Generowanie swobodnie unoszących się normalnych ludzkich sferoidalnych kultur sferoidalnych nabłonka i fibroblastów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prosty i bardzo praktyczny, ale niezawodny protokół bezpośredniej sferoidalnej hodowli ludzkich komórek nabłonka płuc i fibroblastów bez polegania na matrycy.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się coraz bardziej popularne ze względu na ich zdolność do odtwarzania naturalnych właściwości i architektury komórek, naśladując w ten sposób struktury tkankopodobne in vitro. Wśród tych modeli, hodowla sferycznych agregatów komórkowych (tzw. sferoidów) osadzonych w półstałej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) stanowi zaawansowany model hodowli komórkowej zbliżony do in vivo, ponieważ pozwala na uzyskanie różnych funkcjonalnych stanów komórek w wyniku interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, a także gradientów tlenu i składników odżywczych. Ponieważ sferoidy są technicznie mniej wymagające i stosunkowo niedrogie w uzyskaniu, są często stosowane w badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności, umożliwiając badania przesiewowe o wysokiej zawartości w celu testowania nowych leków w fazie przedklinicznej. W tym celu odtwarzane są głównie struktury 3D różnych nowotworów. Jednocześnie Matrigel jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych ECM i jest uważany za złoty standard w hodowli sferoidów i organoidów, chociaż jest to matryca 3D oparta na eksperymentach na myszach, której ekstrakcja - podobnie jak testy na zwierzętach w ogóle - wiąże się z poważnymi obawami etycznymi. W tym miejscu przedstawiamy bezmacierzowy protokół bezpośredniej sferoidalnej kohodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów, który można uznać za zoptymalizowaną metodę kohodowli, szczególnie w odniesieniu do komunikacji nabłonkowo-fibroblastowej i interakcji w obrębie odpowiednich sferoid, bez polegania na (zwierzęcej) matrycy nośnej. Ustanawiając te swobodnie pływające współkultury sferoidalne nabłonkowo-fibroblastoidalne jako zorientowaną na pacjenta platformę in vitro do modelowania normalnej toksyczności tkanki (płucnej) podejść terapeutycznych przeciwnowotworowych, można osiągnąć nie tylko zmniejszenie liczby zwierząt doświadczalnych, ale także odpowiednie i znaczące zastąpienie odpowiednich doświadczeń na zwierzętach.

Wprowadzenie

Dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek, w których płaskie komórki jednowarstwowe są hodowane, ekspandowane, a następnie powlekane do testów badawczych opartych na komórkach, pozostają łatwą, wygodną, opłacalną i szeroko stosowaną metodą dla standardowych przedklinicznych procedur przesiewowych1^,2. Do badania interaktywnych (parakrynnych) przesłuchów między różnymi typami komórek in vitro można użyć kondycjonowanej pożywki z jednego typu komórki do stymulacji innego typu komórek. Ponadto pojawiły się różne metody kohodowli, np. metody pośrednie, w których współhodowane komórki są fizycznie oddzielane za pomocą mikroporowatej membrany. Te "systemy Transwell" zawierają wkładkę (mikroporowatą membranę), która jest umieszczona w tradycyjnej płytce do hodowli komórkowej 2D. Jeden typ komórki jest następnie wysiewany i hodowany na błonie, dzieląc te same podłoża, co drugi typ rosnący na studni towarzyszącej, umożliwiając w ten sposób dwukierunkową komunikację parakrynną². Te dwa typy komórek mogą być nawet rozsiane po obu stronach błony, tworząc bardziej bezpośrednią kokulturę kontaktową między komórkami, która jest odpowiednia do badania tkanek o strukturze barierowej^3,4.

Jednak odpowiedzi komórkowe tych nawet zaawansowanych systemów hodowli komórkowych 2D nie zawsze odzwierciedlają wyniki odpowiednich eksperymentów na zwierzętach, a nawet badań klinicznych, co wynika, między innymi, z braku bezpośredniej sygnalizacji między różnymi typami komórek, a tym samym braku organizacji komórkowych podobnych do in vivo. Dlatego trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się coraz bardziej popularne ze względu na możliwości naturalnych cech komórek i architektur naśladujących struktury tkankopodobne in vitro^5,6. Wśród tych modeli, hodowla sferycznych agregatów komórkowych, zwanych sferoidami, osadzonych w półstałych matrycach zewnątrzkomórkowych, zapewnia bardziej zaawansowany model kohodowli komórek, w którym można osiągnąć różne funkcjonalne stany komórkowe po interakcjach komórka-komórka i komórka-ECM, a także gradienty tlenu i odżywiania⁷. Te pożądane, bardziej złożone, podobne do in vivo hodowle in vitro 3D powinny być generowane i utrzymywane w jednorodności pod względem rozmiarów składania komórek, jednocześnie promując rozwój i różnicowanie komórek, a jednocześnie być skuteczne, szybkie, spójne i wygodne^7,8.

Korzystając z naturalnych cech autoagregacji i adhezji, sferoidy (głównie sferoidy nowotworowe) są zwykle generowane przy użyciu techniki wiszącej kropli^9,10. Jako jedna z pierwszych technik stosowanych do generowania ciał embrionalnych, test wiszącej kropli stał się szeroko stosowaną metodą generowania licznych jednorodnych sferoid w oparciu o zasady grawitacji i napięcia powierzchniowego przed osadzeniem ECM przy użyciu Matrigel, "złotego standardu" matryc zewnątrzkomórkowych, chociaż opartego na myszy. Podjęto znaczne wysiłki, aby wygenerować sferoidy w podejściach bez rusztowań^8,11. Na przykład, sferoidy mogą być generowane za pomocą butelki do hodowli komórkowych z mieszadłem, zapobiegając w ten sposób wysiewaniu komórek, co jest najprostszą metodą produkcji sferoidów na dużą skalę¹².

Najtrudniejszą rzeczą w kompleksowym tworzeniu kultur komórkowych, a tym samym w ustanowieniu fizjologicznie wartościowego systemu, jak w przypadku alternatyw in vivo in vitro w swoim laboratorium, są skomplikowane protokoły z wieloma różnymi krokami (które nadal muszą zostać ustalone). Na przykład, generowanie struktur komórkowych najpierw za pomocą metody, zbieranie ich, a następnie osadzanie w matrycy, zwłaszcza użycie matryc, które nie są łatwe w obsłudze, to krytyczne kroki, które wymagają bardziej przekonującego zastosowania, zanim metoda będzie mogła być stosowana rutynowo i seryjnie. Tutaj użyliśmy bardzo niskiej płytki przyłączeniowej w formacie 96 dołków, która pozwala praktycznie na brak przyłączania komórek do materiału hodowlanego w celu ustanowienia złożonych sferoid 3D komórek nabłonka płuc i fibroblastów. Powstałe w ten sposób sferoidy powstają bardzo jednorodnie i dość szybko w ciągu 24 godzin, co skraca czas eksperymentu. Przedłużona hodowla, a tym samym niezawodny wzrost i różnicowanie komórek, odbywa się w tym samym dołku przez cały okres, tak że po wstępnym posiewie wystarczy wymienić tylko pożywkę przez cały okres uprawy. Dlatego przedstawiamy bardzo prosty, szybki, a co za tym idzie wysoce praktyczny protokół generowania sferoid płuc ludzkich, które morfologicznie i funkcjonalnie replikują nabłonek dróg oddechowych na poziomie zbliżonym do fizjologicznego. Kolejną zaletą jest to, że protokół ten można łatwo dostosować do innych komórek.

Protokół

Wszystkie kroki są wykonywane w sterylnych warunkach (komora bezpieczeństwa biologicznego). Aby zapoznać się z kompozycjami pożywek wykorzystanymi w tym badaniu, patrz Tabela 1.

1. Przygotowanie materiału doświadczalnego

1. Hodowla i ekspansja ludzkich normalnych komórek nabłonka płuc (HBEC3-KT) na standardowych plastikowych szalkach do hodowli komórek (kolby T75) w normalnej pożywce do wzrostu nabłonka przy użyciu standardowego inkubatora¹³ (patrz Tabela 1).
   UWAGA: Dla lepszego wzrostu pożywkę można dodatkowo uzupełnić 10% płodową surowicą cielęcą (FCS).
2. Posiew ludzkich fibroblastów (HS-5) w pożywce RPMI uzupełnionej 10% surowicą cielęcą płodu i penicyliną/streptomycyną^10,14 (patrz Tabela 1).
3. Przygotować rozgałęzione podłoże z organoidów płucnych (BLO-Medium), uzupełniając DMEM/F12 o N-2, B27, penicylinę-streptomycynę, albuminę surowicy bydlęcej, monotioglicerol, kwas askorbinowy, KGF/FGF7, FGF10, ATRA i CHIR99021. (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów).
   UWAGA: Zaleca się przygotowanie podłoża na świeżo, co najmniej z dodatkiem KGF/FGF7, FGF10, ATRA i CHIR99021. Jeżeli w krótkim czasie potrzebna jest większa ilość podłoża, zaleca się jedynie krótki okres przechowywania wynoszący kilka dni (do 1 tygodnia) w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można zastosować dostępne na rynku podłoże do różnicowania organoidów dróg oddechowych PneumaCult.

2. Przygotowanie komórek nabłonkowych i fibroblastów

UWAGA: Użyj obu typów komórek, gdy komórki osiągną około 80% zbieżności. Przygotuj każdy typ komórki osobno.

1. Usuń i wyrzuć pożywkę hodowlaną.
2. Umyj komórki, krótko spłukując warstwę komórek 5 ml PBS.
3. Trypsynizuj komórki nabłonka, dodając 2 ml 0,5% trypsyny-EDTA, a następnie krótką inkubację w temperaturze 37 °C przez 4-8 minut.
4. Zebrać zaokrąglone i prawie oderwane komórki, dodając normalną pożywkę wzrostową lub PBS uzupełniony 10% FCS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
5. Kilkakrotnie odpipetować odpowiednią objętość w górę i w dół w kolbie T75 (wzdłuż powierzchni wzrostu), aby dalej oddzielać grudki komórek i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
6. Zebrać odpowiednio fibroblasty HS5 za pomocą trypsynizacji TE w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
7. Osadzać każdy typ komórek (a zatem wolny od trypsyny) przez wirowanie (np. 300-400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej [RT]) i ponownie zawiesić (zarówno komórki nabłonka, jak i fibroblasty) w 1-2 ml normalnego nabłonkowego podłoża wzrostowego przed policzeniem.
8. Określić liczbę żywotnych komórek przy użyciu odpowiedniej objętości ponownie zawieszonych komórek; każda rozcieńczona w 1/5 przy użyciu 0,4% barwienia błękitem trypanowym w komorze liczącej Neubauera pod mikroskopem.

3. Generacja kultur sferoidalnych 3D nabłonkowo-fibroblastowych

1. Rozcieńczyć żądaną liczbę komórek w normalnym nabłonkowym pożywce wzrostowej za pomocą probówki o pojemności 15 ml. Obliczyć 2000 komórek nabłonka z 50 fibroblastami w 100 μl pożywki dla każdej studzienki z 96 płytek dołkowych. Wynikowe liczby komórek odpowiednie dla jednej płytki 96-dołkowej to 200 000 komórek HBEC i 5 000 fibroblastów HS5 w 10 ml normalnej pożywki wzrostowej nabłonka.
2. Delikatnie wymieszać za pomocą sterylnych pipet serologicznych o pojemności 10 ml.
3. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika odczynnika do mikropipety wielokanałowej.
4. Zasiaj komórki na płytce o bardzo niskim mocowaniu, przenosząc 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki za pomocą (12-kanałowej) pipety wielokanałowej.
5. Inkubować w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze.
   UWAGA: Powstawanie sferoidów ocenia się za pomocą regularnego badania mikroskopowego przy użyciu mikroskopu odwróconego oraz poprzez fotografowanie sferoid dla każdego pożądanego punktu czasowego.
6. Po 4 dniach dodaj 100 μl BLO-Medium na studzienkę do wygenerowanych sferoid.
7. Kontynuować inkubację w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze.

4. Przeprowadzanie regularnej zmiany nośnika

1. Po 7-8 dniach wykonuj regularną wymianę nośnika. Dlatego ustaw płytkę pod niewielkim kątem, aby sferoidy opadały w kierunku przechylania zgodnie z grawitacją.
2. Ostrożnie i najlepiej jak to możliwe odessać supernatant za pomocą końcówki do pipety o pojemności 100-200 μl.
3. Ponownie ustawić płytkę poziomo i napełnić ją 100-150 μl pożywki BLO na dołek (za pomocą pipety wielokanałowej)
4. Kontynuować inkubację w standardowych warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze lub rozpocząć eksperyment/zabieg.
   UWAGA: Sferoidy mogą być hodowane przez dłuższy czas (do 21 dni). Następnie należy przeprowadzić pełną wymianę podłoża co najmniej dwa razy w tygodniu.

5. Dalsze analizy (zbieranie sferoid)

1. Wykonuj regularne badania mikroskopowe i dokumentację, wykonując zdjęcia w połączeniu z pomiarami wielkości sferoidów i obliczeniami objętości, co ostatecznie umożliwia ilościowe określenie wzrostu sferoidów i potencjalnych zmian wzrostu po zabiegach.
2. Aby zobrazować żywe komórki w żądanych punktach czasowych, inkubuj sferoidy przez dodatkowe 15 minut z 1 μg/ml Hoechst 33342 (lub DAPI) do barwienia jąder i analizuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
3. Zbierz wytworzone sferoidy w żądanym punkcie czasowym za pomocą pipety o pojemności 200 μl z odciętym wylotem (utrzymuj sterylność) w celu zwiększenia średnicy. Dlatego należy również odessać pożywkę zawierającą sferoidę. Połącz i zbierz sferoidy w probówce o pojemności 2-5 ml. Po 2-5 minutach, gdy sferoidy zatoną pod wpływem grawitacji, usuń supernatant i przystąp do dalszej analizy.
4. W celu wytworzenia całych sferoidalnych lizatów białkowych, należy dodać bezpośrednio lodowaty bufor do lizy (150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy) do probówki zawierającej zebrane sferoidy. Po dwóch do trzech cyklach zamrażania i rozmrażania określ zawartość białka w lizatach i przejdź do dalszej analizy, np. Western blot analysis¹⁵.
5. W celu wytworzenia całych sferoidalnych lizatów RNA należy dodać bezpośrednio bufor do lizy RNA do probówki zawierającej zebrane sferoidy i przeprowadzić izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta odpowiedniego zestawu do izolacji RNA.
6. W przypadku barwienia immunohistochemicznego (IHC) i immunofluorescencyjnego wykonaj kroki 5.6.1-5.6.3.
   1. Zebrane sferoidy należy potraktować 1-2 ml 4% soli fizjologicznej buforowanej paraformaldehydem/fosforanem (PBS) przez 30 minut, a następnie poddać zatapianiu i cięciu parafiny (3-5 μm).
   2. Przed barwieniem immunofluorescencyjnym należy przygotować próbki przy użyciu opadającej serii alkoholu i inkubacji z docelowym roztworem do pobierania. Następnie zablokuj preparaty roztworem blokującym (2% normalna surowica kozia/PBS) w celu zmniejszenia niespecyficznych interakcji i inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Wykrywanie antygenów za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych. Przeciwbarwienie jąder za pomocą DAPI. Wykonaj dodatkowe barwienie (np. zestaw do barwienia PAS) zgodnie z protokołami producenta do oceny histologicznej.
7. W przypadku zawiesin jednokomórkowych wykonaj kroki 5.7.1 i 5.7.2.
   1. Ponownie zawiesić zebrane sferoidy w 1-2 ml TrypLE zawierającego 100 U/ml DNazy I, a następnie przeprowadzić 15-minutową inkubację w temperaturze 37 °C. Zatrzymać trawienie, dodając PBS zawierający 2-5% FCS, 2 mM EDTA i DNAzę I.
   2. Przepuścić roztwór komórkowy przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do świeżej stożkowej probówki przed dalszą analizą (np. cytometrią przepływową lub analizą pojedynczych komórek).
8. W przypadku analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki wykonaj kroki 5.8.1-5.8.3.
   1. Oznaczyć różne zawiesiny jednokomórkowe będące przedmiotem zainteresowania, reprezentujące różne punkty czasowe lub zabiegi, używając zestawu do multipleksowania (ludzkiego) pojedynczych komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Następnie połącz próbki i załaduj je na tor na jednokomórkowy wkład, dążąc do 10 000-40 000 komórek.
   3. Pobierz pojedyncze komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i przygotowanie biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta oraz zsekwencjonuj wyizolowane RNA.

Wyniki

Ten prosty protokół umożliwia bezmatrycową sferoidalną kohodowlę ludzkich komórek nabłonka oskrzeli i fibroblastów w połączeniu z ultra niskimi płytkami mocującymi (Rysunek 1A). Podczas procesu hodowli bardziej złożone sferoidy płuc stopniowo tworzą się z początkowo wygenerowanych sferoidów, z wydajnym generowaniem różnych struktur nabłonkowych i fibroblastycznych reprezentujących bezpośrednie interakcje komórkowe, co ujawniono w analizach morfologicznych przy użyciu obrazowania żywych komórek (

Dyskusja

Zaproponowano modele hodowli komórkowych 3D w celu wypełnienia luki między hodowlami 2D a badaniami in vivo, ponieważ ten typ (ko)hodowli lepiej naśladuje fizjologiczne, morfologiczne i patologiczne właściwości obecne in vivo, ponieważ występuje więcej interakcji komórka-komórka podobnych do in vivo, interakcji komórka-ECM, odpowiedzi na bodźce, ekspresja genów, ekspresja białek i różnicowanie^{17, Rozdział 18}. Oprócz licznych i czasami b...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylne pipety serologiczne 10 ml	Sterylne pipety serologiczne	ThermoFischer	170356N
rurki stożkowe 15 ml	Corning	430052	lub równoważne
37 ° C/ 5% nawilżony CO2  inkubator
5 ml sterylne pipety serologiczne	Sterylne pipety serologiczne	ThermoFischer	170355N
stożkowa rurka 50 ml	Corning	CLS430829	lub równoważne
ATRA (kwas All-Trans retinoi)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	stosować zgodnie z instrukcją producenta
Szafa
Albumina surowicy bydlęcej	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Sitko do komórek	Corning	352350	Sokół 70 i mikro; m Sitko do komórek, białe, sterylne, pakowane pojedynczo
	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	np. Eppendorf Centrifuge 5804 - Wirówka stołowa
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNazy I, bez RNaz (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0, ThermoFischer bez RNaz		AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus 12-kanałowa pipeta wielokanałowa	Eppendorf		np. #3125000044 (10– 100 &mikro; L) lub #3125000060 (30– 300 i mikro; L)
Surowica płodu cielęcego	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	ludzka normalna linia komórkowa nabłonka płuc
Roztwór heparyny (0,2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 ml
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 &mikro; g/ml
HS-5	ATCC	CRL-3611	ludzkie fibroblasty zrębu
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng / mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/ml
Zestaw do multipleksowania ludzkich pojedynczych komórek	BD Bioscience	Cat#633781	stosować zgodnie z instrukcjami producenta
Roztwór podstawowy hydrokortyzyny	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 ml na 500 ml
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ M
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/ml
Mikroskop	ZEISS
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0,4 &
M N-2 Suplement (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
Komora licząca Neubauer	Merck	BR718605	np. MARKA  komora licząca BLAUBRAND  Wzór Neubauera
Normalna surowica kozia	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) in PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Zestaw do barwienia	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	stosować zgodnie z instrukcją producenta
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicylina-Streptomycyna (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldehyd, 4 % w PBS
PneumaCult Pożywka do różnicowania organoidów dróg oddechowych (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) i PneumaCult Suplement różnicowania organoidów dróg oddechowych* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Zestaw składający się z PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 ml ) i PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Koktajl inhibitorów proteazy	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 tabletka/10 mL
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	stosować zgodnie z instrukcją producenta
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Chlorek sodu	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Cytrynian sodu	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0,10%
Deoksycholan sodu	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0,50%
Dodecylosiarczan sodu	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Sterylny zbiornik na odczynniki do mikropipet wielokanałowych (np. 60 ml)	ThermoFischer	9510037	lub równoważny
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (lub facellitate)	83.3925.400 (lub F202003)	płytka o bardzo niskim mocowaniu
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Trypan Blue Stain (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) z NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
Trypsin-EDTA (0,5 %)	ThermoFischer	Cat#15400054	0,05 % roztwór trypsyny-EDTA (TE) aseptyki rozcieńczony do 1X za pomocą roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (bez wapnia i magnezu)
Odczynnik WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	odczynnik do proliferacji komórek