Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Automatyzacja implantacji guzów w larwach danio dano młodego dla badań i medycyny nowotworowej

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68441

⸱

19 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Norwegian Centre for Molecular Biosciences and Medicine (NCMBM), University of Oslo, 2Life Science Methods BV, 3BioReperia AB, 4ZeClinics SL, 5Division of Diagnostics and Specialist Medicine, Linköping University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół automatycznego wszczepiania ksenoprzeszczepu nowotworowego larwam danio pręgowanego za pomocą nowoczesnego robotycznego systemu iniekcji. Ponadto prezentujemy filmy z iniekcjami oraz dane walidacyjne pokazujące skuteczną wydajność systemu.

Streszczenie

Zastrzyki z larw danio pręgowanych, w tym ksenoprzeszczepienie guzów podskórnych i ortotopowych mózgu oraz dożylne podawanie leków, stały się kluczowymi technikami badań nad danio pręgowanymi. Procedury te jednak pozostają żmudne, technicznie wymagające i silnie zależne od umiejętności operatora, ograniczając przepustowość i powtarzalność. Aby rozwiązać te ograniczenia, wprowadzamy zaawansowany system robotyczny, który automatyzuje mikrozastrzyki w larwy danio pręgowanego, znacząco poprawiając wydajność, precyzję i powtarzalność w porównaniu do ręcznych wstrzykiwań. Przedstawiamy szczegółowy protokół obsługi automatycznego wtryskiwacza, systemu o wysokiej przepustowości zdolnym do dostarczania cieczy, cząstek lub komórek nowotworowych w trzech różnych miejscach anatomicznych z wyższą dokładnością i szybkością niż wykwalifikowani badacze danio danio. Przedstawiamy kluczowe kroki, w tym konfigurację, kalibrację, procedury wstrzykiwania oraz rozwiązywanie problemów, aby zapewnić optymalną wydajność. Ponadto przedstawiamy reprezentatywne przykłady wyników pracy z robotem oraz omawiamy jego potencjał do ułatwiania zastrzyków larwalnych na dużą skalę, w tym do badań lekowych i medycyny precyzyjnej. Integrując zautomatyzowany wstrzykiwacz z przepływem pracy, naukowcy mogą przezwyciężyć ograniczenia manualnych zastrzyków i przyspieszyć przedkliniczne odkrywanie leków oraz spersonalizowany wybór leczenia.

Wprowadzenie

W miarę jak nasze rozumienie zachowań onkologicznych i oporności na leki się rozwija, coraz wyraźniej staje się potrzeba lepszej diagnozy, charakteryzacji i terapeutycznego celowania podtypów nowotworów. W ciągu ostatnich dwudziestu lat liczba publikacji z zakresu medycyny spersonalizowanej (znanej również jako medycyna precyzyjna) wzrosłao 1,2. Rzeczywiście, medycyna precyzyjna definiowana jest jako praktyka dostosowywania leczenia medycznego do cech choroby konkretnego pacjenta3. Jest to zgodne z naszym obecnym rozumieniem, że nie istnieje podejście typu "jeden lek dla wszystkich", co stało się szczególnie jasne i istotne w terapii nowotworów. Obecnie jednak brak klinicznie istotnych podejść do medycyny precyzyjnej dla większości pacjentów onkologicznych sprawia, że wybór najodpowiedniejszej strategii leczenia odbywa się metodą prób i błędów. Powoduje to znaczne opóźnienia i niepotrzebny dyskomfort, pogorszenie jakości życia i skrócenie przeżycia. Co ważne, pacjent z obniżoną jakością życia po kilku nieskutecznych schematach chemioterapii może zdecydować się na leczenie paliatywne4. Dzięki odpowiedniej, spersonalizowanej metodzie przesiewowej wybór leku może być przeprowadzany z większą precyzją i bez opóźnień. Chociaż możliwe jest przeprowadzenie sekwencjonowania genetycznego i proteomicznego na komórkach nowotworowych5, takie dane molekularne są ogólnie słabo przewidujące wyniki leczenia i często mają niewielką wartość kliniczną6. W rozwoju leków jak najwcześniejsze zastosowanie precyzyjnego podejścia medycyny znacznie zwiększa wskaźniki sukcesu na różnych etapach rozwoju leków. Rzeczywiście, wczesne zrozumienie, które kandydaty na leki mają najszerszy profil skuteczności międzyindywidualnej lub które podtypy nowotworów są szczególnie wrażliwe na każdego z nich, zmniejsza ryzyko i poprawia efektywność późnych testów przedklinicznych i badań klinicznych7. Wraz ze wzrostem kosztów badań i rozwoju farmaceutycznego8, rosnącą presją polityczną na obniżenie cen leków 9,10 oraz postępem w walidacji celów opartych na AI11, potrzeba szeroko zakrojonej, efektywnej i precyzyjnej metody przesiewowej w rozwoju leków nigdy wcześniej nie była większa.

Tutaj pojawiają się danio danio, a konkretnie larwy danio pręgowanego po 48 godzinach po zapłodnieniu (hpf). Modele ksenoprzeszczepów nowotworowych oparte na larwach danio pręgowanych jako gospodarzach stanowią szybką platformę przesiewową in vivo do prognozowania odpowiedzi klinicznych na chemioterapię 6,12,13,14. Modele ksenotransplanttu guza danio ruszowanego stały się potężną alternatywą zarówno dla medycyny precyzyjnej molekularnej (czyli genomiki lub patologii molekularnej do wyboru leczenia pacjentów onkologicznych), jak i badań organoidów i ksenotransplanttów myszy w przedklinicznym rozwoju leków15,16. W ksenoprzecie nowotworów danio pręgowanego fluorescencyjne komórki nowotworowe (znakowane genetycznie lub chemicznie) są przeszczepiane w larwy danio pręgowanego z wysoką efektywnością13. Leki lub kandydaci na leki o stosunkowo szybkim sposobie działania (np. takie, które bezpośrednio lub pośrednio celują w żywotność komórek nowotworowych, na przykład poprzez aktywację cytotoksyczności limfocytorycznych T) mogą być następnie przesiewane w ciągu zaledwie trzech dni, co prowadzi do szybkich, funkcjonalnych wyników skuteczności leków przeciwnowotworowych i przeciwprzerzutowych. Następnie można dokonać świadomego wyboru terapii, która wykazuje dobrą skuteczność, a badania pokazują, że powinno to przekładać się na silny wynik leczenia dla pacjenta lub szansę powodzenia w projektach rozwoju leków odpowiednio12, 17, 18, 19. Ponadto ten proces przesiewowy jest niezwykle istotny przy wyborze związków, które zostaną przesunięte do rozwoju leków.

Aby jednak model ksenograftu nowotworowego danio pręgowanego (ZTX) stał się skutecznym narzędziem diagnostycznym w warunkach klinicznych i umożliwił przeprowadzanie szeroko zakrojonych badań nad lekami oraz umożliwić przeprowadzenie badań leków na podstawie badań nad nowotworem (ZTX), model nowotworowego ksenograftu danio pręgowanego (ZTX) musi być szybki, niezawodny, powtarzalny i opłacalny. Automatyzacja jest niezbędna do osiągnięcia tych celów, ponieważ minimalizuje zmienność operatora, jednocześnie zwiększając przepustowość i poprawiając precyzję w iniekcjach i analizie komórek nowotworowych. Standaryzując te procedury, możemy poprawić powtarzalność danych i wyeliminować błędy ludzkie, a zautomatyzowane procesy stwarzają możliwości przesiewania o wysokiej przepustowości i umożliwiania badań na dużą skalę20,21. Ostatnio opracowaliśmy zautomatyzowany wtryskiwacz, który wstrzykuje ciecze, cząstki lub komórki różnego pochodzenia w trzech różnych miejscach anatomicznych z taką samą lub większą szybkością, precyzją i powtarzalnością niż wykwalifikowani badacze danio majonaprzód 22. Przedstawiamy tutaj protokół automatycznego wstrzykiwania komórek nowotworowych do larw danio wpatrzonego w precyzyjny i kontrolowany sposób. Dzięki zaawansowanemu rozpoznawaniu obrazów larwy danio pręgowanego są lokalizowane na płycie wstrzykującej, ustala się orientację i wytyczono miejsce docelowe do wstrzyknięcia. Następnie igła jest automatycznie prowadzona, a skuteczne nakłucie jest ustalane przez oprogramowanie. Przy minimalnym szkoleniu operatorzy mogą wykorzystywać ten system do wykonywania złożonych zastrzyków, na przykład tworzenia mikroguzów u żywych larw danio pręgowanych, co umożliwia efektywne badanie strategii leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Linie danio były utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami (https://zfin.org) i obchodzone z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Te regulacje realizują Wytyczne Rady Europy dotyczące ochrony zwierząt doświadczalnych (Dyrektywa 86/609/EWG), które pozwalają na stosowanie larw danio młodego do momentu rozpoczęcia swobodnego karmienia (5 dni po zapłodnieniu). Ponieważ wszystkie larwy użyte w tym badaniu nie miały więcej niż 5 dni, nie wymagała się licencji etycznej zgodnie z Dyrektywą 86/609/EWG.

UWAGA: Usunięte larwy danio o rozmiarze 48 hpf oraz materiał do wstrzyknięcia tym larwam powinny być przygotowane przed rozpoczęciem zabiegu za pomocą automatycznego wtryskiwacza. Protokoły dotyczące tego można znaleźć w metodach uzupełniających (Plik Uzupełniający 1) powiązanych z tym artykułem. Schemat workflow protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Ilustracja uzupełniająca 1 przedstawia schematyczne przedstawienie etapów rozwojowych zarodków danio pręgowanych.

1. Przygotowanie mikronakłucia

UWAGA: Do zastrzyków wymagane są mikroigły i stanowią nieodłączny element procesu wstrzykiwania do diagnostyki i dostrojenia do tego celu. W automatycznym wtryskiwaczu można używać zarówno igieł komercyjnych, jak i ręcznie wykonanych. Poniżej przedstawiono procedurę ręcznego wyciągania mikroigieł za pomocą Sutter Instrument P-1000 lub PC-10, choć większość wyciągaczy mikroigieł działa podobnie. Preferowana morfologia igły to stopniowe zwężanie igieł o grubości 6-8 mm, z końcówką o rozmiarze 0,3-0,7 μm, które jest ręcznie rozbijane przed wstrzyknięciem za pomocą ostrych kleszczy.

  1. Przygotuj odpowiednie kapilary szkła borokrzemowego: 1,0 mm OD, 0,78 mm średnica wewnętrzna (ID). Upewnij się, że są czyste i wolne od kurzu oraz zanieczyszczeń.
  2. Sprawdź, czy grzałka jest nienaruszona i w dobrym stanie.
  3. Włóż szklaną kapilarę do zacisków i mocno zabezpiecz zaciskowymi, ale nie na tyle, by rurka pękła.
  4. Dostosuj ustawienia: ustawienie ciepła, siłę naciągu i czas najazdu. Przy użyciu wyciągacza igieł PC-10 poprawna morfologia igły uzyskuje się za pomocą jednostopniowego pociągnięcia przy ustawieniu nagrzewania 68 i pełnych ciężarach.
    UWAGA: Te ustawienia wpływają na długość i szerokość zwężania końcówki i mogą się różnić w zależności od grubości ścianki kapilary. Aby uzyskać najlepszy rezultat, wymagana jest metoda prób i błędów.
  5. Ostrożnie wyjmij igły z klamr, aby nie uszkodzić końcówki. Sprawdź końcówkę, aby upewnić się, że zwężanie jest równomierne.
  6. Przechowywaj mikroigły ostrożnie na taśmie klejącej, upewniając się, że delikatna końcówka nie styka się z żadną powierzchnią.

2. Przygotowanie płytek żelowych agarozy do wstrzykiwania robotycznego

  1. Zważ 0,6 g agarozy i przelej ją do szklanej butelki o pojemności 100 mL.
  2. Za pomocą cylindra pomiarowego zmierz 40 ml roztworu E3. Włóż go do szklanej butelki z agarozą, aby przygotować roztwór 1,5% agarozy.
  3. Włóż szklaną butelkę do mikrofalówki i podgrzej przez 30 sekund przy 900 W. Następnie kontynuuj podgrzewanie w krokach po 30 sekund, mieszając zawartość (w rękawiczkach) między przerwami, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
    UWAGA: Uważaj, ponieważ gotowanie może też zacząć się w wyniku mieszania.
  4. Po roztopieniu schładz agarozę, przepłukując zewnętrzną powierzchnię szklanej butelki pod bieżącą wodą, aż będzie ciepła, ale nie gorąca w dotyku (około 60 °C).
  5. Umyj i dokładnie wysusz wielorazowy uchwyt na talerze i szklaną zsuwaczę. Złożysz, wsuwając szkiełko do szczeliny po boku uchwytu na płytkę (Ilustracja uzupełniająca 2A) i umieszczając ją na płaskiej powierzchni.
    UWAGA: Sprawdź, czy szklana płytka nie wystawa z boku uchwytu.
  6. Wylej około 40 ml mieszanki agarozy na szklaną płytkę, dbając o to, by rozprzestrzeniła się na całej powierzchni. Jeśli trzeba, przechyl tak, aby wszystkie krawędzie zostały osiągnięte.
  7. Pozwól agarozie zastygnąć przez około 5 minut. Talerz jest wtedy gotowy do użycia.
    UWAGA: Dodanie roztworu E3 na powierzchnię stałej płyty agarozowej może zapobiec wysychaniu. Jednak należy ją usunąć przed zastosowaniem do zastrzyków.

3. Umieszczenie larw danio pręgowanego na płytce żelu agarozowego

  1. Zwilż płytkę żelu agarozowego roztworem E3.
  2. Trzymaj płytkę pod kątem, pozwalając zebrać nadmiar roztworu E3.
  3. Przygotuj roztwór E3 zawierający 40 μg/mL tricainy w szalce Petriego. Włóż około 20 larw do roztworu i pozwól im znieczulić przez 2 minuty.
  4. Ostrożnie umieść na talerzu 10-20 znieczulonych larw (Rysunek Uzupełniający 2B), dbając o naturalny odpływ nadmiaru wody.
  5. Upewnij się, że larwy są rozłożone i nie dotykają się ze sobą, i nie umieszczaj ich zbyt blisko krawędzi płytki (5-10 mm) (Ilustracja uzupełniająca 2B).
  6. Usuń nadmiar płynu z talerza, dbając o to, aby larwy pozostały wilgotne.
    UWAGA: Nadmiar płynu może powodować niezamierzone ruchy larwalne podczas wstrzykiwania, podczas gdy niewystarczający poziom wilgoci może zwiększać śmiertelność.

4. Ładowanie mikroigły

UWAGA: Przed wykonaniem zastrzyku napełnij mikronakłucie fluorescencyjnymi komórkami o wysokiej gęstości. Komórki mogą genetycznie wyrażać marker fluorescencyjny lub można użyć etykiety chemicznej23. Chociaż liczba komórek wstrzykniętych każdej larwie jest stosunkowo niska, zazwyczaj 700–900 komórek, gęstość komórek musi być wysoka na etapie wstrzyknięcia; około 300 000 do 500 000 komórek na μL, głównie dzięki minimalnej objętości (około 2 nL), która jest wstrzykiwana.

  1. Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 200 × g przez 5 minut i usuń nośnik komórkowy.
  2. Policz komórki za pomocą licznika komórek, a następnie ponownie zawiesij granulat w sterylnym, pokojowym (RT) PBS, aby uzyskać końcową gęstość 300 000 komórek/μL.
  3. Weź przygotowaną mikronakłucie i trzymaj ją ostrożnie między kciukiem a palcem wskazującym. Następnie, używając końcówki pipety mikroładowającej, załaduj mikronaigłę 1-10 μL zawiesiny komórkowej, w zależności od liczby komórek.
    UWAGA: Włóż końcówkę na koniec mikronakłucia i powoli wyciągaj ją podczas wypełniania.
  4. Używając stereomikroskopu o powiększeniu 4x oraz pary cienkich kleszczy, ostrożnie oderwij szczelny koniec mikroigły, aby stworzyć otwór. Ten krok można również wykonać przed załadowaniem zawieszenia wtryskowego.
    UWAGA: Końcówka igły z fazą ułatwia przebicie i może być wykonana za pomocą szlifierki igłowej. Jeśli używasz szlifierki iglicowej, skos końcówki igły przed załadowaniem zawiesin wtryskowych. W tym przypadku igła jest już otwarta przed załadowaniem komórek.

5. Obsługa robota do mikrowstrzykowania

  1. Wykonaj procedurę uruchamiania.
    1. Upewnij się, że odpowiedni dopływ gazu jest podłączony i włączony.
      UWAGA: Zalecane ciśnienie wejściowe ze sprężarki powietrza lub zaworu powietrza w warunkach laboratoryjnych z centralnym, sprężonym powietrzem wynosi 0,6 MPa (6 barów). Sprężarka lub zawór powietrza mogą być nieprzerwanie włączone i otwarte bez konieczności częstego wyłączania. Sprężone powietrze, azot lubCO2 mogą być używane do wyznaczania ciśnienia wejściowego.
    2. Włóż pendrive do jednego z portów z tyłu robota (opcjonalnie).
      UWAGA: Pendrive USB powinien być włożony do maszyny przed uruchomieniem robota i wyjmowany dopiero po wyłączeniu robota.
    3. Naciśnij zielony przycisk zasilania obok ekranu, aby włączyć robota (Rysunek uzupełniający 2C). Poczekaj, aż pojawi się panel sterowania (około 1 minuty).
    4. Sprawdź, czy po lewej i prawej stronie robota jest 15 cm wolnego miejsca i naciśnij OK na wyskakującym okienku (Ilustracja uzupełniająca 2D).
    5. Naciśnij OK w kolejnym okienku wyskakującym (Rysunek uzupełniający 2E) dotyczącym pendrive'a.
      UWAGA: To okienko nie pojawi się, jeśli nie włożono pendrive'a.
  2. Ustaw połączenie na zdalne sterowanie (opcjonalnie).
    UWAGA: Pilot służy do podglądu i obsługi maszyny z daleka. Funkcja ta jest przydatna podczas demonstracji, sesji szkoleniowych, aktualizacji oprogramowania oraz rozwiązywania problemów.
    1. Włóż kabel Ethernet do portu z tyłu urządzenia. W przypadku początkowej konfiguracji skontaktuj się z działem IT w celu uzyskania pomocy.
    2. Stuknij ikonę menu znajdującą się w lewym górnym rogu ekranu (Ilustracja uzupełniająca 2F).
    3. Stuknij ikonę ustawień na dole na środku menu (Ilustracja uzupełniająca 2F).
    4. Wybierz tryb utrzymania z menu ustawień (Rysunek uzupełniający 2G).
    5. Kliknij Connect to LSM , aby rozpocząć zdalne połączenie (Ilustracja uzupełniająca 2H).
  3. Wykonaj ustawienia zastrzyków.
    1. Kliknij w ustawienia zastrzyku w menu (Rysunek uzupełniający 2F).
    2. Wybierz odpowiedni etap rozwoju larw danio pręgowanego do zastrzyku (Rysunek uzupełniający 3A).
      UWAGA: Do zastrzyków do przewodu Cuviera, przestrzeni periwitellinej oraz komory tylnej mózgu zaleca się 48 larw hpf utrzymywanych w temperaturze 28,5 °C.
    3. Wybierz preferowane miejsce wstrzyknięcia spośród dostępnych opcji wykonywania zastrzyków (Rysunek Uzupełniający 3B).
    4. Wybierz miejsce wstrzyknięcia na schematycznym diagramie larwy danio pręgowanego. Dostosuj pozycję diagramu larwalnego, końcówki igły i orientacji igły tak, aby były wyrównane z wybranym miejscem wstrzyku (Ilustracja uzupełniająca 3C).
      UWAGA: Sugerowane umieszczenie igieł w różnych miejscach wkłucia podano w wcześniej opublikowanym artykule22. W przypadku iniekcji do przewodu Cuviera (DoC) igła zazwyczaj umieszcza się na środku DoC ze względu na wyższy przepływ krwi w tym regionie. Orientacja igieł może być grzbietowa lub brzuszna. W przypadku wstrzyknięcia w przestrzeń periwitellinową (PVS) zaleca się rozpoczęcie wkłucia igły na jej granicy i ustawienie jej pod kątem około 30-45° względem grzbietki. W przypadku zastrzyku do tylnej komory mózgu zaleca się rozpoczęcie wkłucia igły poza tylną częścią mózgu, aby zapobiec jej wyślizgowi. Kąt igły powinien być wyrównany między oczami a pęcherzykiem usznym.
    5. Wybierz makro do wtrysku, oferując opcje zarówno trybu automatycznego, jak i manualnego (Ilustracja dodatkowa 3D).
      UWAGA: W trybie automatycznym nazwa miejsca wkłucania wskazuje, że proces wtrysku jest wykonywany autonomicznie przez system. Ręczny wybór polega na autonomicznym lokalizowaniu i zbliżaniu się larw przez robota. Po zidentyfikowaniu larw pojawi się interfejs kontrolny, który umożliwia użytkownikom prowadzenie procesu wstrzykiwania.
    6. Po ostatecznym ustawieniu wstrzykiwania stuknij w opcję Kontynuuj, aby kalibrować igłę , aby przejść do kalibracji igły.
  4. Wykonaj kalibrację igły.
    UWAGA: Ponieważ każda igła jest inna, trzeba skalibrować pozycję końcówki igły. Początkowy interfejs kalibracji igły przedstawiono na Dodatkowym Rysunku 3E.
    1. Chwyć mocno uchwyt na igły i obróć metalową część przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby odłączyć uchwyt na igły od robota.
    2. Włóż stronę wypełnionej igły do fustostostoczkowej strony uchwytu na igłę.
    3. Stuknij w Move stage, aby zamontować igłęwyświetlaną na ekranie (Rysunek dodatkowy 3E). Scena zostanie przesunięta do bezpiecznej pozycji do montażu igły, a linijka zostanie wyświetlona (Ilustracja uzupełniająca 3F). Zmierz długość igły poza uchwytem na igły za pomocą linijki. Powinno mieć około 22 mm.
    4. Chwyć uchwyt na igłę zawierający wypełnioną igłę i skręć metalową część zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby mocno zacisnąć połączenie (Ilustracja uzupełniająca 3G). Naciśnij OK , aby przejść dalej.
    5. Na ekranie wyskakującego okienka ustaw igłę w centrum okręgu (Rysunek Uzupełniający 3H), regulując dwie na maszynie (Rysunek Uzupełniający 3I). Po wyśrodkowaniu stuknij zielony znaczek do sprawdzenia.
    6. Na kolejnym ekranie wyskakującym (Ilustracja Dodatkowa 3J) wyreguluj ostrość na końcówce igły, przekręcając umieszczoną z tyłu głowicy robota (Ilustracja Dodatkowa 3K). Gdy się skupisz, stuknij zielony znaczek check. Robot automatycznie kalibruje wysokość igły. Następnie robot obraca igłę i wyświetla pozycje wtrysku jako czerwone punkty przy każdym obrócie (Rysunek Dodatkowy 3L).
    7. Po zakończeniu kliknij Dostałem i kontynuuj, aby kalibracja kropli była w prawym dolnym rogu ekranu.
  5. Wykonaj kalibrację kropel.
    UWAGA: Rozmiar kropli kalibruje się za pomocą wstrzyknięcia oleju mineralnego.
    1. Przygotuj płytę z 6 dołami, z jedną studnią wypełnioną 10 mL oleju mineralnego i drugą z 10 mL buforu czyszczącego (np. PBS lub wodą). Umieść płytkę z 6 dołkami w lewej pozycji uchwytu na płytkę.
      UWAGA: Prosimy o zdjęcie pokrywki płytki z 6 dołkami podczas (całego) eksperymentu, aby można było jej ponownie użyć, gdy igła zostanie zatkana lub zostanie wprowadzona nowa igła.
    2. Stuknij ikonę obok Kalibruj za pomocą płytki studni (Rysunek uzupełniający 4A).
    3. Wybierz pozycje szybu naftowego i odwiertu oczyszczającego (Rysunek uzupełniający 4B).
    4. Naciśnij przycisk Make droplet , aby wygenerować kroplę z ustawieniami wyświetlanymi po lewej stronie ekranu (Dodatkowy rysunek 4C). Dostosowuj ciśnienie wtrysku, ciśnienie wsteczne i czas trwania impulsu powietrza w zależności od potrzeb, aby osiągnąć docelową objętość. Alternatywnie, naciśnij przycisk Auto Improve , aby automatycznie zoptymalizować ustawienia i osiągnąć pożądaną głośność.
    5. Jeśli igła jest zatkana, naciśnij niebieski przycisk Czyść igły (Ilustracja uzupełniająca 4C), aby uruchomić impuls czyszczenia wysokiego ciśnienia w studni zawierającej wodę lub medium.
    6. Jeśli igła i kropla wydają się rozmazane, dostosuj ostrość igły i kropli za pomocą górnego trzeciego przycisku po prawej stronie ekranu (Ilustracja dodatkowa 4C).
    7. Kliknij zielony znaczek , aby zamknąć ekran.
  6. Wykonaj wybór tablicy.
    1. Kliknij Przesuń etap, aby położyć płytę, a robot automatycznie przesunie scenę w odpowiednią pozycję do umieszczenia płyty.
    2. Sprawdź, czy płytka żelowa agarozy jest sucha pod spodem i umieść płytkę z larwami znieczulonymi w odpowiedniej pozycji uchwytu.
    3. Następnie kliknij OK i stuknij w Kontynuowaj wstrzyknięcie , aby przejść do procesu wstrzyknięcia (Rysunek Uzupełniający 4D).
  7. Wykonaj zastrzyk.
    1. W interfejsie wtrysku kliknij przycisk Start , aby rozpocząć proces wstrzykiwania (Rysunek uzupełniający 4E). Proces zaczyna się od przesuwania się etapu robota, podczas gdy system skanuje płytę agarozową, poszukując ryby (Rysunek Dodatkowy 4F). Po zidentyfikowaniu larwy igła automatycznie kieruje się do wyznaczonego miejsca wstrzyknięcia i automatycznie dostosowuje kierunek do ustalonego kąta.
    2. Jeśli wybrany jest tryb automatyczny , robot bezproblemowo podaje zastrzyki w wybranym miejscu (Ilustracja uzupełniająca 4G). Po zakończeniu bieżącego zastrzyku robot kontynuuje skanowanie kolejnej larwy na płycie, aby wykonać zastrzyki.
    3. Jeśli wybrany jest tryb manualny , interfejs sterowania ręcznego pojawi się, gdy igła zbliża się do larwy (Rysunek Dodatkowy 4H). Użyj niebieskiej i żółtej strzałki do przesuwania igły i obróć ją za pomocą okrągłego przycisku obrotu po lewej stronie ekranu. Gdy igła zostanie umieszczona wewnątrz larwy, naciśnij czerwony przycisk kropelki, aby wykonać wstrzyknięcie. Alternatywnie, naciśnij m, aby zainicjować sekwencję makro i wykonać automatyczne wstrzykiwanie.
    4. Gdy wszystkie larwy zostaną wstrzyknięte, zamknij interfejs wstrzykiwania, klikając przycisk stop. Igła zostanie automatycznie umieszczona w szybie naftowym.
    5. Ostrożnie usuń płytkę zawierającą wstrzyknięte larwy.
  8. Przenieś wstrzyknięte larwy danio pręgowane.
    1. Aby przenieść wstrzyknięte larwy, przechyl talerz nad szalką Petriego i użyj pipety lub butelki do wyciskania, aby delikatnie wypłukać larwy kontrolowanym przepływem wody.
    2. Zacznij od góry i przesuwaj się w dół, aby skutecznie spłukać.
    3. Usuń martwe larwy, zastąp wodę świeżym roztworem E3 i umieść szalkę Petriego w inkubatorze.
      UWAGA: Jeśli wstrzyknięte są ludzkie komórki nowotworowe lub próbki kliniczne, inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 33-36 °C; w przeciwnym razie inkubuj w temperaturze 28,5 °C.

6. Wyłączenie robota

  1. Po zakończeniu wstrzyknięcia usuń igłę, odwiedzając menu kalibracji igły i naciskając Move stage, aby usunąć igłę (Rysunek dodatkowy 3E). Jeśli zamierzasz zostawić igłę w maszynie na późniejsze użycie, pomiń ten krok.
  2. Przejdź do menu i stuknij przycisk zasilania , znajdujący się w lewym dolnym rogu (Ilustracja uzupełniająca 2D).
  3. Naciśnij przycisk Park, aby zachować igłę (Rysunek Uzupełniający 4I).
  4. W przeciwnym razie kliknij OK. Urządzenie się wyłączy, a zielona dioda przycisku zasilania zgaśnie po zakończeniu wyłączenia.
    UWAGA: Gdy robot jest bezczynny, umieść puste płytki wielodołkowe w obu uchwytach wielorowkowych, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do maszyny.

7. Usunięcie żelu agarozowego i sprzątanie

  1. Usuń żel agarozowy z płytki i ostrożnie (noś gogle i rękawiczki) zdejmij szklaną płytkę z uchwytu.
  2. Dokładnie wyczyść szklaną płytkę i uchwyt ciepłą wodą i etanolem, upewniając się, że są suche przed ponownym użyciem.
    UWAGA: Umyj wszystkie płyty żelowe natychmiast po użyciu, ponieważ żel agarozowy łatwiej usunąć, gdy jest jeszcze mokry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy tutaj zautomatyzowany proces wstrzykiwania dla trzech najczęściej używanych miejsc wstrzykiwania dla ksengraftów komórek nowotworowych.

Film 1 demonstruje automatyczne wstrzykiwanie przewodu Cuviera (DoC) za pomocą systemu robotycznego. Robot najpierw systematycznie skanuje płytę, przesuwając się od góry do dołu i od lewej do prawej, aby zlokalizować larwę danio. Po zidentyfikowaniu larwy igła automatycznie się do niej zbliża, dostosowując się do ustalonej pozycj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rozwój i wdrożenie automatycznego wtryskiwacza stanowią istotny postęp w dziedzinie ksenoprzeszczepienia guzów danio pręgowanego w badaniach leków przeciwnowotworowych i medycynie precyzyjnej. Jest to, według naszej najlepszej wiedzy, pierwszy komercyjnie dostępny robot do automatycznego wstrzykiwania zawiesin komórkowych do larw danio pręgowanych, dlatego protokół ten jest istotny dla wszystkich badań związanych z takimi wstrzykiwaniami o wysokiej wydajności. Dzięki automatyzacji procesu wstrzykiwania system ten dodatko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Y.D., K.J.v.d.K. i J.d.S. pracują dla Life Science Methods, które komercyjnie wykorzystuje system robotyczny używany w tej publikacji. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy programowi Eurostars za wsparcie naszych badań poprzez grant ROBO-FISH (numer grantu: E! 114899) oraz program EIC-PATHFINDER poprzez grant ALADDIN (numer grantu: 101130574).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płyta Greiner bio-one cellstar ref 657160
AgaroseVWR#N605-100G
Zautomatyzowany system wtrysku + materiały eksploatacyjneMetody nauk przyrodniczychhttps://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774
Naczynia włosowate szkła borosilikatowegoŚwiatowe Precyzyjne InstrumentyNie ma1,0 mm średnica średnicy, 0,78 mm średnica
Licznik komórek ThermoFisherHrabina 3
Igły komercyjne Clunbury Scientific LLC #B100-58-20
DNaza typu I Roche#11284932001
Filtr komórek nowotworowychSysmex CellTricsTM04-0042-231630 & mikro; m
Olej mineralny Diapharma #330779-1L
Szlifierka igiełkowa ()Narishige    EG-401
Poliwinylpirrolidon 40Sigma#102420477
GentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotechttps://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html

Bibliografia

  1. Goetz, L. H., Schork, N. J. Personalized medicine: motivation, challenges, and progress. Fertil Steril. 109 (6), 952-963 (2018).
  2. Jorgensen, J. T. Twenty years with personalized medicine: Past, present, and future of individualized pharmacotherapy. Oncologist. 24 (7), e432-e440 (2019).
  3. Ashley, E. A. Towards precision medicine. Nat Rev Genet. 17 (19), 507-522 (2016).
  4. Binotto, M., Reinert, T., Werutsky, G., Zaffaroni, F., Schwartsmann, G. Health-related quality of life before and during chemotherapy in patients with early-stage breast cancer. Ecancermedicalscience. 14, 1007(2020).
  5. Nalla, L. V., Kanukolanu, A., Yeduvaka, M., Gajula, S. N. R. Advancements in single-cell proteomics and mass spectrometry-based techniques for unmasking cellular diversity in triple negative breast cancer. Proteomics Clin Appl. 19 (1), e202400101(2025).
  6. Lindahl, G., et al. Zebrafish tumour xenograft models: a prognostic approach to epithelial ovarian cancer. NPJ Precis Oncol. 8 (1), 53(2024).
  7. Duan, X. P., et al. New clinical trial design in precision medicine: discovery, development and direction. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 57(2024).
  8. Research and development in the pharmaceutical industry. , Congressional Budget Office. https://www.cbo.gov/publication/57126 (2021).
  9. Dusetzina, S. B., Oberlander, J. The price of progress: Managing prescription drug spending. J Health Polit Policy Law. 47 (6), 621-628 (2022).
  10. Nagar, S., Rand, L. Z., Kesselheim, A. S. What should US policymakers learn from international drug pricing transparency strategies. AMA J Ethics. 24 (11), E1083-E1090 (2022).
  11. You, Y., et al. Artificial intelligence in cancer target identification and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 156(2022).
  12. Costa, B., et al. Zebrafish Avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Commun. 15 (1), 4771(2024).
  13. Ali, Z., et al. Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 58(2022).
  14. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
  15. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-X(L) inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  16. Pascoal, S., et al. Using zebrafish larvae as a xenotransplantation model to study Ewing sarcoma. Methods Mol Biol. 2226, 243-255 (2021).
  17. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293(2020).
  18. Costa, B., et al. Zebrafish Avatars of rectal cancer patients validate the radiosensitive effect of metformin. Front Oncol. 12, 862889(2022).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077(2021).
  20. Holland, I., Davies, J. A. Automation in the life science research laboratory. Front Bioeng Biotechnol. 8, 571777(2020).
  21. Brito, J. J., et al. Recommendations to enhance rigor and reproducibility in biomedical research. Gigascience. 9 (6), giaa056(2020).
  22. Ding, Y., et al. Automated microinjection for zebrafish xenograft models. NPJ Biomed Innov. 2, 13(2025).
  23. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  24. Martinez-Lopez, M., Povoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  25. Groenewoud, A., Yin, J., Snaar-Jagalska, B. E. Ortho- and ectopic zebrafish xeno-engraftment of ocular melanoma to recapitulate primary tumor and experimental metastasis development. J Vis Exp. (175), e62356(2021).
  26. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine
Posted by JoVE Editors on 11/03/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68441

Przeglądaj więcej artykułów

Ksenoprzeszczepy guzówzautomatyzowana mikroiniekcjawysokoprzepustowe wstrzykiwaniemedycyna precyzyjnadożylna podaż lekuortotopowa implantacja do mózguwstrzyknięcie podskórnerobotyczny system iniekcyjny
Automatyzacja implantacji guzów w larwach danio dano młodego dla badań i medycyny nowotworowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.