Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metody tworzenia całych i zdysocjowanych kultur zwojów korzenia grzbietowego myszy (DRG) i ich zastosowanie do oceny interakcji guz-nerw.

Streszczenie

Coraz częściej dostrzega się wpływ układu nerwowego na mikrośrodowisko guza oraz znaczenie inwazji neuronalnej jako drogi rozprzestrzeniania się nowotworu. Interakcje komórek rakowych z neuronami mogą sprzyjać ich inwazji wokół i do nerwów, co jest cechą wielu nowotworów o słabych wynikach klinicznych. Modele in vitro do badania wzajemnych interakcji między neuronami a komórkami nowotworowymi dostarczają cennych narzędzi do zrozumienia rozprzestrzeniania się raka i określenia podejść do jego złagodzenia.

W tym miejscu opisujemy protokół izolacji mysich zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i ustanowienia zarówno całych gór, jak i zdysocjowanych kultur jednowarstwowych, które można wykorzystać do wizualizacji morfologii neuronów i wzrostu neurytów w czasie. Całe DRG zamontowane w Matrigel zachowują architekturę nerwów i reakcje na bodźce w heterogenicznym środowisku bardziej podobnym do nerwu in vivo , podczas gdy zdysocjowane kultury nerwowe pozwalają na dokładniejszą ocenę bezpośrednich interakcji komórka-komórka. Po ustaleniu kultur DRG można dodać komórki rakowe w celu wytworzenia kokultur, które można wykorzystać do wizualizacji zmian w przeroscie neurytów i morfologii nerwów w odpowiedzi na komórki rakowe. Można ocenić wzrost lub ruchliwość komórek nowotworowych w odpowiedzi na sygnały pochodzące z nerwów w czasie lub w warunkach stymulacji lub zahamowania wzrostu, a także uwidocznić skutki bezpośredniego kontaktu między komórkami rakowymi a przedłużeniami nerwowymi.

Ponieważ oba modele kokultur mogą być generowane jednocześnie, protokół ten zapewnia bardziej kompleksowe spojrzenie na wpływ interakcji rak-neuron i ułatwia porównania warunków leczenia oraz integrację informacji z poziomu komórkowego i całych zwojów. Protokół ten ułatwi badanie interakcji nerw-guz i może być wykorzystywany w szerokim zakresie zastosowań, w tym w badaniach nad sygnalizacją komórkową, badaniami przesiewowymi leków lub badaniem niejednorodności środowiska guz-nerw i mechanizmach rozprzestrzeniania się guza wzdłuż nerwów.

Wprowadzenie

Rozsiew nowotworu, poprzez miejscową inwazję i przerzuty regionalne lub odległe, jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Chociaż badania koncentrowały się na naczyniowych lub limfatycznych drogach rozprzestrzeniania się, inwazja neuronalna komórek nowotworowych jest często obserwowana w wielu guzach litych, w tym raku trzustki 1,2, prostaty3, głowy i szyi4, piersi5 i jelita grubego6. W ostatnich latach liczne badania podkreśliły rosnącą rolę nerwów w promowaniu wzrostu i progresji guza oraz jako drogi rozprzestrzeniania się, napędzając rozwój przerzutów 7,8. W tym kontekście neuronauka nowotworów stała się znaczącą dziedziną badawczą, oferującą nowe perspektywy w onkologii poprzez wyjaśnienie interakcji między komórkami nowotworowymi a podstawowymi składnikami obwodowego układu nerwowego (PNS), które mogą przyczyniać się do tych procesów 8,9.

PNS składa się zarówno z nerwów obwodowych, jak i zwojów, które są niejednorodnymi strukturami złożonymi z różnych typów komórek, w tym neuronów o różnych rozmiarach i funkcjach, Schwanna i innych komórek glejowych, fibroblastów, makrofagów, komórek tucznych, melanocytów i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, które tworzą lokalne unaczynienie10. PNS jest kluczowym składnikiem mikrośrodowiska guza (TME), a wzajemna komunikacja między komórkami nowotworowymi a nerwami, bezpośrednio poprzez kontakt fizyczny lub pośrednio poprzez uwalnianie czynników neurotroficznych, neuroprzekaźników, czynników wzrostu i innych sygnałów, może ułatwiać inwazję neuronów i promować bardziej agresywnefenotypy8.

Modele in vitro mogą być wykorzystywane do charakteryzowania procesów, które przyczyniają się do utrzymania i naprawy nerwów i są coraz częściej wykorzystywane do badania interakcji komórkowych między nerwami a komórkami rakowymi11,12. Często stosowany model in vitro obejmuje wyekstrahowane zwoje korzenia grzbietowego myszy (DRG) hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi11. Modele te często wykorzystują dwuwymiarową (2D) jednowarstwową hodowlę zdysocjowanych komórek DRG do badania biologii neuronalnej in vitro i zostały wykorzystane do modelowania interakcji komórkowych w PNS13,14. Jednak hodowle 2D nie są tak złożone, jak mikrośrodowisko nerwowe i słabo reprezentują jego architekturę in vivo. Trójwymiarowe (3D) całe mocowania neuronów obwodowych lub zwojów stanowią alternatywę, która skuteczniej rekapituluje fizjologię nerwów obwodowych, aby bardziej holistycznie przedstawić interakcje nerwowo-środowiskowe 15,16,17,18. Jednak niejednorodność tego modelu ogranicza zdolność do wizualizacji lub ilościowego określenia interakcji komórka-komórka, a modele te są bardziej skuteczne w obserwacji ogólnych odpowiedzi nerwów obwodowych niż w badaniu określonych interakcji komórkowych i mechanistycznych reakcji na bodźce. Jest zatem jasne, że zdysocjowane i całe hodowle neuronów są komplementarne, a ocena modeli 2D i 3D równolegle jest optymalna do oceny zarówno ogólnych efektów, jak i reakcji poszczególnych komórek na bodźce.

Protokół ten opisuje metody generowania komplementarnych zdysocjowanych (2D) i całościowych (3D) kultur nerwowych, które można wykorzystać do oceny interakcji między nerwami a komórkami nowotworowymi zarówno na poziomie komórkowym, jak i tkankowym, zapewniając bardziej kompleksowy obraz tych interakcji niż metody wykorzystujące tylko jeden typ hodowli 1,13. Modele te można wykorzystać do wizualizacji i oceny procesów komórkowych, w tym morfologii komórek nerwowych i wzrostu neurytów, a także odpowiedzi komórek nowotworowych na czynniki chemotaktyczne wydzielane przez nerwy, takie jak czynniki neurotroficzne, oraz przesłuchy między neuronami czuciowymi a komórkami nowotworowymi. Pozwala również na eksplorację potencjalnych interakcji między komórkami nowotworowymi a innymi składnikami mikrośrodowiska nerwowego, takimi jak komórki odpornościowe, fibroblasty i glej. Podkreślamy zastosowanie tych modeli do badania interakcji między komórkami nerwowo-rakowymi w czasie, wizualizowanych za pomocą barwienia żywych komórek lub immunofluorescencji, jako przykładów podejść do oceny lub ilościowego określania interakcji i odpowiedzi komórek. Łącznie, wyniki uzyskane w wyniku zastosowania tych metod mogą pogłębić nasze zrozumienie tego, w jaki sposób układ nerwowy sprzyja wzrostowi i rozprzestrzenianiu się raka, pomagając nam opracować strategie ukierunkowane na te mechanizmy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace na myszach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Biuro Uniwersyteckiego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami na Queen's University (Protokół nr 2524). Zwierzęta były utrzymywane i poddawane eutanazji w celu pobrania tkanek zgodnie z wytycznymi etycznymi Canadian Council on Animal Care oraz National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research (Wielka Brytania). W tym protokole wykorzystaliśmy tkankę wyizolowaną od zwierząt C57BL/6, ale z powodzeniem wykorzystaliśmy również inne genotypy, w tym zwierzęta Rag2IL2Rγc KO. Sekcje 1-6 można wykonać w czystym środowisku na wysterylizowanym powierzchniowo stole laboratoryjnym (patrz rysunek 1), natomiast sekcje 7-9 należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dla lepszego zrozumienia stworzono schematyczne reprezentacje wymienionych kroków (rysunek 1).

1. Przygotowanie roztworów podstawowych

  1. Przygotuj roztwór papainy i roztwór kolagenazy IV/Dispase II. Papainę rozpuścić w sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w stężeniu 30 U/ml; przechowywać w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozpuścić kolagenazę typu IV w stężeniu 1,25 mg/ml i Dispazę II w stężeniu 2,5 mg/ml w PBS. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli neuropodstawowej (F12) uzupełnioną 2% suplementem B27 (50x roztwór podstawowy), 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (Pen-Strep) (100x roztwór podstawowy).
  3. Przygotuj Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS) z 1% penicyliną-streptomycyną (100x roztwór podstawowy).
    UWAGA: Aby wspomóc początkowe przeżycie i przyłączenie komórek, stosuje się pożywkę F12 uzupełnioną 10% FBS w celu poprawy zakładania kultur. Jednak FBS sprzyja również proliferacji komórek nieneuronalnych, w tym fibroblastów. Zmniejszone lub wolne od surowicy warunki pożywki (np. F12 uzupełnione tylko witaminą B27) mogą być stosowane w celu zminimalizowania wzrostu komórek nieneuronalnych w hodowli DRG i kokulturze raka, ale mogą wpływać na przeżycie, szczególnie w przypadku zdysocjowanych kultur neuronów. Pożywki bez surowicy powinny być również brane pod uwagę przy zbieraniu pożywek kondycjonowanych DRG, aby ocenić ich wpływ na zachowanie komórek rakowych.

2. Przygotowanie odczynników i materiałów do rozwarstwienia DRG (Rysunek 1A)

  1. Narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Wysterylizuj powierzchniowo mikroskop preparacyjny 70% etanolem i ustaw na czystej ławce.
  2. Dodać 6-8 ml HBSS-Pen-Strep (krok 1.3) do dwóch 10 cm płytek hodowlanych i umieścić na lodzie.
    UWAGA: Płytki te będą używane do pobierania kręgosłupa po sekcji. W zależności od liczby wycinanych rdzeni kręgowych mogą być potrzebne dodatkowe płytki.
  3. Dodaj 8-10 ml HBSS-Pen-Strep do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieść na lodzie.
  4. Dodać 3 ml HBSS-Pen-Strep do 3-centymetrowej płytki hodowlanej i umieścić na lodzie.
    UWAGA: Probówka o pojemności 15 ml przygotowana w kroku 2.3 będzie używana do zbierania DRG do dysocjacji, podczas gdy 3-centymetrowa płytka hodowlana (krok 2.4) będzie używana do zbierania DRG dla modelu z pełnym mocowaniem.

3. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli DRG w całości

UWAGA: Niektóre kroki opisane w tej sekcji mogą wymagać przygotowania przez całą noc. Chociaż każdy rodzaj płytki do hodowli tkankowej może być użyty do hodowli DRG, objętości i instrukcje w tym protokole zostały zoptymalizowane dla 8-dołkowych szkiełek ze szklanym dnem, co zapewniło optymalną jakość obrazowania dla naszych analiz. Trzymaj 8-dołkowe szklane szkiełko podstawowe, końcówki pipet i Matrigel na lodzie przez cały czas.

  1. Rozmrozić roztwór Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc (lub co najmniej 3 godziny) przed użyciem. Upewnij się, że Matrigel jest cały czas pokryty lodem.
  2. Schłodzić końcówki pipet i 8-dołkowe szkiełko dolne w temperaturze -20 °C przez noc, aby zminimalizować przywieranie Matrigel do końcówek i zapobiec przedwczesnej polimeryzacji Matrigel w płytce.
  3. Podgrzać dodane podłoże (krok 1.2) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.

4. Przygotowanie odczynników i materiałów do zdysocjowanej hodowli DRG

  1. Rozmrozić roztwór papainy i roztwór kolagenazy IV/Dispazy II (krok 1.1) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia.
    UWAGA: Dla każdej podzielonej myszy należy użyć po 1 podwielokrotności (1 ml) roztworu papainy i kolagenazy IV/Dyspazy II.
  2. Ciepłe uzupełnione pożywki hodowlane (krok 1.2).

5. Pobranie kręgosłupa (ryc. 1B) i wypreparowanie DRG (ryc. 1C)

  1. Eutanazja 4-8-tygodniowych myszy przez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Połóż uśpione zwierzę na jego brzuchu i ogol jego futro, koncentrując się na obszarze nad kręgosłupem (ryc. 1B, kroki 1,2).
  2. Spryskaj grzbiet zwierzęcia 70% etanolem i usuń luźną sierść, wycierając ją ręcznikami papierowymi od ogona do czaszki, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierści podczas sekcji.
  3. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek wykonaj proste nacięcie wzdłuż ogolonej powierzchni grzbietowej, od ogona do czaszki. Cofnij skórę po obu stronach nacięcia za pomocą kleszczy, aby odsłonić kręgosłup (ryc. 1B, krok 3).
  4. Używając świeżej pary kleszczy i nożyczek, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią, wykonaj poziome nacięcie u podstawy (końca ogona) kręgosłupa (ryc. 1B, krok 4).
  5. Wykonaj dwa równoległe podłużne nacięcia po każdej stronie kręgosłupa, aby go uwolnić. Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść kręgosłup, aby usunąć otaczającą tkankę łączną (Rysunek 1B, krok 5).
  6. Aby całkowicie uwolnić kręgosłup, wykonaj nacięcie w górnej części kręgosłupa (bliżej czaszki). Przenieś kręgosłup na wstępnie schłodzone 10-centymetrowe płytki zawierające HBSS-Pen-Strep na lodzie (krok 2.2) (Rysunek 1C, krok 6).
    UWAGA: Wygodnie jest zebrać wszystkie kręgosłupy na tej samej 10-centymetrowej płycie i przesuwać poszczególne kolumny pojedynczo na osobną płytkę w celu przeprowadzenia dalszych etapów sekcji.

6. Rozwarstwienie zwojów korzenia grzbietowego (DRG)

  1. Za pomocą nożyczek sprężynowych usuń resztki tkanki łącznej wokół kręgosłupa, odsłaniając kręgi (ryc. 1C, krok 7). Pozwala to na wyraźniejszą wizualizację kręgu i ułatwia cięcie wzdłuż linii środkowej. Zbierz przycięte kolumny na świeżym, wstępnie schłodzonym talerzu o średnicy 10 cm (krok 2.2).
  2. Pojedynczo przenieś przycięty rdzeń kręgowy na stolik mikroskopowy w celu sekcji. Ostrożnie podziel kręgosłup w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą nożyczek sprężynowych (Rysunek 1D, krok 8).
  3. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką usuń rdzeń kręgowy z kręgosłupa, odsłaniając DRG obustronnie wzdłuż korzeni nerwów rdzeniowych (ryc. 1D, krok 9).
    UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ DRG można usunąć wraz z rdzeniem kręgowym, jeśli obchodzi się z nim zbyt brutalnie.
  4. Przeciąć nerwy rdzeniowe nożyczkami sprężynowymi i usunąć tkankę łączną wokół DRG (ryc. 1D, krok 10).
    UWAGA: Usunięcie tkanki łącznej na tym etapie minimalizuje zanieczyszczenia w kulturach DRG.
  5. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie pociągnij DRG, aby wydobyć go z korzenia grzbietowego. W przypadku całej kultury montażowej umieść DRG na 3-centymetrowej płytce (przygotowanej w kroku 2.4) (Rysunek 1D, krok 11). Zebrać pozostałe DRG w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (przygotowanej w kroku 2.3) w celu użycia do dysocjacji.
    UWAGA: Utrzymuj talerze i rurki na lodzie przez cały proces sekcji.
  6. Powtarzaj kroki od 6.4 do 6.5, aż wszystkie DRG zostaną wyodrębnione. Powtórz wszystkie powyższe kroki dla wszelkich dodatkowych kolumn kręgosłupa.
    UWAGA: Myszy mają 30-31 par DRG w zależności od szczepu, co pozwoli na zebranie do 60 DRG od każdego zwierzęcia. W przypadku pobierania DRG tylko z odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego, można pobrać 10 DRG. Wykorzystanie DRG pochodzących od tego samego zwierzęcia do stworzenia obu modeli hodowli zmniejsza zmienność wewnątrzdoświadczalną i zapewnia spójne i porównywalne wyniki między uzupełniającymi się doświadczeniami.
    UWAGA: Wszystkie czynności następujące po ekstrakcji DRG muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

7. Hodowla DRG w całości (rysunek 2)

  1. Używając wstępnie schłodzonych końcówek (krok 3.2), odpipetować 2 μl schłodzonego Matrigelu, aby utworzyć kroplę w każdym dołku 8-dołkowego szkiełka podstawowego umieszczonego na lodzie (Rysunek 2A, krok 1). Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji Matrigel przed dodaniem DRG, należy pipetować tylko jedną kroplę na raz. Aby zapobiec zarysowaniu powierzchni zjeżdżalni, przed umieszczeniem na lodzie umieść zjeżdżalnię w 10 cm talerzu.
  2. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś jeden DRG na suchą płytkę i delikatnie przesuwaj go, aby usunąć nadmiar HBSS, zapobiegając dalszemu rozcieńczaniu Matrigel podczas dodawania DRG do kropli Matrigel. Przenieś DRG do kropli Matrigel (Rysunek 2A, krok 2).
    UWAGA: Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby delikatnie wepchnąć DRG do kropli Matrigel, upewniając się, że DRG jest całkowicie zanurzony i umieszczony centralnie w kropli.
  3. Powtórzyć kroki od 7.1 do 7.2 dla każdego DRG dodanego do kropli Matrigel.
  4. Inkubować 8-dołkowe szkiełko podstawowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut w nawilżanym inkubatorze, aby umożliwić polimeryzację Matrigelu (Rysunek 2A, krok 3).
  5. Ostrożnie dodać 200 μl ciepłej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (Rysunek 2B, krok 4). Co 72 godziny należy wymieniać pożywkę na świeże uzupełnione pożywki hodowlane.
  6. Monitoruj DRG za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby ocenić jego żywotność i wzrost neuronów co 24 godziny (Figura 2C i Rycina 3).
    UWAGA: Na żywotność można wskazywać poprzez wzrost długości i gęstości neurytów. Obrazy mogą być rejestrowane w czasie, aby zademonstrować rozwój rozszerzeń komórek DRG (ryc. 3).

8. Zdysocjowana kultura DRG (rysunek 4)

UWAGA: Każda płytka wielodołkowa może być użyta do zasiewu zdysocjowanych neuronów DRG. Jednak w tym protokole zastosowano 8-dołkowe szkiełka ze szklanym dnem, ponieważ zapewniały one lepszą konfluencję komórek i jakość obrazowania do analiz immunofluorescencyjnych.

  1. Powlekanie płytek hodowlanych kolagenem
    1. Przygotować 50 μg/ml roztworu roboczego zakwaszonego kolagenu I w sterylnym 0,01 M HCl w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Odpipetować 100 μl roztworu kolagenu I do każdego dołka 8-dołkowego szkiełka podstawowego. Przechyl i delikatnie obróć szkiełko, aby upewnić się, że roztwór kolagenu równomiernie pokrywa całą dolną powierzchnię każdej studzienki. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 1 godzinę, aby zapewnić polimeryzację kolagenu I.
      UWAGA: W czasie inkubacji wykonaj kroki 8.2 i 8.3.
    3. Po inkubacji delikatnie odpipetować resztki niespolimeryzowanego roztworu kolagenu I z każdej studzienki. Przepłukać każdą studzienkę 100 μl PBS. Odpipetuj nadmiar PBS, pozostawiając cienką warstwę resztkową, aby zapobiec wysychaniu kolagenu.
      UWAGA: 8-dołkowe szkiełko dolne może pozostać w komorze bezpieczeństwa biologicznego do czasu, aż zdysocjowane DRG będą gotowe do etapu wysiewu.
  2. Trawienie enzymatyczne
    1. Delikatnie odwirować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą wyekstrahowane DRG (krok 6.5) przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze pokojowej w celu osadzenia DRG. Delikatnie usunąć HBSS za pomocą pipety.
    2. Opłucz DRG we wstępnie podgrzanym dodatku, delikatnie stukając w probówkę, aby upewnić się, że cała zawartość jest myta i odwiruj przez 5 minut przy 200 × g , aby granulować DRG.
    3. Odpipetować pożywkę i dodać 1 ml roztworu papainy (Rysunek 4A, krok 1). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Delikatnie potrząsaj probówką, aby mieszać ją co 5 minut.
    4. Po 20 minutach dodaj 4,5 ml uzupełnionej pożywki i delikatnie wymieszaj, aby zneutralizować papainę. Probówkę wirową przez 5 minut przy 400 × g do granulowania DRG. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    5. Dodać 1 ml roztworu kolagenazy IV/Dispazy II i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Delikatnie potrząsaj probówką co 5 minut (Rysunek 4A, krok 1).
    6. Po 20 minutach dodaj 4,5 ml uzupełnionej pożywki i delikatnie wymieszaj, aby zneutralizować roztwór kolagenazy IV/Dyspazy II. Probówkę wirową przez 5 minut przy 400 × g do granulowania DRG. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    7. Dodać 2 ml dodatkowej pożywki i dodać DNazę I do końcowego stężenia 0,2 mg/ml. W tym momencie DRG są dokładnie trawione i mogą wyglądać jak luźna grudka (Rysunek 4A, krok 2).
  3. Dysocjacja mechaniczna
    1. Delikatnie rozcierać DRG, pipetując w górę i w dół 4-5 razy za pomocą końcówki do pipety z filtrem o pojemności 1000 μl (Rysunek 4A, krok 2).
    2. Wykonaj drugi etap rozcierania za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl 4-5 razy. Po tym etapie próbka wydaje się mętna z widocznymi grudkami tkanki (ryc. 4A, krok 2).
    3. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Stopniowo przepłucz sitko 10 ml pożywki, aby zapewnić pełną filtrację komórek przez sitko (Rysunek 4A, krok 3).
    4. Probówka wirówkowa przez 5 minut przy 1 000 × g do komórek osadzających. Usuń pożywkę z osadu i ponownie zawieś w 500 μl uzupełnionej pożywki (Rysunek 4A, krok 4).
    5. Usunąć wszelkie pozostałości PBS z dołków 8-dołkowego szklanego szkiełka podstawowego. Rozprowadzić zdysocjowaną zawiesinę DRG między studzienkami pokrytymi kolagenem. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . W razie potrzeby dodaj więcej pożywki i zastąp pożywkę świeżą uzupełnioną pożywką hodowlaną co 48 godzin (Rysunek 4B, krok 5).
      UWAGA: Komórki zdysocjowane DRG można policzyć za pomocą hemocytometru lub komory do liczenia komórek i barwienia błękitem trypanowym, aby zapewnić stałą liczbę komórek w studzience. W tym protokole około 1 × 105 komórek wysiano w każdej studzience.
    6. Monitoruj komórki pochodzące z DRG za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu oceny żywotności i wzrostu neuronów (Figura 4C i Figura 5).
      UWAGA: Neurony wyglądają jak zaokrąglone ciała komórkowe z określonymi granicami i mogą potrzebować 24 godzin lub więcej, aby się przykleić, podczas gdy komórki nieneuronalne zwykle osiadają przed neuronami. Po 24 godzinach można zaobserwować pewien przerost neurytów, który narasta z czasem do 7 dni w hodowli. Zdysocjowane komórki pochodzące z DRG i DRG z całą górą są wstępnie inkubowane przez 72 godziny przed dodaniem komórek rakowych i utworzeniem kokultur.

9. Przygotowanie zawiesin komórek nowotworowych i zakładanie kokultur

UWAGA: Można stosować wiele rodzajów przylegających komórek rakowych. Pożywki wzrostowe i liczba komórek w kokulturach będą zależne od linii komórkowej. Zalecamy wstępne testy przed eksperymentem w celu określenia czasu pobierania komórek i optymalnej liczby wysiewu komórek. Opisany tutaj protokół opierał się na wykorzystaniu linii komórkowych ludzkiego raka trzustki PanC1 i MiaPaCa2 oraz linii komórkowej raka prostaty DU-145.

  1. Umyj komórki pożywką bez surowicy i trypsynizuj je przez około 3 minuty za pomocą 2 ml trypsyny/10 cm płytka.
  2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 6 ml dodatku, a następnie delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Policz komórki za pomocą hemocytometru i trypanowego niebieskiego barwienia.
  3. Zawiesić komórki rakowe w stężeniu 2 × 105 komórek/ml w dodatkach (krok 1.2).
    UWAGA: Optymalna gęstość komórek może się różnić w zależności od wielkości komórki, czasu podwojenia i czasu trwania kohodowli i może być dostosowana w razie potrzeby.
  4. Cała górowana DRG i kohodowla komórek rakowych (ryc. 6B)
    1. Odessać pożywkę z całego montażu kultur DRG w 8-dołkowym szkiełku podstawowym.
    2. Delikatnie odpipetować 200 μl zawiesiny komórek rakowych (krok 9.3) na kroplę Matrigel zawierającą całą mocowaną DRG.
      UWAGA: Zapewnia to równomierne rozmieszczenie komórek rakowych wokół kropli. Należy uważać, aby nie naruszyć kropli Matrigel końcówką pipety.
    3. Inkubować szkiełko do kokultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Odświeżaj podłoże codziennie, przemywając raz 200 μl podgrzanego podłoża uzupełniającego, a następnie dodając 300 μl dodanego podłoża do każdej studzienki.
      UWAGA: Delikatnie odessać pożywkę za pomocą pipety, aby uniknąć zakłócenia kohodowli komórek DRG i rakowych. Z biegiem czasu, gdy kokultury stają się coraz bardziej złożone i zorganizowane, stają się również bardziej podatne na zakłócenia, które mogą wpływać na interakcje komórkowe i integralność współkultur.
    4. Monitoruj kokulturę za pomocą mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu fluorescencyjnego w odstępach 24 godzin, aby ocenić zachowanie komórek rakowych i interakcje neuronalne (ryc. 6B).
      UWAGA: Częstotliwość obserwacji można dostosować w oparciu o oś czasu eksperymentu i interakcje komórek, które są przedmiotem zainteresowania.
  5. Zdysocjowana DRG i kohodowla komórek rakowych (ryc. 6C)
    1. Odessać pożywkę z dysocjowanych kultur w 8-dołkowym szkiełku ze szklanym dnem.
    2. Delikatnie rozprowadzić 200 μl zawiesiny komórek rakowych (krok 9.3) do każdej studzienki. Postępuj zgodnie z tymi samymi krokami inkubacji, odświeżania pożywki i monitorowania, jak opisano dla współkultur z całymi wierzchowcami (kroki 9.4.3 i 9.4.4).
      UWAGA: W celu lepszej wizualizacji procesów komórkowych i interakcji komórka-neuron rakowa, do hodowli można dodać fluorescencyjne trackery komórek, zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasz protokół opisuje izolację pierwotnych komórek pochodzących z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy oraz ustanowienie dwóch komplementarnych modeli hodowli: hodowli dysocjowanych DRG oraz hodowli całych zwojów DRG, co pozwala nam badać interakcje między nerwami a komórkami nowotworowymi na różnych poziomach złożoności. Kluczową zaletą tego protokołu jest możliwość uzyskania obu typów hodowli z DRG wyizolowanych od tego samego zwierzęcia, co minimalizuje zmienność międzyosobniczą i m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje ulepszone metody tworzenia pierwotnych kultur nerwowych 2D i 3D DRG oraz ich zastosowanie w kohodowli z komórkami nowotworowymi. Protokół ten rozwija poprzednie metody, ustanawiając te dwa modele równolegle. Ponieważ modele 2D i 3D są tworzone w tym samym czasie, przy użyciu pierwotnych nerwów wyizolowanych od tych samych zwierząt, zmienność międzyzwierzęca i międzyeksperymentalna jest zminimalizowana, a dane z obu modeli można łatwiej porównywać lub integrować, co ułatwia uzupełniają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (PJT-178274) (LMM) oraz przez stypendium dla absolwentów Ontario (LCBO) oraz przez stypendium od Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadry Szkolnictwa Wyższego - Brazylia (CAPES) - Kod Finansowy 001 (ERP). LMM jest Katedrą Genetyki i Medycyny Molekularnej na Uniwersytecie Queen's. Niektóre obrazy zostały częściowo wygenerowane przy użyciu Biorenderu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tools
70 &mikro; m Sitko komórkoweGen71-229483-ULTSłuży do filtrowania zawiesiny komórek
8-dołkowe szkiełka ze szklanym dnemIBidi, Monachium, Niemcy80807
Dumont #5 - Cienkie kleszczeFine Science Tools, Foster City, Stany Zjednoczone11254-20
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools, Foster City, Stany Zjednoczone11252-20
Cienkie nożyczkiFine Science Tools, Foster City, Stany Zjednoczone91460-11
Kleszcze wzorcoweFine Science Tools, Foster City, Stany Zjednoczone91121-12
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools, Foster City, Stany Zjednoczone91500-09
odczynniki
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma, St. Louis, Stany ZjednoczoneD8662-500MLSłuży do rozpuszczania enzymów
Suplement B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone17504044Stosowany w stężeniu 2% w podłożach F12
Kolagen bydlęcy typu ICorning Incorporated, Nowy Jork, Stany Zjednoczone354231Służy do powlekania płyt, Roztwór roboczy 50 i mikro; g / ml w 0,01 M HCl
Kolagenaza typu IVSigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneC4-BIOCRozpuścić w PBS w stężeniu 1,25 mg/ml, podwielokrotność, przechowywać w temperaturze -20 °; C
Dypaza IIRoche, Bazylea, Szwajcaria4942078001Rozpuścić w PBS w stężeniu 2,5 mg/ml, podwielokrotnie, przechowywać w temperaturze -20 ° C
DNaza IRoche, Bazylea, Szwajcaria.11284932001Dodawany w końcowym stężeniu   0,2 mg/ml podczas dysocjacji
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneZobacz materiał F1051Stosowany w stężeniu 10% w pożywkach F12
HBSS (Zrównoważony Roztwór Soli Hanka)Sigma, St. Louis, Stany ZjednoczoneH6648-500MLPrzygotowany z 1% penicyliny-streptomycyny
Obniżony czynnik wzrostu MatrigelCorning Incorporated, Nowy Jork, Stany Zjednoczone356231Rozmrażanie w 4 & stopni; C przez noc, trzymaj na lodzie
Mieszanka składników odżywczych F-12 SzynkaSigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneN6658-500MLPodstawowa pożywka do przygotowania uzupełniających pożywek hodowlanych
PapainaRoche, Bazylea, Szwajcaria.10108014001Rozpuścić w PBS w stężeniu 30 j./ml, podwielokrotność, przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Penicylina-Streptomycyna (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneP4333-100MLStosowany w stężeniu 1% w pożywkach
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneT8154-100MLAby ocenić żywotność komórek
TrypLE EkspresowyThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone12605-028Do pobierania komórek rakowych
przeciwciała
β-Przeciwciało przeciwko tubulinie IIIAbcam (Cambridge, Wielka Brytania)AB15568Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneA-11008Rozcieńczenie 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneA-21442Rozcieńczenie 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneA-21245Rozcieńczenie 1:2000
Przeciwciało NeuNSigma-Aldrich, St. Louis, Stany ZjednoczoneMAB377 powiedział:Rozcieńczenie 1:100
barwniki fluorescencyjne i Sondy
ActinGreen 488 Odczynnik ReadyProbes (falloidyna)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneCzynnik R37110Rozcieńczenie 1:40
CellTrace Calcein Czerwono-PomarańczowyThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneZobacz materiał C34851Tracker komórkowy używany do wizualizacji neuronów pod mikroskopem fluorescencyjnym
Hoechst 33342 powiedział:Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany ZjednoczoneZobacz materiał H3570Rozcieńczenie 1:5000

Bibliografia

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura DRGinterakcja neuron w z nowotworemhodowla ca ych preparat wkultura dysocjowanych neuron wwzrost neuryt wmodel kokulturymikro rodowisko guzainwazja neuralna
Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.