Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, dostarczające im energii i regulujące ich metabolizm. Tak więc mitochondria znajdują się na skrzyżowaniu śmierci komórkowej i przetrwania. Wykazano, że mitochondria są niezbędne dla różnych procesów, począwszy od zakwaszenia lizosomów i molekularnego działania motorycznego, a skończywszy na skurczu mięśni i wypalaniu synaps ^1,2.

Mitochondria przechodzą regularne rozszczepienia i fuzje, aby utrzymać sieć mitochondrialną, która skutecznie wytwarza ATP w odpowiedzi na zapotrzebowanie metaboliczne komórki i stres. Rzeczywiście, wykazano, że mitochondria ulegają rozszczepieniu, aby ułatwić mitofagię, selektywne usuwanie fragmentów mitochondriów. W związku z tym w układzie komórkowym pozostają tylko aktywnie oddychające i nie zdepolaryzowane mitochondria ^3,4. Fuzja występuje jednak jako sposób na zwiększenie wydajności ATP sieci w przypadku zwiększonego zapotrzebowania ^5,6. Ponadto wykazano, że zarówno rozszczepienie, jak i fuzja odgrywają ważną rolę w podziale i ochronie mitochondrialnego DNA ^7,8. Należy zauważyć, że zakres rozszczepienia i fuzji wymaga starannej kontroli homeostatycznej, aby zapewnić zdrową sieć mitochondrialną, ponieważ wykazano, że zbyt dużo lub zbyt mało któregokolwiek z tych procesów jest szkodliwe.

Wykazano, że nadmierne rozszczepienie prowadzi do fragmentacji sieci mitochondrialnej, a następnie obniżenia poziomu ATP w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i tauopatiach 9,10,11, a niski poziom rozszczepienia może prowadzić do akumulacji zdepolaryzowanych mitochondriów, co prowadzi do objawów podobnych do choroby Parkinsona ¹². Wiadomo, że hiperfuzja sieci występuje w okresach stresu w celu zwiększenia produkcji ATP. Wykazano jednak, że istnienie w tym stanie przez dłuższy czas zwiększa poziom ROS i aktywność autofagii, co skutkuje początkiem śmierci komórki ^9,12.

Staje się zatem jasne, że zrozumienie stanu sieci mitochondrialnej daje kluczowy wgląd w zrozumienie stanu komórki, a tym samym organizmu. Wyraźne znaczenie zrozumienia sieci mitochondrialnej w kontekście zdrowia i choroby, jej zdolności do ulegania zdarzeniu rozszczepienia i fuzji oraz ich wpływowi na zdrowie komórkowe jest tym, co zmotywowało opracowanie tego protokołu i powiązanych narzędzi analitycznych. W szczególności narzędzia, które umożliwiają charakterystykę dynamiki mitochondriów, są w dużej mierze ograniczone i słabo opisane w literaturze.

Morfologia mitochondriów jest zwykle określana za pomocą mikroskopii konfokalnej, a następnie analizy obliczeniowej, która wymaga, aby surowe mikrofotografie zostały poddane pewnemu stopniowi przetwarzania w celu poprawy ich jakości do oceny, ponieważ najlepiej opisuje to organizację mitochondriów. W ten sposób użytkownicy mogą określić wiele wyników morfometrycznych sieci mitochondrialnej, takich jak liczba, objętość, długość i proporcje 13,14,15. Użytkownicy mogą korzystać z mikrofotografii 2D lub 3D do oceny morfologicznej, chociaż analiza 3D oferuje większą dokładność i wgląd, ponieważ sieć mitochondrialna składa się ze struktur 3D. Do celów analizy rozszczepienia i fuzji zaleca się stosowanie mikrofotografii z osią z, ponieważ najlepiej kompensuje to trójwymiarowość sieci mitochondrialnej¹⁶.

Wiele badań obejmuje kategoryzację mitochondriów na stany rozdrobnione, nitkowate lub pośrednie jako sposób opisu sieci^16,17. Analiza 3D jest szczególnie korzystna ze względu na różne kształty, jakie mitochondria przybierają w komórce. Dodanie trójwymiarowości do badania daje pewność, zwłaszcza w odniesieniu do liczby mitochondriów, ponieważ mitochondria mogą poruszać się w górę lub w dół wzdłuż osi z. MEL to wtyczka ImageJ, która jest zależna od obrazów przechwyconych w 3D¹⁸. W tym przypadku wykorzystaliśmy mysie komórki neuronalne hipokampa GT1-7 barwione TMRE i Hoechst do wizualizacji sieci mitochondrialnej, a także jądra komórki. Komórki zostały następnie umieszczone w procesie przetwarzania wstępnego w celu poprawy jakości mikrofotografii w ramach przygotowań do analizy obrazu.

Udostępniono wiele technik, które pozwalają na określenie morfologii mitochondriów na podstawie metryk statycznych. Niewiele z nich obejmuje działania związane z rozszczepieniem i fuzją i umożliwia ilościowe uchwycenie dynamicznego zachowania mitochondriów 13,19,20,21. W tym miejscu opiszemy protokół poprawy obrazu przed określeniem charakterystyki sieci, ze szczególnym uwzględnieniem rozszczepienia mitochondriów i aktywności fuzyjnej. Pokażemy, w jaki sposób technika ta może uzupełniać wcześniej opublikowane metody określania morfologii mitochondriów.

1. Leczenie komórkowe i akwizycja mikroskopowa

1. Hodowla komórek GT1-7 w 8 komorowych szalkach w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% Pentrep (kompletne podłoża). Pozwól komórkom przyłączyć się przez noc, a następnie potraktuj 2,5 mM chlorowodorku metforminy wyprodukowanego w DMEM z 10% FBS przez 72 godziny, pamiętając o wymianie pożywki co 24 godziny. Współtraktować komórki 10 μM CCCP 6 godzin przed obrazowaniem i 400 nM bafilomycyny A1 (Baf) 4 godziny przed obrazowaniem.
   UWAGA: Można to zrobić z dowolną wybraną linią komórek eukariotycznych.
2. Przed obrazowaniem należy przygotować koktajl wstępnie podgrzanych kompletnych pożywek zawierających 5 nM Hoechst i 100 nM TMRE.
3. Zastąp pożywkę do leczenia komórkowego koktajlem obrazowania i odczekaj 10 minut inkubacji przed obrazowaniem.
   UWAGA: Ze względu na dynamiczną aktywność mitochondriów, komórki powinny być obrazowane za pomocą mikroskopu z komorą inkubacyjną ustawioną na 37 °C i 5% CO_{2 .}

2. Obrazowanie

1. Komórki obrazu przy użyciu 100-krotnego powiększenia z 1,4 NA.
2. Dostosuj moc lasera tak, aby moc była wystarczająco niska, aby uniknąć fotowybielania, ~2%. Upewnij się, że szybkość skanowania jest wysoka. Rób obrazy w rozdzielczości 512 x 512.
3. Ustaw odstępy między plasterkami Z w krokach co 0,25 μm. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, zobrazuj komórki tak, aby składały się z 10 stosów Z. Zdobądź pięć przedziałów czasowych bez żadnego odstępu między nabyciem stosu Z.
   UWAGA: Po zoptymalizowaniu protokół ten nie powinien być dostosowywany między grupami leczonymi lub grupami eksperymentalnymi, ponieważ wymienione tutaj makra wymagają, aby protokół obrazowania był ustandaryzowany we wszystkich komórkach.

3. Ocena obliczeniowa

UWAGA: Całe późniejsze przetwarzanie zostało wykonane przy użyciu ImageJ v1.53t. Wtyczkę MEL, a także moduły pomocnicze, można znaleźć pod adresem https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, podczas gdy wszystkie używane makra można znaleźć pod adresem https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

1. Przygotowanie obrazu
   1. Otwórz plik RAW w ImageJ.
   2. Aby wykadrować wiele komórek z jednego mikrografu, zacznij od zduplikowania obrazu do liczby pojedynczych komórek, które mają być analizowane.
   3. Użyj narzędzia do synchronizacji okien, narzędzia do rysowania odręcznego i dopasowania kolorów, aby narysować obszar zainteresowania wokół interesującej komórki, w której w polu widzenia znajduje się wiele komórek (rysunek uzupełniający S1).
   4. Kliknij Edytuj | Czysty na zewnątrz.
   5. Oddziel kanały czerwony i niebieski od siebie i zapisz kanał mitochondrialny jako . Plik TIFF.
2. Generowanie i dekonwolucja funkcji rozproszenia punktów
   1. Aby wygenerować funkcję rozproszenia punktowego (PSF), użyj wtyczki generatora PSF , korzystając z osadzonych informacji mikrograficznych. Przejdź do Wtyczki | Generator PSF , aby otworzyć wtyczkę. Dodatkowo przejdź do punktu menu Obraz | Pokaż informacje... lub naciśnij I, aby otworzyć informacje o obrazie, i przewiń w dół. Korzystając z rozmiaru i głębokości woksela, w polu informacyjnym pokazu zmień rozmiar piksela XY na 166,1 nm i krok Z na 200 nm. Zmień długość fali na 568 nm, rozmiar XYZ , aby dopasować rozdzielczość obrazu 512 x 512 i stos Z składający się z 10 warstw Z (rysunek uzupełniający S2).
   2. Przejdź do Wtyczki | Makra | Edycja | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm makra.
   3. Edytuj linie wejściowe i wyjściowe i naciśnij przycisk uruchamiania (rysunek uzupełniający S3).
3. Poprawa kontrastu obrazu i rozmycie
   1. Przejdź do Wtyczki | Makra | Edycja | Przetwarzanie wstępne.ijm.
   2. W makrach Preprocessing.ijm użyj odejmowania tła o promieniu toczącej się kuli równym 6. Ustaw Sigma Filter Plus tak, aby promień był równy 1, używane piksele były równe 2, a minimalny ułamek pikseli był równy 0,2, przy czym wtyczka jest świadoma wartości odstających. Dostosuj ustawienia CLAHE tak, aby rozmiar bloku wynosił 64; ustaw przedziały histogramu na 256, maksymalne nachylenie na 2,5, a krzywą gamma na 0,8.
      UWAGA: Wszystkie te ustawienia zostały zoptymalizowane pod kątem naszych zestawów danych, a wartości powinny zostać zoptymalizowane pod kątem alternatywnych zestawów danych przed zastosowaniem. Filtrowanie Sigma jest stosowane w celu wygładzenia obrazu i skutecznego mieszania pobliskich pikseli w celu zapewnienia spójnych struktur. Kontrast lokalny jest stosowany w celu zwiększenia kontrastu między jasnymi i ciemnymi pikselami, a w połączeniu ze zmianą gamma zwiększa obecność struktur mitochondrialnych, jednocześnie minimalizując piksele tła.
   3. Zmień wiersz wejściowy na folder zawierający mikrofotografie, które zostały poddane dekonwolucji (rysunek uzupełniający S4).
   4. Kliknij przycisk Uruchom.
4. Progowanie obrazu
   UWAGA: Chociaż użytkownicy mogą korzystać z dowolnego wybranego przez siebie narzędzia do progowania, zalecamy wtyczkę adaptacyjnego progowania firmy Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
   1. Otwórz interesujący plik, który został zmodyfikowany przez makra Preprocessed.ijm w ImageJ.
   2. Przejdź do Wtyczki | adaptiveThr.
   3. Ustaw próg lokalny na średnią ważoną i rozmiar bloku pikseli zgodnie z preferencjami użytkownika.
      UWAGA: Rozmiar bloku pikseli powinien być spójny między komórkami, ponieważ ta wartość wpływa na oceny wymiarów mitochondrialnych, takie jak objętość lub proporcje.
   4. Aby zoptymalizować pod kątem czasu, kliknij podgląd i dostosuj rozmiar bloku tak, aby jak najwięcej mitochondriów było wyraźnie uwzględnionych. Dostosuj także wartość odejmowania dla każdej komórki, aby wyeliminować niepotrzebne tło. Zapisz pliki mikrograficzne w folderach powiązanych z wartością odejmowania (rysunek uzupełniający S5).
      UWAGA: Makra Threshold.ijm zawierają filtr rozmiaru, który eliminuje mniejsze cząstki.
   5. Wybierz Wtyczki | Makra | Edycja | Próg.ijm.
   6. Edytuj wiersze input_path i output_path, a także blockSize i odejmij wiersze w skrypcie makr (Rysunek uzupełniający S6).
   7. Kliknij przycisk Uruchom.
5. Wykrywanie zdarzeń rozszczepienia i fuzji za pomocą wtyczki lokalizatora zdarzeń mitochondrialnych (MEL)
   UWAGA: MEL jest przeznaczony do przetwarzania poklatkowej sekwencji stosów z składających się z jednego kanału, zapisywanych jako pojedynczy plik TIFF na raz. Chociaż można to zrobić, zmieniając linię wejściową na interesujący nas plik Tiff z progiem, zademonstrujemy również metodę przetwarzania wielu plików Tiff jednocześnie za pomocą funkcji concatenate w ImageJ.
   1. Otwórz do 10 mikrofotografii progowych, które należą do tych samych warunków leczenia.
      UWAGA: Aby to zadziałało, mikrofotografie muszą mieć taką samą liczbę plasterków Z.
   2. Przejdź do obrazu | Stosy |Narzędzia | Połącz i naciśnij przycisk OK.
   3. Aby usunąć pozostałą małą puncta pozostawioną przez progowanie, przejdź do Wtyczki | Zintegrowane filtry obrazów | Usuń wartości odstające. Użyj podglądu , aby ustawić rozmiary X i Y, aby usunąć niezbędne fragmenty.
   4. Zapisz połączony plik jako plik TIFF.
   5. Przejdź do Wtyczki | Makra | Edycja | Quicktest_new.ijm i w razie potrzeby edytuj ścieżki wejściowe i wyjściowe (rysunek uzupełniający S7).
      UWAGA: Po zakończeniu folder o nazwie "MEL_results" zostanie znaleziony w folderze wyjściowym ze wszystkimi wynikami MEL. Są one pokazane jako zdarzenia rozszczepienia i fuzji wykryte w każdym punkcie czasowym, a ostatni punkt czasowy powinien być zawsze usuwany ze względu na sposób, w jaki działa MEL¹⁸.

Zaznaczanie odpowiednich komórek
Użytkownicy powinni mieć świadomość, że sieć mitochondrialna zmienia się w zależności od stanu mitotycznego komórki. Jeśli jądro wydaje się mieć kształt hantli lub litery U, lub jeśli w pobliżu jądra znajduje się przestrzeń z brakiem sygnału fluorescencji, może to oznaczać, że komórka zbliża się do mitozy. W tym stanie mitochondria prawdopodobnie ulegają rozszczepieniu z powodu podziału komórek, a nie z powodu interwencji leczniczej i jej wpływu na sieć (rysunek uzupełniający S8).

Metformina jest lekiem przeciwcukrzycowym, który, jak wykazano, indukuje fuzję mitochondrialną22. Mysie komórki podwzgórza GT1-7 traktowano 400 nM bafilomycyny (Baf) przez 4 godziny w celu zahamowania degradacji mitochondriów, 10 μM CCCP przez 6 godzin w celu wywołania depolaryzacji mitochondriów i 5 mM chlorowodorku metforminy (Metf) przez 72 godziny przed inkubacją w koktajlu zawierającym TMRE i Hoechst w DMEM. Surowe obrazy składały się z 10 mikrofotografii o szerokości kroku z 0,25 μm, które zostały uchwycone w pięciu przedziałach czasowych przy użyciu laserów o długości fali 405 nm i 561 nm. Przechwycenie każdego punktu czasowego trwało 30 sekund i nie stosowano żadnych przerw między punktami czasowymi po zdobyciu stosu z. Przedstawione dane są reprezentacją średniej ± odchylenia standardowego z czterech eksperymentów o łącznej wartości n 12 na grupę badaną.

Rysunek 1 przedstawia wpływ procesu przetwarzania na reprezentatywne mikrofotografie, zaczynając od surowego obrazu, a kończąc na obrazie progowym, który jest następnie analizowany przez MEL. Dekonwolucja koryguje rozpraszanie światła, jednocześnie poprawiając jakość rozdzielczości mitochondriów. Potok wstępnego przetwarzania jest odpowiedzialny za odejmowanie tła, rozmycie i zwiększanie kontrastu w ustandaryzowany sposób. Po zwiększeniu kontrastu, struktury są progowane, a małe cząstki są usuwane w ramach przygotowań do analizy przez MEL, a także innych ocen morfologicznych, które użytkownik może zdecydować się wykonać.

Rysunek 1: Potok przygotowania do analizy obrazu. (A) Surowe mikrofotografie miały oddzielone kanały i (B) pojedyncze komórki wybrane na klatkę. (C) Komórki te zostały następnie zdekonwolucjonowane przed poddaniem (D) odejmowaniu tła i wzmocnieniu kontrastu. (E) Wreszcie, mikrofotografie zostały poddane progowaniu, zanim (F) zostały przeanalizowane przez wtyczkę MEL w celu wykrycia rozszczepienia i fuzji. Podziałka = 10 μm (mikrografie główne), 2 μm (sekcje powiększone). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 pokazuje, w jaki sposób rozgraniczenie i wizualizacja aktywności rozszczepienia i fuzji jądrowej zachodzącej w czasie i w 3D, jak opisano wcześniej18. Zdarzenia rozszczepienia są oznaczone czerwoną kropką, podczas gdy zdarzenia fuzji są oznaczone zieloną punktą, aby wizualnie zlokalizować dynamiczną aktywność w czasie. MEL wykrywa klatka po klatce na całym mikrozdjęciu ułożonym w stos z, obserwując w ten sposób aktywność rozszczepienia i fuzji w 3D.

Rysunek 2: Wykrywanie zdarzeń rozszczepienia i fuzji jądrowej w 3D i w czasie. Reprezentatywne obrazy pokazują zmiany w sieci mitochondrialnej w trzech kolejnych przedziałach czasowych, z reprezentatywnym regionem zainteresowania pokazanym w 2D i 3D. Zielona puncta wizualizuje zdarzenia fuzji, podczas gdy czerwona puncta wizualizuje zdarzenia rozszczepienia. Podziałka = 10 μm (mikrografie główne), 2 μm (sekcje powiększone). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chociaż opublikowano wiele technik opisujących morfologię sieci mitochondrialnych, niewiele z nich obejmuje aktywność rozszczepienia i fuzji. Dodanie odczytów rozszczepienia i fuzji, choć nie różniło się znacząco od siebie, biorąc pod uwagę nasz krótki czas obrazowania wynoszący pięć ram czasowych, wystarczyło, aby wykazać znaczącą zmianę w liczbie zdarzeń po dodaniu metforminy leczonej jednocześnie z CCCP i Baf (Figura 3D). Wzrost aktywności rozszczepienia i fuzji sieci mitochondrialnej wskazuje, że sieć jest dynamiczna i przechodzi dużą przebudowę; Jednak samo rozszczepienie i fuzja niekoniecznie opisują sieć mitochondrialną. Liczba i objętość mitochondriów są powszechnie stosowanymi deskryptorami morfologicznymi sieci.

Tutaj wykazaliśmy, że Metf, w obecności CCCP i Baf, spowodował wzrost liczby mitochondriów i spadek objętości, cechy, które są zgodne z siecią mitochondrialną, która uległa rozszczepieniu (Figura 3C). W poprzedniej publikacji wykazaliśmy korzyści płynące ze zrozumienia sieci mitochondrialnej w kontekście rozszczepienia i fuzji, a także liczby struktur i objętości23. W tym miejscu pokazujemy również znaczenie zrozumienia zakresu dynamicznej aktywności w odniesieniu do całkowitej liczby struktur mitochondrialnych (ryc. 3E). W ten sposób byliśmy w stanie wykryć, że w stosunku do liczby mitochondriów, metformina indukowała wyższy stopień dynamicznej aktywności niż metformina leczona jednocześnie z Baf i CCCP (Figura 3G), co wskazuje, że chociaż liczba mitochondriów pozostaje niezmieniona w porównaniu z kontrolą, po leczeniu metforminą (Figura 3D) następuje znaczny wzrost aktywności przebudowy sieci (Figura 3G).

Rycina 3: Dynamiczne i morfologiczne zmiany sieci mitochondrialnej. Reprezentatywne projekcje maksymalnej intensywności komórek (A) kontrolnych, (B) leczonych metforminą oraz (C) komórek poddanych działaniu metforminy, CCCP i Baf po przetworzeniu przez wtyczkę MEL. (D) Rozszczepienie (niebieski pasek) i zdarzenia fuzji (pomarańczowy pasek) wykryto w czasie i uśredniono dla każdej grupy leczonej. Następnie użyto wtórnego narzędzia morfologicznego do wykrycia (E) liczby struktur mitochondrialnych i (F) objętości mitochondriów. (G) Wreszcie, liczba zdarzeń rozszczepienia i fuzji była związana z całkowitą liczbą mitochondriów dostępnych w celu zrozumienia względnej dynamicznej aktywności sieci po każdym zabiegu. Pokazane wyniki reprezentują średnią z 12 komórek, z których każda była oceniana w pięciu kolejnych przedziałach czasowych. Całkowita liczba analizowanych komórek wyniosła n = 12. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowych ANOVA, a następnie testu Fishera-LSD. Podziałka = 10 μm. * oznacza wartość p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Komórki GT1-7, które były współtraktowane metforminą, CCCP i Baf (Metf + CCCP + Baf), wykazały znaczny wzrost zarówno rozszczepienia, jak i fuzji w porównaniu z komórkami kontrolnymi, a także komórkami traktowanymi tylko metforminą (Metf) (Figura 3D). Ponieważ powszechnie stosowana jest ocena liczby i objętości struktury mitochondrialnej, pokazaliśmy również, w jaki sposób aktywność rozszczepienia i fuzji wiąże się z ogólną liczbą mitochondriów w komórkach, pokazując w ten sposób, że chociaż liczba zdarzeń rozszczepienia i fuzji była wysoka po leczeniu Metf + CCCP + Baf, nie była to najbardziej aktywna sieć mitochondrialna. W ten sposób jesteśmy w stanie określić poziom aktywności sieci mitochondrialnej.

Rysunek uzupełniający S1: Zaznaczanie pojedynczych komórek. Za pomocą narzędzia odręcznego narysuj kształt wokół interesującej Cię komórki, zwiększając maksymalny kontrast, aby znaleźć jej obramowania. Po narysowaniu kształtu zaznacz interesujące Cię okno i kliknij przycisk Wyczyść na zewnątrz , aby wyizolować tę komórkę. W drugim oknie wybierz opcję Wyczyść , aby usunąć komórkę 1, usuwając możliwość uwzględnienia mitochondriów. Powtórz procedurę z komórką 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Generowanie funkcji rozpiętości punktów. Po lewej stronie znajdują się dane niezbędne do wygenerowania PSF (widoczne po prawej). Skrót: PSF = funkcja rozrzutu punktowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Makra dekonwolucyjne. PSF są wprowadzane do "psf_file". "input_file" powinien odzwierciedlać ścieżkę folderu, w którym obrazy są przechowywane przed dekonwolucją. "output_path" odzwierciedla pożądane miejsce docelowe obrazów po ich zdekonwoluowaniu. Liczba iteracji może być zmieniona w wierszu 55. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S4: Makra przetwarzania wstępnego. "Deconv-path" wskazuje lokalizację folderu zawierającego wszystkie zdekonwolucjonizowane obrazy, podczas gdy "output_path" wskazuje lokalizację folderu, w którym zapisywane są obrazy, które przeszły przez makra. ... Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S5: Progowanie adaptacyjne. Używając "średniej ważonej" jako sposobu obliczeń, ustawiliśmy rozmiar bloku pikseli na 150 i wybraliśmy odpowiednią wartość odejmowania, aby uwzględnić jak najwięcej struktur, jednocześnie eliminując zakłócenia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S6: Makra progowe. "input_path" oznacza lokalizację folderu zawierającego wszystkie wstępnie przetworzone obrazy, podczas gdy "output_path" wskazuje lokalizację folderu, w którym zapisywane są obrazy, które przeszły przez makra. Rozmiar bloku jest zmieniany w wierszu 12 zgodnie z wartością progu adaptacyjnego, a wartość odejmowania jest wskazywana jako wartość dodatnia w makrach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S7: Makra lokalizatora zdarzeń mitochondrialnych. "inputPathToTimeLapse" wskazuje pojedynczą lokalizację pliku zawierającego obraz z progiem, który ma zostać poddany przetwarzaniu, podczas gdy "outputPath" wskazuje lokalizację folderu, w którym zapisywane są obrazy i pliki danych wynikające z makr. Skrót: MEL = mitochondrialny lokalizator zdarzeń. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S8: Rozpoznawanie mitozy. Żółta strzałka wskazuje region, od którego mitochondria oddalają się przed przejściem mitozy. Komórki te nie powinny być uwzględniane w ocenie MEL, ponieważ prawdopodobnie dochodzi do zwiększonej liczby zdarzeń dynamicznych. Skrót: MEL = mitochondrialny lokalizator zdarzeń. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.