Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68291

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje metodę hodowli komórek T ptaków in vitro poprzez izolowanie limfocytów T pamięci od zakażonych kaczek, co pozwala na generowanie wysoce oczyszczonych specyficznych limfocytów T kaczki. Ponadto ustalono metodę barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS) w celu dokładnego pomiaru wydzielania IFN-γ w limfocytach T kaczki.

Streszczenie

Hodowla in vitro limfocytów T jest kluczową metodą badania odpowiedzi immunologicznych, infekcji wirusowych i potencjalnych strategii terapeutycznych. Jednak do tej pory nie zgłoszono żadnych ustalonych protokołów hodowli limfocytów T ptaków in vitro. W niniejszym badaniu po raz pierwszy przedstawiamy protokół, w którym jako model wykorzystano wirusa H5N1 wysoce zjadliwej grypy ptaków (HPAIV). W tym przypadku 4-tygodniowe kaczki zostały zakażone wirusem, a limfocyty T pamięci wyizolowano 28 dni po zakażeniu w celu wyhodowania limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1, co umożliwiło zbadanie specyficznej odpowiedzi immunologicznej na wirusa H5N1. Kluczowe kroki w protokole obejmują izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pamięci (PBMC) od zakażonych kaczek, aktywację komórek prezentujących antygen (APC) o optymalnej wielokrotności infekcji (MOI = 5) przez 6 godzin oraz przygotowanie pożywki do hodowli komórek T uzupełnionej rekombinowaną IL-2 i innymi specyficznymi dodatkami. Proliferacja limfocytów T, wydzielanie cytokin i aktywność cytotoksyczna były ściśle monitorowane przez cały proces. Dodatkowo ustaliliśmy wewnątrzkomórkowy protokół barwienia cytokin w celu ilościowego określenia wydzielania IFN-γ w limfocytach T kaczki. Wiązało się to z wytworzeniem linii komórkowej hybrydoma wykazującej ekspresję przeciwciał IgG3κ specyficznych dla IFN-γ kaczki, a następnie pomyślnym oczyszczeniem przeciwciał. Oczyszczone przeciwciało rozcieńczono w stosunku 1:10 i zastosowano w cytometrii przepływowej w celu precyzyjnego pomiaru wydzielania IFN-γ. Metoda ta stanowi wiarygodne narzędzie do oceny odpowiedzi limfocytów T kaczki i stanowi podstawę dla przyszłych badań nad immunologią wirusów ptaków.

Wprowadzenie

Proces aktywacji, proliferacji, różnicowania i przekształcania limfocytów T w pamięć jest kluczowy dla odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu1. Początkowo limfocyty T są aktywowane, gdy ich receptory limfocytów T (TCR) rozpoznają peptydy antygenowe prezentowane na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC) przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC)2,3. Ten proces aktywacji wymaga nie tylko wiązania TCR z cząsteczkami MHC, ale także koordynacji sygnałów kostymulujących, które są kluczowe dla pełnej aktywacji funkcji komórek T4. Po aktywacji limfocyty T szybko wchodzą w fazę proliferacji, generując liczne klony, które mają taką samą specyficzność antygenową jak oryginalne limfocyty T. Podczas tej fazy proliferacji limfocyty T dalej różnicują się w zależności od ich funkcji, głównie na limfocyty T CD8 + i limfocyty T CD4 + 5. Te zróżnicowane komórki pośredniczą odpowiednio w zabijaniu cytotoksycznym i wspomagają odpowiedź immunologiczną. Po początkowej infekcji część aktywowanych limfocytów T przekształca się w długotrwałe limfocyty T pamięci6. Te limfocyty T pamięci mogą utrzymywać się w układzie odpornościowym przez dłuższy czas, szybko reagując na ten sam patogen po ponownym narażeniu. W rezultacie generują silniejszą i bardziej wydajną odpowiedź immunologiczną, zapewniając długotrwałą ochronę immunologiczną dla hosta7. Cały ten proces ma kluczowe znaczenie dla projektowania szczepionek z limfocytami T, ponieważ pomaga poprawić skuteczność i trwałość szczepionki8.

W tym kontekście, hodowla limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro staje się niezbędna. Protokół ten został opracowany w oparciu o uznane metody hodowli in vitro ludzkich limfocytów T, z niezbędnymi adaptacjami dla ptasiego układu odpornościowego9. Hodując te komórki poza organizmem, naukowcy mogą badać odpowiedź limfocytów T w różnych stanach odpornościowych, takich jak aktywacja, proliferacja, różnicowanie i tworzenie pamięci10. To podejście in vitro jest nieocenione dla zrozumienia ról, jakie limfocyty T odgrywają w odpowiedziach immunologicznych. Ponadto w warunkach hodowli in vitro można monitorować wydzielanie cytokin (takich jak IFN-γ) przez limfocyty T11,12. Monitorowanie to ma kluczowe znaczenie dla oceny jakości, intensywności i trwałości odpowiedzi immunologicznej, a także badania interakcji między limfocytami T a innymi komórkami odpornościowymi. Dodatkowo, ekspansja in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu umożliwia wzbogacenie na dużą skalę, zwiększa czułość wykrywania i poprawia ocenę poziomów odpowiedzi limfocytów T13. W związku z tym hodowla in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu służy jako potężne narzędzie do lepszego zrozumienia roli limfocytów T drobiu w odpowiedziach immunologicznych, co zwiększa czułość wykrywania i poprawia ocenę poziomów odpowiedzi limfocytów T. Podczas gdy podobne metody in vitro są dobrze znane w systemach ssaków, zastosowanie takich technik u gatunków ptaków pozostaje ograniczone. Jest to szczególnie istotne w immunologii drobiu, gdzie narzędzia do analizy odpowiedzi limfocytów T są słabo rozwinięte. W szczególności kaczki służą jako naturalne rezerwuary dla kilku wirusów ptasiej grypy, ale niewiele wiadomo na temat ich odporności limfocytów T specyficznej dla antygenu. W związku z tym opracowanie znormalizowanego protokołu hodowli komórek T in vitro dostosowanego do systemów ptasich ma zasadnicze znaczenie dla postępu zarówno w badaniach podstawowych, jak i immunologii stosowanej u drobiu.

Kluczową cytokiną biorącą udział w tych procesach jest IFN-γ, interferon typu II, wytwarzany głównie przez limfocyty T CD8+, limfocyty T CD4+ typu 1 i komórki NEK14. IFN-γ odgrywa kluczową rolę w hamowaniu replikacji wirusa i regulacji odpowiedzi immunologicznej15. Poziom ekspresji IFN-γ odzwierciedla status immunologiczny i służy jako marker aktywacji limfocytów T, umożliwiając naukowcom ocenę poziomu odpowiedzi limfocytów T poprzez jego expression16,17. Jedną z powszechnych metod wykrywania ekspresji cytokin w komórkach odpornościowych jest wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS)18,19. Jednak ze względu na ograniczenia w materiałach i technikach eksperymentalnych, badania nad kaczkami pozostają w tyle za badaniami nad ssakami5. Obecnie wielu badaczy polega na qPCR do pomiaru poziomów ekspresji IFN-γ, chociaż ta metoda ma pewne ograniczenia11. W naszym laboratorium udało nam się opracować przeciwciało przeciwko IFN-γ kaczki, które jest kompatybilne z cytometrią przepływową. Opierając się na tym sukcesie, w tym badaniu opracowaliśmy metodę ICS do wykrywania ekspresji białka IFN-γ w limfocytach T kaczki, zapewniając niezawodne narzędzie do dalszych badań nad odpowiedziami limfocytów T kaczki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty ze wszystkimi dostępnymi wirusami ptasiej grypy A (H5N1) zostały przeprowadzone w laboratorium i obiekcie dla zwierząt o 3 poziomie bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z protokołami Uniwersytetu Rolniczego Południowochińskiego (CNAS BL0011). Wszystkie projekty badawcze na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (kod identyfikacyjny 2021f154, 29 lipca 2021 r.) Uniwersytetu Rolniczego Południowochińskiego. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i wytycznymi ustanowionymi przez ten komitet oraz międzynarodowymi standardami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Zwierzętami wykorzystanymi w tym badaniu były 4-tygodniowe domowe kaczki krzyżówki (Anas platyrhynchos domestica), w tym zarówno samce, jak i samice, o masie ciała od 500 do 600 g.

1. Izolacja PBMC kaczki i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

  1. Zbierz 2 ml heparynizowanej krwi z żyły szyjnej każdej kaczki i przenieś do probówek zawierających EDTA, aby zapobiec krzepnięciu u każdej kaczki z osobna
  2. Rozcieńczyć krew za pomocą dostarczonego rozcieńczalnika do próbek z zestawu do izolacji limfocytów lub PBS. Delikatnie wymieszać, pipetując pipetą Pasteura. Zwykły stosunek rozcieńczenia wynosi 1:1 dla krwi do rozcieńczalnika.
  3. Przenieść taką samą objętość roztworu do separacji limfocytów do probówki wirówkowej, jak rozcieńczona krew. Ostrożnie ułóż zawiesinę krwi na wierzchu roztworu do separacji limfocytów. Odwirować mieszaninę w temperaturze 400 x g, 25 °C przez 15 minut, ustawiając przyspieszenie opadania na 1,
    UWAGA: Ilość roztworu do separacji limfocytów nie powinna być mniejsza niż 4 ml. Składniki zestawu roztworu do separacji limfocytów można znaleźć w Tabeli materiałów.
  4. Po odwirowaniu obserwuj cztery odrębne warstwy w probówce wirówkowej od góry do dołu. Górna warstwa to rozcieńczalnik do próbek, po której następuje pierścieniowa mlecznobiała warstwa limfocytów, następnie roztwór rozdzielający, a dolna warstwa składa się z czerwonych krwinek.
  5. Ostrożnie użyj pipety, aby zebrać drugą warstwę, pierścieniową mlecznobiałą warstwę limfocytów i przenieś ją do nowej probówki wirówkowej. Dodaj 10 ml roztworu czyszczącego, aby wymieszać z komórkami.
  6. Odwirować próbkę o masie 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml pożywki RPMI 1640 w celu zliczenia komórek.
  7. Opcjonalnie) W celu dalszego oczyszczenia próbki, po odwirowaniu przy 440 x g przez 5 minut, należy użyć buforu do lizy czerwonych krwinek w celu usunięcia wszelkich pozostałych zmieszanych krwinek.

2. Hodowla in vitro H5N1 specyficzna dla AIV

  1. Kup 2-tygodniowe, zdrowe kaczki krzyżówki (Sheldrake) z fermy kaczek i umieść je w izolatorach podciśnieniowych. Potwierdź, że kaczki są ujemne na obecność grypy ptaków, stosując testy hamowania hemaglutynacji (HI) przed eksperymentem. Zakażone 4-tygodniowe kaczki wirusem H5N1 AIV 1 x 106, z 50% dawką zakaźną jaj [EID50]/0,2 ml donosowo.
  2. Wyizolować PBMC pamięci od kaczek zakażonych wirusem H5N1 28 dni po zakażeniu, postępując zgodnie z metodą opisaną w kroku 1. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:1 0,08% błękitu trypanowego i ręcznie policzyć żywe (niebarwione) komórki pod mikroskopem świetlnym.
    UWAGA: Jak potwierdza nasze wcześniej opublikowane badanie20, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane 28 dni po zakażeniu są uważane za wzbogacone w limfocyty T pamięci. Na tym etapie faza efektorowa ustąpiła, a populacje komórek pamięci są dominujące.
  3. Ustaw stężenie na 3 x 106 komórek/ml, upewniając się, że do każdego dołka 48-dołkowej płytki dodaje się 1 ml pożywki.
  4. Jednoczesne zakażenie wyizolowanych PBMC wirusem ptasiej grypy H5N1 (AIV), aby służyły jako APC. Dawka wirusa wynosi MOI = 5. Współhodowlę PBMC z wirusem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsać ręką co 15 minut.
  5. Po 1 godzinie infekcji przemyj komórki 2x PBS, aby usunąć niezwiązane cząsteczki wirusa. Ponownie zawiesić przemyte PBMC w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów T i dalej inkubować zawieszone komórki w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.
  6. Odwirować komórki przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić inkubowane komórki prezentujące antygen (APC) w 100 μl pożywki do hodowli limfocytów T i dodać je do komórek efektorowych. Stosunek komórek prezentujących antygen do komórek efektorowych powinien wynosić 1:5.
  7. Inkubować komórki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 14 dni. Co 2 dni zastępować połowę supernatantu hodowli komórkowej świeżą pożywką z limfocytów T, ostrożnie pipetując, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Odrzucić połowę pożywki zawierającej komórki, a następnie dodać równą objętość nowego podłoża.
  8. W dniu 7 obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym pod kątem 100x.
  9. Użyj PBMC pamięci traktowanych PBS jako niestymulowanej grupy kontrolnej.

3. Karboksyl-fluoresceina Diacetan sukcynimidylu Ester (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów T

  1. Dostosuj gęstość komórek do 0,5-1 x 107 komórek/ml i ponownie zawieś komórki z 5 ml PBS po odwirowaniu przy 440 x g przez 5 minut.
  2. Rozcieńczyć 10 mM bulionu do 1 μM CFSE za pomocą 5 ml wstępnie schłodzonego PBS; pracować w ciemności.
  3. Przechylić dwie probówki wirówkowe pod kątem 45°, dodać rozcieńczenie CFSE do zawiesiny komórek za pomocą pipety Pasteura, dobrze wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut w ciemności.
  4. Przemyć komórki, rozcieńczając je w 10 objętościach wstępnie schłodzonego PBS zawierającego 5% FBS, osadzać przez odwirowanie przy 440 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórz pranie 2x.
  5. Stymuluj komórki znakowane CFSE in vitro zgodnie z krokiem 2. Po zakończeniu testu proliferacji należy pobrać komórki i przeanalizować je za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Analiza cytometryczna przepływowa pod kątem proliferacji limfocytów T CD8+ i limfocytów T CD4+

  1. Po 7 dniach hodowli zbierz wszystkie komórki z każdej studzienki i podziel je na dwie rurki przepływowe do analizy.
  2. Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
  3. Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (mysi anty-kaczkowy CD8, 1:50 lub mysi anty-kaczkowy CD4, 1:50) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
  5. Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (kozio-sprzężony z FITC Kozia IgG2b, 1:50) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć komórki raz 1 ml PBS, wirując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Strategia bramkowania jest pokazana na rysunku uzupełniającym 1.

5. Odpowiedź limfocytów T za pomocą testów ekspresji genów sygnaturowych za pomocą qPCR

  1. Policz komórki na końcu hodowli limfocytów T, zbierz do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
  2. Ekstrakcja RNA
    UWAGA: Ekstrakcję można przeprowadzić w dygestorii lub ultra czystej ławce, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNA.
    1. Zdaj komórki za pomocą buforu do lizy dostarczonego w zestawie zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś zlizowaną próbkę do kolumn filtrujących gDNA (wstępnie umieszczonych w probówkach zbiorczych), odwiruj przy 13 400 x g przez 30 s, odrzuć kolumny i zbierz filtrat. Dodać 0,5 objętości bezwzględnego etanolu do filtratu. Dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: Mętny roztwór lub osad po dodaniu etanolu jest normalny. Wstrząśnij i przejdź do następnego kroku.
    2. Przenieść mieszaninę do kolumn RNA, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s. Wyrzucić filtrat, dodać 700 μl buforu RW1 i ponownie odwirować.
    3. Odrzucić przesąc, dodać 700 μl buforu RW2 (z absolutnym etanolem) i odwirować. Odrzucić przesąc, dodać 500 μl buforu RW2 (z absolutnym etanolem) i odwirować przez 2 minuty. Ostrożnie wyjmij kolumnę z rurki, aby uniknąć zanieczyszczenia filtratem. Upewnij się, że wszystkie roztwory płuczące zostały usunięte, aby zapobiec zakłóceniom w dalszych reakcjach.
    4. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej wolnej od RNaz, dodać 50-200 μl ddH2O bez RNaz, pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę, a następnie odwirować przy 13 400 x g przez 1 minutę w celu wymycia RNA. Zmierz czystość i stężenie RNA.
      UWAGA: Podgrzej ddH2O bez RNaz do 65 °C w celu zwiększenia wydajności i w razie potrzeby wykonaj drugą elucję.
  3. Zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu. Zsyntetyzuj nić cDNA zgodnie z instrukcjami producenta, dodając 5x więcej odwrotnej transkryptazy. Odwrotną transkrypcję w temperaturze 37 °C przez 15 minut, następnie w temperaturze 85 °C przez 5 s i schładzanie do temperatury 4 °C.
  4. Ustaw reakcję PCR zgodnie z protokołem producenta.
    1. W probówce qPCR połącz 10 μl mieszaniny 2x enzymów reakcyjnych PCR, 0,4 μl startera 1, 0,4 μl startera 2, 1 μl matrycy cDNA i 8,2 μl ddH2O, aby uzyskać mieszaninę 20 μl.
    2. Uruchom PCR w ilościowym aparacie PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu:
      Etap 1: 95 °C przez 30 s, Rep x 1
      Etap 2: 95 °C przez 3 s, 60 °C przez 30 s, Rep x 35
      Etap 3: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s, 95 °C przez 15 s, Rep x 1

6. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS)

UWAGA: Ten protokół został opracowany w celu oceny odpowiedzi efektorowej limfocytów T CD8+ specyficznych dla H5N1 poprzez wykrywanie wewnątrzkomórkowego wydzielania IFN-γ u kaczek.

  1. Hodowla limfocytów T specyficznych dla H5N1 in vitro zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2. Zbierz wszystkie komórki (z każdej studzienki) po 7 dniach od rozpoczęcia hodowli.
  2. Inkubować komórki prezentujące antygen (APC) zgodnie z opisem w kroku 2. Dodać inkubowane APC i Brefeldin A (1:1 000) do komórek efektorowych i współinkubować przez 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 39 °C.
  3. Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
  4. Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (mysi anty-kaczka CD8, 1:50) do komórek i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  5. Przemyć komórki przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić je w 1 ml PBS. Dodać koktajl przeciwciał (sprzężony z FITC kozioł anty-mysi IgG2b, 1:50) i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  6. Ponownie umyć komórki przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować przez 20-25 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  7. Ponownie przepłukać komórki, odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego i przemyć komórki 2x przez odwirowanie w 440 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu permeabilizacji i dodać przeciwciało (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) do komórek. Po utrwaleniu i przepuszczalności błony inkubować mieszaninę komórka-przeciwciało przez 30 minut w ciemności, od czasu do czasu wstrząsając podczas inkubacji w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwór do permeabilizacji/płukania jest 10-krotnym roztworem podstawowym i przed użyciem należy go rozcieńczyć PBS.
  9. Przemyć komórki ponownie 1 ml PBS przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (kozi anty-mysi IgG3 sprzężony z PE, 1:250) i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4°C.
  10. Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Strategia bramkowania jest pokazana w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ten opracowano na podstawie wcześniejszego badania dotyczącego wykrywania odpowiedzi efektorowych limfocytów T swoistych dla antygenu u kaczek20. Pierwszy etap eksperymentu obejmuje hodowlę in vitro limfocytów T swoistych dla wirusa, które stanowią podstawę do późniejszych badań nad odpowiedzią efektorową. Początkowo APC inkubowano i hodowano wspólnie z komórkami efektorowymi. Obserwacje morfologiczne wykazały, że po proliferacji komórki wykazywały wzrost w skupiskach (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia skuteczną metodę hodowli in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu kaczki, a także ustanawia wewnątrzkomórkowy protokół barwienia cytokin dla kaczek, który można wykorzystać do oceny odpowiedzi efektorowych limfocytów T. Obecnie nie ma opublikowanych doniesień na temat protokołów hodowli in vitro limfocytów T kaczki. Odnieśliśmy się przede wszystkim do protokołów dla ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu, ale jesteśmy zaangażowani w optymalizację warunków inkubacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32473060 i 32461120064) (do MD i ML); Guangzhou Basic and Applied Basic Research Project (2025A04J5445) (do MD); Program Profesorski dla Młodych Uczonych Rzeki Jangcy (2024, Manman Dai); oraz Young Peal River Scholar of "Guangdong Special Support Plan" (2024, Manman Dai). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml MIKRO-probówki wirówkoweBiosharpCat#BS-15-M
15 mL Probówki wirówkoweLabselectCat#CT-002-15A
2-merkaptoetanol (55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (bez obróbki, płaskie dno)BiofilCat#TCP000048
50 mL Probówki wirówkoweLabselectCat#CT-002-50A
płytki qPCR bez osłonyLabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Zestaw Cytofix/CytopermBD BioscienceCat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
Hodowla komórkowa Inkubator CO2ThermoFisher Heracell 150i GP
Zestaw5810R
AbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazymeCat#Q341-02
Zestaw do izolacji limfocytów krwi obwodowej kaczkiTbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixDokładna biotechnologiaCat#AG11706
FastPure Izolacja całkowitego RNA komórek/tkanek Zestaw V2VazymeCat#RC112-01
Płodowa surowica bydlęcaGibcoCat#10437-028
Cytometr przepływowyBeckman CoulterBA43347
Rurka przepływowaBeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Drzewo Gwiazdahttps://www.flowjo.com
Koza Anty-Myszy 488, 1:50 rozcieńczenieAbbkineCat#A23210
Kozia Anty-Mysia IgG2b, FITC, 1:50 rozcieńczenieSouthern BiotechCat#1091-31
Kozia Anty-Mysz IgG3, PE, 1:250 rozcieńczenieSouthern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad prism 8.0.2Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV szczep DK383Krajowe i Regionalne Wspólne Laboratorium Inżynieryjne ds. Leków Zapobiegania i Kontroli Chorób OdzwierzęcychA/Kaczka/Guangdong/383/2008
L-glutamina (200 mM)GibcoCat#25030081
MikroskopMoticAE2000
Mysz Anti-Duck CD4, rozcieńczenie 1:50Bio-RadCat#MCA2478
Mysz Anti-Duck CD8α, rozcieńczenie 1:50GeneTex Cat#GTX41834
Mysz Anti-Duck IFN-γ mAb, rozcieńczenie 1:10Przygotowane w naszym laboratorium NA
NanoDrop One SpektrofotometrThermo FisherAZY1603209
NEAA (nieistotneGibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR Thermal CyclerBiometraBiometra Tone 96G
Roztwór penicyliny i streptomycynyGibcoCat#15070063
System Real-Time PCRApplied BiosystemsABI7500
rekombinowaną ludzką IL-2 (10 μ g)USCNKCat#RPA111Ga01
Bufor do lizy czerwonych krwinekTbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
Pirogronian sodu (100 mM)GibcoCat#11360-070
Trypan BlueSigma-AldrichCat#93595
Dwutygodniowe kaczki krzyżówki (Sheldrake)ferma kaczek w KantonAmeryka Północna
96-dołkowe do znakowania CFSE Eppendorf ,

Bibliografia

  1. Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation. Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).
  2. Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents. Cancer Genom Proteom. 11 (6), 267-277 (2014).
  3. Mazza, C., Malissen, B. What guides MHC-restricted TCR recognition. Semin Immunol. 19 (4), 225-235 (2007).
  4. Nel, A. E. T-cell activation through the antigen receptor. Part 1: signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse. J Allergy Clin Immunol. 109 (5), 758-770 (2002).
  5. Dai, M., Xu, C., Chen, W., Liao, M. Progress on chicken T cell immunity to viruses. Cell Mol Life Sci. 76 (14), 2779-2788 (2019).
  6. Deng, G., et al. The role and therapeutic strategies for tissue-resident memory T cells, central memory T cells, and effector memory T cells in psoriasis. Immunology. 173 (3), 470-480 (2024).
  7. Corrado, M., Pearce, E. L. Targeting memory T cell metabolism to improve immunity. J Clin Invest. 132 (1), 148546(2022).
  8. Liu, X., Li, H., Li, S., Yuan, J., Pang, Y. Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design. Front Immunol. 14, 1100741(2023).
  9. Zanker, D., et al. An optimized method for establishing high purity murine CD8+ T cell cultures. J Immunol Methods. 387 (1-2), 173-180 (2013).
  10. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-Cell Differentiation In Vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  11. Jiao, W., et al. Revealing novel CD8(+) T-cell epitopes from the H5N1 avian influenza virus in HBW/B1 haplotype ducks. Vet Res. 55 (1), 169(2024).
  12. Faulkner, L., et al. The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs. Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).
  13. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  14. Masuda, Y., et al. Biological effects of chicken type III interferon on expression of interferon-stimulated genes in chickens: comparison with type I and type II interferons. J Vet Med Sci. 74 (11), 1381-1386 (2012).
  15. Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway. Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).
  16. Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation. Front Immunol. 13, 759188(2022).
  17. Yu, E. D., et al. Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors. Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).
  18. Grant, E. J., et al. Broad CD8(+) T cell cross-recognition of distinct influenza A strains in humans. Nat Commun. 9 (1), 5427(2018).
  19. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  20. Dai, M., et al. Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro. J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).
  21. Jabbari, A., Harty, J. T. The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses. J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).
  22. Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)). Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).
  23. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  24. Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications. J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).
  25. Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).
  26. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).
  27. Chen, L., et al. A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans. Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wirus H5N1mononuklearne komórki krwi obwodowejkomórki prezentujące antygensekrecja cytokincytometria przepływowadetekcja IFN-gammaproliferacja limfocytów T
In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.