Tutaj prezentujemy prosty i bardzo praktyczny, ale niezawodny protokół bezpośredniej sferoidalnej hodowli ludzkich komórek nabłonka płuc i fibroblastów bez polegania na matrycy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Tutaj prezentujemy prosty i bardzo praktyczny, ale niezawodny protokół bezpośredniej sferoidalnej hodowli ludzkich komórek nabłonka płuc i fibroblastów bez polegania na matrycy.
Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się coraz bardziej popularne ze względu na ich zdolność do odtwarzania naturalnych właściwości i architektury komórek, naśladując w ten sposób struktury tkankopodobne in vitro. Wśród tych modeli, hodowla sferycznych agregatów komórkowych (tzw. sferoidów) osadzonych w półstałej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) stanowi zaawansowany model hodowli komórkowej zbliżony do in vivo, ponieważ pozwala na uzyskanie różnych funkcjonalnych stanów komórek w wyniku interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, a także gradientów tlenu i składników odżywczych. Ponieważ sferoidy są technicznie mniej wymagające i stosunkowo niedrogie w uzyskaniu, są często stosowane w badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności, umożliwiając badania przesiewowe o wysokiej zawartości w celu testowania nowych leków w fazie przedklinicznej. W tym celu odtwarzane są głównie struktury 3D różnych nowotworów. Jednocześnie Matrigel jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych ECM i jest uważany za złoty standard w hodowli sferoidów i organoidów, chociaż jest to matryca 3D oparta na eksperymentach na myszach, której ekstrakcja - podobnie jak testy na zwierzętach w ogóle - wiąże się z poważnymi obawami etycznymi. W tym miejscu przedstawiamy bezmacierzowy protokół bezpośredniej sferoidalnej kohodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów, który można uznać za zoptymalizowaną metodę kohodowli, szczególnie w odniesieniu do komunikacji nabłonkowo-fibroblastowej i interakcji w obrębie odpowiednich sferoid, bez polegania na (zwierzęcej) matrycy nośnej. Ustanawiając te swobodnie pływające współkultury sferoidalne nabłonkowo-fibroblastoidalne jako zorientowaną na pacjenta platformę in vitro do modelowania normalnej toksyczności tkanki (płucnej) podejść terapeutycznych przeciwnowotworowych, można osiągnąć nie tylko zmniejszenie liczby zwierząt doświadczalnych, ale także odpowiednie i znaczące zastąpienie odpowiednich doświadczeń na zwierzętach.
Dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek, w których płaskie komórki jednowarstwowe są hodowane, ekspandowane, a następnie powlekane do testów badawczych opartych na komórkach, pozostają łatwą, wygodną, opłacalną i szeroko stosowaną metodą dla standardowych przedklinicznych procedur przesiewowych1,2. Do badania interaktywnych (parakrynnych) przesłuchów między różnymi typami komórek in vitro można użyć kondycjonowanej pożywki z jednego typu komórki do stymulacji innego typu komórek. Ponadto pojawiły się różne metody kohodowli, np. metody pośrednie, w których współhodowane komórki są fizycznie oddzielane za pom....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie kroki są wykonywane w sterylnych warunkach (komora bezpieczeństwa biologicznego). Aby zapoznać się z kompozycjami pożywek wykorzystanymi w tym badaniu, patrz Tabela 1.
1. Przygotowanie materiału doświadczalnego
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten prosty protokół umożliwia bezmatrycyową sferoidalną kokultywację ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów z wykorzystaniem płytek o ultra-niskim przywieraniu (Rycina 1A). W procesie hodowli z początkowo utworzonych sferoidów stopniowo formują się bardziej złożone sferoidy płucne, przy czym efektywne powstawanie różnych struktur nabłonkowych i fibroblastycznych reprezentuje bezpośrednie interakcje komórkowe, co wykazano w analizach morfologicznych przy użyciu obrazowania żywych k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zaproponowano modele hodowli komórkowych 3D w celu wypełnienia luki między hodowlami 2D a badaniami in vivo, ponieważ ten typ (ko)hodowli lepiej naśladuje fizjologiczne, morfologiczne i patologiczne właściwości obecne in vivo, ponieważ występuje więcej interakcji komórka-komórka podobnych do in vivo, interakcji komórka-ECM, odpowiedzi na bodźce, ekspresja genów, ekspresja białek i różnicowanie17, Rozdział 18. Oprócz licznych i czasami b.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy stwierdzają, że nie ma osobistych ani instytucjonalnych konfliktów interesów.
Dziękujemy Mohammedowi Benchellalowi, Evie Gau, Sabine Senkel i Oldze Kruse za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 do D.K., SeniRad: 02NUK086C do V.J., D.K.) oraz przez Grupę Szkoleniową DFG ds. Badań Naukowych 2762.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylne pipety serologiczne 10 ml | Sterylne pipety serologiczne | ThermoFischer | 170356N |
| rurki stożkowe 15 ml | Corning | 430052 | lub równoważne |
| 37 ° C/ 5% nawilżony CO2 inkubator | |||
| 5 ml sterylne pipety serologiczne | Sterylne pipety serologiczne | ThermoFischer | 170355N |
| stożkowa rurka 50 ml | Corning | CLS430829 | lub równoważne |
| ATRA (kwas All-Trans retinoi) | StemCell Technologies | Cat#72262 | 50 nM |
| B-27 (50x), | ThermoFischer/Gibco | Cat#17504044 | 1x |
| BD Rhapsody WTA Amplification Kit | BD Bioscience | Cat#633801 | stosować zgodnie z instrukcją producenta |
| Szafa | |||
| Albumina surowicy bydlęcej | Roche | Cat#BSAVHS-RO | 0,4% (v/v) |
| Sitko do komórek | Corning | 352350 | Sokół 70 i mikro; m Sitko do komórek, białe, sterylne, pakowane pojedynczo |
| Eppendorf | https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001 | np. Eppendorf Centrifuge 5804 - Wirówka stołowa | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | Cat#11330-032 | 500 mL |
| DNazy I, bez RNaz (1 U/μ L) | ThermoFischer | Cat#EN0521 | 100 U/mL |
| EDTA (0,5 M), pH 8,0, ThermoFischer bez RNaz | AM9260G | 2 mM | |
| Eppendorf Research plus 12-kanałowa pipeta wielokanałowa | Eppendorf | np. #3125000044 (10– 100 &mikro; L) lub #3125000060 (30– 300 i mikro; L) | |
| Surowica płodu cielęcego | ThermoFischer/Gibco | Cat#A5256701 | 10% (v/v) |
| HBEC3-KT | ATCC | CRL-4051 | ludzka normalna linia komórkowa nabłonka płuc |
| Roztwór heparyny (0,2%) | StemCell Technologies | Cat#7980 | 0,8 ml |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer | Cat#H1399 | 1 &mikro; g/ml |
| HS-5 | ATCC | CRL-3611 | ludzkie fibroblasty zrębu |
| Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF | StemCell Technologies | Cat#78173.1 | 10 ng / mL |
| Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF | StemCell Technologies | Cat#78186.1 | 10 ng/ml |
| Zestaw do multipleksowania ludzkich pojedynczych komórek | BD Bioscience | Cat#633781 | stosować zgodnie z instrukcjami producenta |
| Roztwór podstawowy hydrokortyzyny | StemCell Technologies | Cat#7926 | 0,5 ml na 500 ml |
| Laduviglusib (CHIR-99021) | Biozol/Selleckchem | Cat#S1263 | 3 µ M |
| Kwas L-askorbinowy | Sigma-Aldrich | Cat#A92902 | 50 µ g/ml |
| Mikroskop | ZEISS | ||
| Monotioglicerol | Sigma-Aldrich | Cat#M6145 | 0,4 & |
| M N-2 Suplement (100x) | ThermoFischer/Gibco | Cat#17502048 | 1x |
| Komora licząca Neubauer | Merck | BR718605 | np. MARKA komora licząca BLAUBRAND Wzór Neubauera |
| Normalna surowica kozia | ThermoFischer | Cat#31873 | 2 % (v/v) in PBS |
| NP-40 | Merck/Millipore | Cat#492016 | NP-40-Alternative, 1 % |
| PAS Zestaw do barwienia | Sigma Aldrich | Cat#1016460001 | stosować zgodnie z instrukcją producenta |
| PBS | ThermoFischer | Cat#10010023 | 1x |
| Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/mL), 100x | ThermoFischer/Gibco | Cat#15140122 | 1x |
| PFA | ThermoFischer | Cat#J61899. AK | Paraformaldehyd, 4 % w PBS |
| PneumaCult Pożywka do różnicowania organoidów dróg oddechowych (ODM) | StemCell Technologies | Cat#05060 | PneumaCult Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) i PneumaCult Suplement różnicowania organoidów dróg oddechowych* (#05063, 40 mL) |
| PneumaCult Ex Plus Medium | StemCell Technologies | Cat#5040 | Zestaw składający się z PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 ml ) i PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL) |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Merck/Roche | Cat#4693132001 | 1 tabletka/10 mL |
| Rhapsody cDNA Kit | BD Bioscience | Cat#633773 | stosować zgodnie z instrukcją producenta |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFischer/Gibco | Cat#11875093 | 500 mL |
| Chlorek sodu | Merck/Sigma-Aldrich | S9625 | 150 mmol/L |
| Cytrynian sodu | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#1613859-1G | 0,10% |
| Deoksycholan sodu | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#30970 | 0,50% |
| Dodecylosiarczan sodu | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#11667289001 | 0,10% |
| Sterylny zbiornik na odczynniki do mikropipet wielokanałowych (np. 60 ml) | ThermoFischer | 9510037 | lub równoważny |
| TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck | Sarstedt (lub facellitate) | 83.3925.400 (lub F202003) | płytka o bardzo niskim mocowaniu |
| Tris/HCl | ThermoFischer | Cat#AM9855G | 50 mmol/L , pH 8 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat#X100-5ML | 0.05 % |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | ThermoFischer | Cat#15250061 | 1/5 (v/v) z NGM |
| TrypLE | ThermoFischer | Cat#12604013 | 1x |
| Trypsin-EDTA (0,5 %) | ThermoFischer | Cat#15400054 | 0,05 % roztwór trypsyny-EDTA (TE) aseptyki rozcieńczony do 1X za pomocą roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (bez wapnia i magnezu) |
| Odczynnik WST-1 | CELLPRO-RO, Roche | Cat#5015944001 | odczynnik do proliferacji komórek |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny