Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie swobodnie unoszących się normalnych ludzkich sferoidalnych kultur sferoidalnych nabłonka i fibroblastów

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68440

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prosty i bardzo praktyczny, ale niezawodny protokół bezpośredniej sferoidalnej hodowli ludzkich komórek nabłonka płuc i fibroblastów bez polegania na matrycy.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się coraz bardziej popularne ze względu na ich zdolność do odtwarzania naturalnych właściwości i architektury komórek, naśladując w ten sposób struktury tkankopodobne in vitro. Wśród tych modeli, hodowla sferycznych agregatów komórkowych (tzw. sferoidów) osadzonych w półstałej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) stanowi zaawansowany model hodowli komórkowej zbliżony do in vivo, ponieważ pozwala na uzyskanie różnych funkcjonalnych stanów komórek w wyniku interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, a także gradientów tlenu i składników odżywczych. Ponieważ sferoidy są technicznie mniej wymagające i stosunkowo niedrogie w uzyskaniu, są często stosowane w badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności, umożliwiając badania przesiewowe o wysokiej zawartości w celu testowania nowych leków w fazie przedklinicznej. W tym celu odtwarzane są głównie struktury 3D różnych nowotworów. Jednocześnie Matrigel jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych ECM i jest uważany za złoty standard w hodowli sferoidów i organoidów, chociaż jest to matryca 3D oparta na eksperymentach na myszach, której ekstrakcja - podobnie jak testy na zwierzętach w ogóle - wiąże się z poważnymi obawami etycznymi. W tym miejscu przedstawiamy bezmacierzowy protokół bezpośredniej sferoidalnej kohodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów, który można uznać za zoptymalizowaną metodę kohodowli, szczególnie w odniesieniu do komunikacji nabłonkowo-fibroblastowej i interakcji w obrębie odpowiednich sferoid, bez polegania na (zwierzęcej) matrycy nośnej. Ustanawiając te swobodnie pływające współkultury sferoidalne nabłonkowo-fibroblastoidalne jako zorientowaną na pacjenta platformę in vitro do modelowania normalnej toksyczności tkanki (płucnej) podejść terapeutycznych przeciwnowotworowych, można osiągnąć nie tylko zmniejszenie liczby zwierząt doświadczalnych, ale także odpowiednie i znaczące zastąpienie odpowiednich doświadczeń na zwierzętach.

Wprowadzenie

Dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek, w których płaskie komórki jednowarstwowe są hodowane, ekspandowane, a następnie powlekane do testów badawczych opartych na komórkach, pozostają łatwą, wygodną, opłacalną i szeroko stosowaną metodą dla standardowych przedklinicznych procedur przesiewowych1,2. Do badania interaktywnych (parakrynnych) przesłuchów między różnymi typami komórek in vitro można użyć kondycjonowanej pożywki z jednego typu komórki do stymulacji innego typu komórek. Ponadto pojawiły się różne metody kohodowli, np. metody pośrednie, w których współhodowane komórki są fizycznie oddzielane za pomocą mikroporowatej membrany. Te "systemy Transwell" zawierają wkładkę (mikroporowatą membranę), która jest umieszczona w tradycyjnej płytce do hodowli komórkowej 2D. Jeden typ komórki jest następnie wysiewany i hodowany na błonie, dzieląc te same podłoża, co drugi typ rosnący na studni towarzyszącej, umożliwiając w ten sposób dwukierunkową komunikację parakrynną2. Te dwa typy komórek mogą być nawet rozsiane po obu stronach błony, tworząc bardziej bezpośrednią kokulturę kontaktową między komórkami, która jest odpowiednia do badania tkanek o strukturze barierowej3,4.

Jednak odpowiedzi komórkowe tych nawet zaawansowanych systemów hodowli komórkowych 2D nie zawsze odzwierciedlają wyniki odpowiednich eksperymentów na zwierzętach, a nawet badań klinicznych, co wynika, między innymi, z braku bezpośredniej sygnalizacji między różnymi typami komórek, a tym samym braku organizacji komórkowych podobnych do in vivo. Dlatego trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się coraz bardziej popularne ze względu na możliwości naturalnych cech komórek i architektur naśladujących struktury tkankopodobne in vitro5,6. Wśród tych modeli, hodowla sferycznych agregatów komórkowych, zwanych sferoidami, osadzonych w półstałych matrycach zewnątrzkomórkowych, zapewnia bardziej zaawansowany model kohodowli komórek, w którym można osiągnąć różne funkcjonalne stany komórkowe po interakcjach komórka-komórka i komórka-ECM, a także gradienty tlenu i odżywiania7. Te pożądane, bardziej złożone, podobne do in vivo hodowle in vitro 3D powinny być generowane i utrzymywane w jednorodności pod względem rozmiarów składania komórek, jednocześnie promując rozwój i różnicowanie komórek, a jednocześnie być skuteczne, szybkie, spójne i wygodne7,8.

Korzystając z naturalnych cech autoagregacji i adhezji, sferoidy (głównie sferoidy nowotworowe) są zwykle generowane przy użyciu techniki wiszącej kropli9,10. Jako jedna z pierwszych technik stosowanych do generowania ciał embrionalnych, test wiszącej kropli stał się szeroko stosowaną metodą generowania licznych jednorodnych sferoid w oparciu o zasady grawitacji i napięcia powierzchniowego przed osadzeniem ECM przy użyciu Matrigel, "złotego standardu" matryc zewnątrzkomórkowych, chociaż opartego na myszy. Podjęto znaczne wysiłki, aby wygenerować sferoidy w podejściach bez rusztowań8,11. Na przykład, sferoidy mogą być generowane za pomocą butelki do hodowli komórkowych z mieszadłem, zapobiegając w ten sposób wysiewaniu komórek, co jest najprostszą metodą produkcji sferoidów na dużą skalę12.

Najtrudniejszą rzeczą w kompleksowym tworzeniu kultur komórkowych, a tym samym w ustanowieniu fizjologicznie wartościowego systemu, jak w przypadku alternatyw in vivo in vitro w swoim laboratorium, są skomplikowane protokoły z wieloma różnymi krokami (które nadal muszą zostać ustalone). Na przykład, generowanie struktur komórkowych najpierw za pomocą metody, zbieranie ich, a następnie osadzanie w matrycy, zwłaszcza użycie matryc, które nie są łatwe w obsłudze, to krytyczne kroki, które wymagają bardziej przekonującego zastosowania, zanim metoda będzie mogła być stosowana rutynowo i seryjnie. Tutaj użyliśmy bardzo niskiej płytki przyłączeniowej w formacie 96 dołków, która pozwala praktycznie na brak przyłączania komórek do materiału hodowlanego w celu ustanowienia złożonych sferoid 3D komórek nabłonka płuc i fibroblastów. Powstałe w ten sposób sferoidy powstają bardzo jednorodnie i dość szybko w ciągu 24 godzin, co skraca czas eksperymentu. Przedłużona hodowla, a tym samym niezawodny wzrost i różnicowanie komórek, odbywa się w tym samym dołku przez cały okres, tak że po wstępnym posiewie wystarczy wymienić tylko pożywkę przez cały okres uprawy. Dlatego przedstawiamy bardzo prosty, szybki, a co za tym idzie wysoce praktyczny protokół generowania sferoid płuc ludzkich, które morfologicznie i funkcjonalnie replikują nabłonek dróg oddechowych na poziomie zbliżonym do fizjologicznego. Kolejną zaletą jest to, że protokół ten można łatwo dostosować do innych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie kroki są wykonywane w sterylnych warunkach (komora bezpieczeństwa biologicznego). Aby zapoznać się z kompozycjami pożywek wykorzystanymi w tym badaniu, patrz Tabela 1.

1. Przygotowanie materiału doświadczalnego

  1. Hodowla i ekspansja ludzkich normalnych komórek nabłonka płuc (HBEC3-KT) na standardowych plastikowych szalkach do hodowli komórek (kolby T75) w normalnej pożywce do wzrostu nabłonka przy użyciu standardowego inkubatora13 (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Dla lepszego wzrostu pożywkę można dodatkowo uzupełnić 10% płodową surowicą cielęcą (FCS).
  2. Posiew ludzkich fibroblastów (HS-5) w pożywce RPMI uzupełnionej 10% surowicą cielęcą płodu i penicyliną/streptomycyną10,14 (patrz Tabela 1).
  3. Przygotować rozgałęzione podłoże z organoidów płucnych (BLO-Medium), uzupełniając DMEM/F12 o N-2, B27, penicylinę-streptomycynę, albuminę surowicy bydlęcej, monotioglicerol, kwas askorbinowy, KGF/FGF7, FGF10, ATRA i CHIR99021. (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów).
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie podłoża na świeżo, co najmniej z dodatkiem KGF/FGF7, FGF10, ATRA i CHIR99021. Jeżeli w krótkim czasie potrzebna jest większa ilość podłoża, zaleca się jedynie krótki okres przechowywania wynoszący kilka dni (do 1 tygodnia) w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można zastosować dostępne na rynku podłoże do różnicowania organoidów dróg oddechowych PneumaCult.

2. Przygotowanie komórek nabłonkowych i fibroblastów

UWAGA: Użyj obu typów komórek, gdy komórki osiągną około 80% zbieżności. Przygotuj każdy typ komórki osobno.

  1. Usuń i wyrzuć pożywkę hodowlaną.
  2. Umyj komórki, krótko spłukując warstwę komórek 5 ml PBS.
  3. Trypsynizuj komórki nabłonka, dodając 2 ml 0,5% trypsyny-EDTA, a następnie krótką inkubację w temperaturze 37 °C przez 4-8 minut.
  4. Zebrać zaokrąglone i prawie oderwane komórki, dodając normalną pożywkę wzrostową lub PBS uzupełniony 10% FCS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
  5. Kilkakrotnie odpipetować odpowiednią objętość w górę i w dół w kolbie T75 (wzdłuż powierzchni wzrostu), aby dalej oddzielać grudki komórek i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Zebrać odpowiednio fibroblasty HS5 za pomocą trypsynizacji TE w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
  7. Osadzać każdy typ komórek (a zatem wolny od trypsyny) przez wirowanie (np. 300-400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej [RT]) i ponownie zawiesić (zarówno komórki nabłonka, jak i fibroblasty) w 1-2 ml normalnego nabłonkowego podłoża wzrostowego przed policzeniem.
  8. Określić liczbę żywotnych komórek przy użyciu odpowiedniej objętości ponownie zawieszonych komórek; każda rozcieńczona w 1/5 przy użyciu 0,4% barwienia błękitem trypanowym w komorze liczącej Neubauera pod mikroskopem.

3. Generacja kultur sferoidalnych 3D nabłonkowo-fibroblastowych

  1. Rozcieńczyć żądaną liczbę komórek w normalnym nabłonkowym pożywce wzrostowej za pomocą probówki o pojemności 15 ml. Obliczyć 2000 komórek nabłonka z 50 fibroblastami w 100 μl pożywki dla każdej studzienki z 96 płytek dołkowych. Wynikowe liczby komórek odpowiednie dla jednej płytki 96-dołkowej to 200 000 komórek HBEC i 5 000 fibroblastów HS5 w 10 ml normalnej pożywki wzrostowej nabłonka.
  2. Delikatnie wymieszać za pomocą sterylnych pipet serologicznych o pojemności 10 ml.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika odczynnika do mikropipety wielokanałowej.
  4. Zasiaj komórki na płytce o bardzo niskim mocowaniu, przenosząc 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki za pomocą (12-kanałowej) pipety wielokanałowej.
  5. Inkubować w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
    UWAGA: Powstawanie sferoidów ocenia się za pomocą regularnego badania mikroskopowego przy użyciu mikroskopu odwróconego oraz poprzez fotografowanie sferoid dla każdego pożądanego punktu czasowego.
  6. Po 4 dniach dodaj 100 μl BLO-Medium na studzienkę do wygenerowanych sferoid.
  7. Kontynuować inkubację w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.

4. Przeprowadzanie regularnej zmiany nośnika

  1. Po 7-8 dniach wykonuj regularną wymianę nośnika. Dlatego ustaw płytkę pod niewielkim kątem, aby sferoidy opadały w kierunku przechylania zgodnie z grawitacją.
  2. Ostrożnie i najlepiej jak to możliwe odessać supernatant za pomocą końcówki do pipety o pojemności 100-200 μl.
  3. Ponownie ustawić płytkę poziomo i napełnić ją 100-150 μl pożywki BLO na dołek (za pomocą pipety wielokanałowej)
  4. Kontynuować inkubację w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze lub rozpocząć eksperyment/zabieg.
    UWAGA: Sferoidy mogą być hodowane przez dłuższy czas (do 21 dni). Następnie należy przeprowadzić pełną wymianę podłoża co najmniej dwa razy w tygodniu.

5. Dalsze analizy (zbieranie sferoid)

  1. Wykonuj regularne badania mikroskopowe i dokumentację, wykonując zdjęcia w połączeniu z pomiarami wielkości sferoidów i obliczeniami objętości, co ostatecznie umożliwia ilościowe określenie wzrostu sferoidów i potencjalnych zmian wzrostu po zabiegach.
  2. Aby zobrazować żywe komórki w żądanych punktach czasowych, inkubuj sferoidy przez dodatkowe 15 minut z 1 μg/ml Hoechst 33342 (lub DAPI) do barwienia jąder i analizuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  3. Zbierz wytworzone sferoidy w żądanym punkcie czasowym za pomocą pipety o pojemności 200 μl z odciętym wylotem (utrzymuj sterylność) w celu zwiększenia średnicy. Dlatego należy również odessać pożywkę zawierającą sferoidę. Połącz i zbierz sferoidy w probówce o pojemności 2-5 ml. Po 2-5 minutach, gdy sferoidy zatoną pod wpływem grawitacji, usuń supernatant i przystąp do dalszej analizy.
  4. W celu wytworzenia całych sferoidalnych lizatów białkowych, należy dodać bezpośrednio lodowaty bufor do lizy (150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy) do probówki zawierającej zebrane sferoidy. Po dwóch do trzech cyklach zamrażania i rozmrażania określ zawartość białka w lizatach i przejdź do dalszej analizy, np. Western blot analysis15.
  5. W celu wytworzenia całych sferoidalnych lizatów RNA należy dodać bezpośrednio bufor do lizy RNA do probówki zawierającej zebrane sferoidy i przeprowadzić izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta odpowiedniego zestawu do izolacji RNA.
  6. W przypadku barwienia immunohistochemicznego (IHC) i immunofluorescencyjnego wykonaj kroki 5.6.1-5.6.3.
    1. Zebrane sferoidy należy potraktować 1-2 ml 4% soli fizjologicznej buforowanej paraformaldehydem/fosforanem (PBS) przez 30 minut, a następnie poddać zatapianiu i cięciu parafiny (3-5 μm).
    2. Przed barwieniem immunofluorescencyjnym należy przygotować próbki przy użyciu opadającej serii alkoholu i inkubacji z docelowym roztworem do pobierania. Następnie zablokuj preparaty roztworem blokującym (2% normalna surowica kozia/PBS) w celu zmniejszenia niespecyficznych interakcji i inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Wykrywanie antygenów za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych. Przeciwbarwienie jąder za pomocą DAPI. Wykonaj dodatkowe barwienie (np. zestaw do barwienia PAS) zgodnie z protokołami producenta do oceny histologicznej.
  7. W przypadku zawiesin jednokomórkowych wykonaj kroki 5.7.1 i 5.7.2.
    1. Ponownie zawiesić zebrane sferoidy w 1-2 ml TrypLE zawierającego 100 U/ml DNazy I, a następnie przeprowadzić 15-minutową inkubację w temperaturze 37 °C. Zatrzymać trawienie, dodając PBS zawierający 2-5% FCS, 2 mM EDTA i DNAzę I.
    2. Przepuścić roztwór komórkowy przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do świeżej stożkowej probówki przed dalszą analizą (np. cytometrią przepływową lub analizą pojedynczych komórek).
  8. W przypadku analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki wykonaj kroki 5.8.1-5.8.3.
    1. Oznaczyć różne zawiesiny jednokomórkowe będące przedmiotem zainteresowania, reprezentujące różne punkty czasowe lub zabiegi, używając zestawu do multipleksowania (ludzkiego) pojedynczych komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Następnie połącz próbki i załaduj je na tor na jednokomórkowy wkład, dążąc do 10 000-40 000 komórek.
    3. Pobierz pojedyncze komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i przygotowanie biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta oraz zsekwencjonuj wyizolowane RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten prosty protokół umożliwia bezmatrycyową sferoidalną kokultywację ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów z wykorzystaniem płytek o ultra-niskim przywieraniu (Rycina 1A). W procesie hodowli z początkowo utworzonych sferoidów stopniowo formują się bardziej złożone sferoidy płucne, przy czym efektywne powstawanie różnych struktur nabłonkowych i fibroblastycznych reprezentuje bezpośrednie interakcje komórkowe, co wykazano w analizach morfologicznych przy użyciu obrazowania żywych k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaproponowano modele hodowli komórkowych 3D w celu wypełnienia luki między hodowlami 2D a badaniami in vivo, ponieważ ten typ (ko)hodowli lepiej naśladuje fizjologiczne, morfologiczne i patologiczne właściwości obecne in vivo, ponieważ występuje więcej interakcji komórka-komórka podobnych do in vivo, interakcji komórka-ECM, odpowiedzi na bodźce, ekspresja genów, ekspresja białek i różnicowanie17, Rozdział 18. Oprócz licznych i czasami b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy stwierdzają, że nie ma osobistych ani instytucjonalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Mohammedowi Benchellalowi, Evie Gau, Sabine Senkel i Oldze Kruse za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 do D.K., SeniRad: 02NUK086C do V.J., D.K.) oraz przez Grupę Szkoleniową DFG ds. Badań Naukowych 2762.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylne pipety serologiczne 10 ml Sterylne pipety serologiczneThermoFischer170356N
rurki stożkowe 15 mlCorning430052lub równoważne
37 ° C/ 5% nawilżony CO2  inkubator
5 ml sterylne pipety serologiczne Sterylne pipety serologiczneThermoFischer170355N
stożkowa rurka 50 mlCorningCLS430829lub równoważne
ATRA (kwas All-Trans retinoi)StemCell TechnologiesCat#7226250 nM
B-27 (50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody WTA Amplification KitBD BioscienceCat#633801stosować zgodnie z instrukcją producenta
Szafa
Albumina surowicy bydlęcejRocheCat#BSAVHS-RO0,4% (v/v)
Sitko do komórekCorning352350Sokół 70 i mikro; m Sitko do komórek, białe, sterylne, pakowane pojedynczo
Eppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001np. Eppendorf Centrifuge 5804 - Wirówka stołowa
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 mL
DNazy I, bez RNaz (1  U/μ L)ThermoFischerCat#EN0521100 U/mL 
EDTA (0,5 M), pH 8,0, ThermoFischer bez RNazAM9260G2 mM
Eppendorf Research plus 12-kanałowa pipeta wielokanałowa Eppendorfnp. #3125000044 (10– 100 &mikro; L) lub #3125000060 (30– 300 i mikro; L)
Surowica płodu cielęcegoThermoFischer/GibcoCat#A525670110% (v/v)
HBEC3-KT ATCCCRL-4051ludzka normalna linia komórkowa nabłonka płuc 
Roztwór heparyny (0,2%)StemCell TechnologiesCat#79800,8 ml
Hoechst 33342 ThermoFischerCat#H13991 &mikro; g/ml
HS-5 ATCCCRL-3611ludzkie fibroblasty zrębu
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat#78173.110 ng / mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF StemCell TechnologiesCat#78186.110 ng/ml
Zestaw do multipleksowania ludzkich pojedynczych komórekBD BioscienceCat#633781stosować zgodnie z instrukcjami producenta
Roztwór podstawowy hydrokortyzyny StemCell TechnologiesCat#79260,5 ml na 500 ml
Laduviglusib (CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 µ M
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichCat#A9290250 µ g/ml
MikroskopZEISS
MonotioglicerolSigma-AldrichCat#M61450,4 &
M N-2 Suplement (100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
Komora licząca NeubauerMerckBR718605np. MARKA  komora licząca BLAUBRAND  Wzór Neubauera
Normalna surowica koziaThermoFischerCat#318732 % (v/v) in PBS
NP-40Merck/MilliporeCat#492016NP-40-Alternative, 1 %
PAS Zestaw do barwieniaSigma AldrichCat#1016460001stosować zgodnie z instrukcją producenta
PBSThermoFischerCat#100100231x
Penicylina-Streptomycyna (10.000  U/mL), 100xThermoFischer/GibcoCat#151401221x
PFAThermoFischerCat#J61899. AKParaformaldehyd, 4 % w PBS
PneumaCult Pożywka do różnicowania organoidów dróg oddechowych (ODM)StemCell TechnologiesCat#05060PneumaCult Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) i PneumaCult Suplement różnicowania organoidów dróg oddechowych* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus MediumStemCell TechnologiesCat#5040Zestaw składający się z PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 ml ) i PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Koktajl inhibitorów proteazyMerck/RocheCat#46931320011 tabletka/10 mL
Rhapsody cDNA KitBD BioscienceCat#633773stosować zgodnie z instrukcją producenta
RPMI 1640 MediumThermoFischer/GibcoCat#11875093500 mL
Chlorek soduMerck/Sigma-AldrichS9625150 mmol/L
Cytrynian soduMerck/Sigma-AldrichCat#1613859-1G0,10%
Deoksycholan soduMerck/Sigma-AldrichCat#309700,50%
Dodecylosiarczan sodu Merck/Sigma-AldrichCat#116672890010,10%
Sterylny zbiornik na odczynniki do mikropipet wielokanałowych (np. 60 ml)ThermoFischer9510037lub równoważny
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ckSarstedt (lub facellitate)83.3925.400 (lub F202003)płytka o bardzo niskim mocowaniu
Tris/HClThermoFischerCat#AM9855G50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100Sigma-AldrichCat#X100-5ML0.05 % 
Trypan Blue Stain (0,4%)ThermoFischerCat#152500611/5 (v/v) z NGM
TrypLEThermoFischerCat#126040131x
Trypsin-EDTA (0,5 %)ThermoFischerCat#154000540,05 % roztwór trypsyny-EDTA (TE) aseptyki rozcieńczony do 1X za pomocą roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (bez wapnia i magnezu)
Odczynnik WST-1CELLPRO-RO, RocheCat#5015944001odczynnik do proliferacji komórek 
Nunc lub równoważne Nunc lub równoważna Suplement bezpieczeństwa biologicznego

Bibliografia

  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rekkokultura sferoid wsferoidy nab onkowo fibroblastycznesferoidy bezmatrycowenab onek oskrzeli cz owiekakokultura fibroblast woddzia ywania mi dzykom rkowemimikra tkankowaprzesiewanie lek wmodel bezwykorzystania zwierz t

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.