 | Olympus | ||
| Przeciwciało PE-CD19 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-19650 PE | |
| Przeciwciało PE-CD8 | Biotechnologia Santa Cruz | sc-1177 PE | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma | Zobacz materiał P3813 | |
| Pipety (regulowana objętość) | Eppendorf powiedział: | ||
| Puromycyna | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| Silnik RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Taśma klejąca do wiolonczeli | 3 mln | ||
| Sterylne płytki 6-dołkowe | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Sterylne probówki wirówkowe | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Sterylne kolby hodowlane (75T) | VWR Polska | 10062-872 | |
| Sterylne probówki Falcon (15 ml) | SARSTEDT (w języku angielskim) | 62.554.502 | |
| Sterylne probówki Falcon (50 ml) | SARSTEDT (w języku angielskim) | 62.547.254 | |
| Filtr sterylny (0,45 &mikro; m filtr) | VWR Polska | 76778-974 | |
| Sterylne kleszcze | VWR Polska | 82027-404 | |
| Szkiełka podstawowe sterylne | VWR Polska | 48300-031 | |
| Sterylne końcówki do pipet | VWR Polska | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Sterylne strzykawki | Strzykawka BD | 309628? | |
| Błękit trypanowy | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Zobacz materiał T10282 |
Bibliografia
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
