Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

DOI:

10.3791/68644

⸱

28 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silnie multipleksowane obrazowanie umożliwia badanie funkcjonalnie zróżnicowanych komórek i ich nisz w ich rodzimych środowiskach tkankowych. Iteracyjne Wybielanie Rozszerza Multipleksyjność (IBEX) to cykliczna technika immunoznakowania i inaktywacji fluoroforu, która pozwala na wizualizację wielu markerów na tym samym przekroju tkanki. Przechwycone obrazy można następnie analizować w celu uzyskania danych z pojedynczych komórek w celu zdefiniowania klastrów komórek, ich lokalizacji oraz sąsiednich typów komórek. Interpretacja tych danych opiera się na zdolności rozróżniania prawdziwych wyrażeń markerów od źródeł tła, które są inherentne dla mikroskopii fluorescencyjnej. Spectral IBEX, adaptacja protokołu IBEX, integruje spektralną konfokalną detekcję z obliczeniowym rozmieszaniem i wykorzystuje blokowanie heparyny, aby zmniejszyć wiązanie pozacelowe na podstawie ładunku. To połączenie poprawia stosunek sygnału do tła, tłumi autofluorescencję tkanek i minimalizuje przeciekanie, jednocześnie skracając czas akwizycji w porównaniu z konwencjonalnym wielotorowym obrazowaniem konfokalnym. Zastosowanie na ludzkiej tkance nosowej polipów, modelu charakteryzującego się wysoką zawartością eozynofilów i silną autofluorescencją, wykazało wiarygodne obrazowanie 26 markerów w przedziałach strukturalnych, immunologicznych i stanów komórkowych w sześciu cyklach obrazowania. Powstały w ten sposób workflow generuje wysokowymiarowe, przestrzennie rozdzielone informacje proteomiczne, które oddają złożoną architekturę tkanek i nisze komórkowe. To zoptymalizowane podejście razem zapewnia solidną i szeroko stosowalną strategię obrazowania multipleksowego, szczególnie odpowiednią dla tkanek, gdzie autofluorescencja i niespecyficzne barwienie ograniczają konwencjonalne podejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki składają się z różnorodnego zestawu komórek o specjalistycznych funkcjach, które organizują się w trójwymiarowe struktury i poprzez interakcje koordynują procesy biologiczne niezbędne do życia. Patologia powstaje, gdy zaburzenia składu komórkowego lub architektury tkanek zakłócają te interakcje i zaburzają homeostazę tkanek1. Wiedza o tym, jak liczne wyspecjalizowane typy komórek lokalizują i oddziałują w naszych tkankach, jest niezbędna, aby zrozumieć biologię leżącą u podstaw ludzkiego zdrowia i chorób.

Postępy w technologiach profilowania pojedynczych komórek na poziomie transkryptomicznym, epigenomicznym i proteomicznym ujawniły wyjątkową różnorodność wyspecjalizowanych typów komórek. 2,3 Technologie takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek oraz cytometria przepływowa spektralna mogą mierzyć liczbę parametrów potrzebnych do scharakteryzowania tych heterogenicznych populacji. Jednak te podejścia nie zawierają informacji przestrzennej, ponieważ komórki muszą być rozdzielone od swojego rodzimego środowiska tkankowego do zawiesin pojedynczych komórek 4,5. W związku z tym zidentyfikowano typy komórek powiązane z różnymi kontekstami chorób, jednak ich interakcje w tkance oraz ich wkład w utrwalanie choroby pozostają niejasne.

Aby rozwiązać niektóre z tych ograniczeń, opracowano kilka technologii przestrzennej omiki, które rejestrują heterogeniczność komórkową w tkance, jednocześnie zachowując pozycję każdej komórki6. Na przykład transkrypcję genów można zmierzyć albo poprzez amplifikację RNA w zrasteryzowanych miejscach na przekroju tkanki (np. Visium) lub poprzez wykorzystanie sond hybrydyzujących RNA skierowanych na panel określonych genów obrazowanych w rozdzielczości pojedynczej komórki (np. Xenium)7,8. Metody te są skuteczne w śledzeniu wzorców transkrypcji i mechanizmów regulacyjnych w tkankach. Jednak profile transkrypcyjne często słabo korelują z ekspresją białek, co bardziej bezpośrednio odzwierciedla funkcjonalne możliwości komórki9. Ekspresję białek można zidentyfikować za pomocą specyficznych przeciwciał sprzężonych z fluoroforami, które można wykryć mikroskopią fluorescencyjną10,11. Zastosowanie tradycyjnej mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na dyskretne obrazowanie nawet sześciu takich fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami. Jednak nakładające się profile wzbudzenia i emisji tych fluoroforów powodują niepewność co do pochodzenia sygnału fluorescencyjnego w dowolnym kanale12.

Iterative Bleaching Extending multipleXity (IBEX) to metoda obrazowania o wysokiej zawartości ciała, opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń mikroskopii fluorescencyjnej 13,14,15. IBEX wykorzystuje borowodnik litu (LiBH4) do chemicznej inaktywacji fluoroforów po obrazowaniu, co pozwala na ponowne zabarwienie tej samej próbki tkanki kolejną serią przeciwciał sprzężonych z fluoroforami przed ponownym obrazowaniem. IBEX zachowuje integralność tkanek, umożliwiając wiele rund obrazowania w celu wizualizacji teoretycznie nieograniczonej liczby markerów na tym samym przekroju tkanki. Obliczeniowe wyrównanie pozyskanych obrazów zapewnia charakteryzację na poziomie omiki w rozdzielczości pojedynczej komórki, jednocześnie zachowując dane przestrzenne, aby ujawnić nisze komórkowe. Dane te mogą również ujawnić domniemane interakcje komórkowe, choć należy je zweryfikować innymi technikami16. IBEX to otwartoźródłowa metoda kompatybilna z komercyjnie dostępnymi fluoroforami i wspierana przez międzynarodową społeczność badaczy, którzy zweryfikowali odczynniki i publicznie udostępniają dane, aby promować dostępność, szybkie wdrożenie oraz wysokiej jakości generowanie danych17,18.

W tej pracy opracowano zmodyfikowany protokół IBEX, aby pokonać dwa główne wyzwania tej techniki: autofluorescencję tkanek oraz niespecyficzne wiązanie sond przeciwciał sprzężonych z fluoroforem (łącznie określanych jako tło). Autofluorescencja powstaje, gdy wzbudzenie fluorescencjonujących cząsteczek endogennych dla tkanki emituje światło nakładające się na pożądany sygnał uzyskany z fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami19,20. Niedocelowe lub niespecyficzne wiązanie przeciwciał sprzężonych z fluoroforem skutkuje fluorescencją komórek lub struktur, które nie wyrażają docelowego białka21,22. Te artefakty mogą prowadzić do błędnego wniosku, że komórka wyraża marker, którego nie wyraża w rzeczywistości, co komplikuje analizy obliczeniowe i dokładne przypisywanie typów komórek. Łącząc neutralizację ładunku sygnału poza celem opartą na heparynie z pełnym spektralnym akwizycją i rozdzielaniem obliczeniowym, spektralny IBEX znacząco zmniejsza przepuszczanie sygnału do tła (SBR) i skraca czas nabycia na pocisk o połowę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki polipów nosowych użyte w tym badaniu zostały zebrane podczas operacji zatok w Hamilton Health Sciences za etyczną aprobatą Hamilton Integrated Research Ethics Board. Wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę.

1. Zbieranie próbek

  1. Pobieranie próbek podczas rutynowych zabiegów polipektomii wykonywanych u pacjentów z przewlekłym zapaleniem zatok nosatok. Po chirurgicznym usunięciu należy umieścić próbki w fiolce z medyczną solą fizjologiczną na lodzie do transportu i natychmiast przetworzyć je do obrazowania, aby zachować integralność tkanek.

2. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotuj rozwiązanie fiksacyjne i permeabilizacyjne, rozcieńczając uzyskany roztwór do utrwalania i permeabilizacji w proporcji 1:4 w PBS. Przygotuj roztwór kriokonserwacji jako 30% sacharozy w PBS. Przygotuj bufor rozcieńczający jako 0,1% v/v Triton X-100 w PBS.
  2. Przygotuj odczynnik blokowy BSA jako 1% z zawartością albuminy surowicy bydłej w buforze rozcieńczalnym. Przygotuj odczynnik blokowy heparyny jako sól sodową heparyny 10KU w 1 mL PBS. Przygotuj bufor blokujący, mieszając odczynnik heparynowy (1:50) z odczynnikiem blokowym Fc (1:100) w odczynniku blokowym BSA.
  3. Przygotuj mieszankę barwiącą jako przeciwciała titrowane w odpowiednich rozcieńczeniach w buforze blokującym. Przygotuj roztwór wybielający, dodając 10 mg LiBH4 do 10 mL ultraczystej wody.

3. Przetwarzanie tkanek i brutowanie

  1. Zbadaj tkankę pod mikroskopem rozwarstwionym (zazwyczaj przy ~15x powiększeniu, choć może się to różnić w zależności od próbki i mikroskopu) oraz usuń tłuszcz i kość za pomocą kleszczy i skalpela. Aby jak najlepiej zachować tkankę, używaj czystych narzędzi, pracuj na zimnej i wilgotnej powierzchni oraz skróć czas obróbki.
  2. Grube tkanki > 0,5 cm grubości w kawałki o grubości 4-5 mm skalpelem23. Zanurz plastry w roztworze fiksacyjnym i permeabilizacyjnym oraz obróć w temperaturze °C przez 16 godzin.
    UWAGA: Objętość tego roztworu i pozostałych w kroku 3.3 powinna być około 20 razy większa niż objętość próbki, w odpowiednio dużej probówce.
  3. Przenieś tkankę do PBS i płucz przez 5 minut. Zanurz tkankę w roztworze kriokonserwacji i inkubuj w temperaturze °C przez 16 godzin. Nie myj po tym kroku, ponieważ ponownie wprowadzi to wodę do tkanek.

4. Zamrożenie tkanek

  1. Oznacz płytkę z 6 dołkami z opisem eksperymentu i próbką nad każdym dołkiem, a następnie umieść ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aby ostygła przez co najmniej 20 minut.
  2. Napełnij odpowiednio dopasowany kriomold związkiem o Optimal Cutting Temperature (OCT). Unikaj tworzenia bąbelków w OCT. Przeciągaj duże bąbelki do krawędzi kryomoldu za pomocą igły lub końcówki pipety.
    UWAGA: Kriomold można wykonać z folii aluminiowej owiniętej wokół małej fiolki lub rurki o płaskim dnie.
  3. Usuń tkankę z roztworu kriokonserwacyjnego. Delikatnie osuszaj chusteczkę chusteczką bez kłaczków, aby usunąć nadmiar płynu, ponieważ może to ograniczyć zamrożenie.
  4. Napełnij zlewkę 250 mL około 100-150 ml izopentanu w okapie i umieść ją w pudełku z pianką lub chłodni, częściowo wypełnionej ciekłym azotem.
    UWAGA: Izopentan paruje, jeśli pozostaje otwarty dłużej niż 2 godziny; Użyj natychmiast po otwarciu. Izopentan ułatwia równomierne i szybkie zamarzanie tkanki. Izopentan może zamarzać powoli z czasem. Jeśli zamarznie na stałe, wyjmij zlewkę z ciekłego azotu i pozwól jej się rozmrozić. Izopentan można wlać do szklanej butelki z zakrętką i użyć go ponownie do 5 razy. Poziom izopentanu powinien być wyższy niż w ciekłym afercie, aby zapobiec unoszeniu się lub przechylaniu zlewki.
  5. Dostosuj orientację tkanki według potrzeb w obrębie OCT pod mikroskopem rozwarstwiennym.
    UWAGA: W przypadku tkanek polipowych nosa zazwyczaj orientujemy próbkę wzdłuż jej długiej osi, aby uzyskać symetryczne przekroje obejmujące jak największy przekrój poprzeczny. Skonsultuj się z podręcznikami histologicznymi dotyczącymi interesującej się tkanki, aby uzyskać optymalną orientację osadzenia.
  6. Zanurz spód kriomolda w izopentanie. Usuń kriomold z izopentanu, gdy środek tkanki jest całkowicie biały i nieprzezroczysty. Unikaj całkowitego zanurzenia krioformu; Blok może pękać, co utrudnia przekrojenie.
  7. Delikatnie wyjmij blok z kryomoldu, naciskając na tył i umieść go w schłodzonej płytce 6-dołkowej w temperaturze -20 °C. Po zamrożeniu wszystkich próbek przenieś płytkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: To jest punkt pauzy. Tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez lata.

5. Przygotowanie szkiełek i kriosekcjonowanie

  1. Pipeta 10-1 μL kleju z żelatyny chromowej na szkiełki; Rozłóż równomiernie i susz na powietrzu przez 15 minut. Dla optymalnej przyczepności nałóż klej z żelatyny chromowej na komorowe szkła okładkowe 2x-3x, dodając 5 μL na każdą aplikację (łącznie 15 μL).
  2. Po wyschnięciu umieść szkiełka w piekarniku w temperaturze 80 °C na godzinę, aby zapewnić całkowite wyschnięcie. Jeśli używasz szkła osłonowego komorowego, pozostaw je do wyschnięcia w 37 °C przez noc, ponieważ plastik może się stopić w 80 °C.
    UWAGA: Po powleknięciu i wyschnięciu szkiełek można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni, aż zostaną użyte. Powinny być zakryte, aby uniknąć kurzu.
  3. Przenieś tkanki z temperatury −80 °C do −20 °C (lub do kriostatu w temperaturze cięcia), aby się wyrównać, i schłodzić przez 1 godzinę przed sekcją. Wytnij 10-2 μm sekcje na kriostatie24.
    1. Jeśli przecinasz w komorowe szkło pokrywowe, delikatnie podnieś przekroj za pomocą kleszczy po podniesieniu płyty antytocznej. Użyj pędzla, aby położyć ją płasko na szkle wewnątrz komory. Naciśnij kciuk pod próbką na dole szkła pokrywy, aby stopić fragment na szkle.
  4. Susz się w temperaturze 3 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
    UWAGA: Jeśli szkiełki są używane od razu, można je tymczasowo przechowywać w temperaturze pokojowej w pudełku na szkiełki, aby chronić je przed kurzem podczas przygotowań do bejcowania. Jeśli jednak nie są używane od razu, przechowuj je w temperaturze -80°C, aby zachować integralność tkanki. To jest punkt pauzy. Jeśli preparaty są przechowywane w temperaturze -80 °C, proces można tu zatrzymać.

6. Blokowanie i immunoznakowanie przeciwciał

  1. Narysuj na szkle wokół chusteczki okrąg za pomocą długopisu PAP, aby stworzyć hydrofobową barierę zatrzymującą płyn podczas barwienia lub innych etapów. Nie rysuj na OCT, ponieważ hydrofobowy tusz zmyje się po rozpuszczeniu OCT.
    UWAGA: Ten krok nie jest potrzebny dla komorowego szkła pokrywowego, ponieważ ściany trzymają ciecz w studni.
  2. Dodaj ~100 μL PBS do każdej tkanki i inkubuj przez ~2 minuty w temperaturze pokojowej, aby nawilżyć tkanki i zmyć OCT. Użyj ~1 mL PBS do komorowego szkła pokrywowego.
    UWAGA: Aby zapobiec unoszeniu się tkanki ze szkła, nie pipetuj płynu bezpośrednio na próbkę.
  3. Aspiruj PBS i dodaj 100 μL bufora blokującego. Inkubuj w temperaturze pokojowej w zakrytej komorze wilgotności przez 1 godzinę. Użyj ~400 μL bufora blokującego do komorowego szkła pokrywowego.
  4. Aspiruj bufor blokujący i dodaj 100 μL mieszanki barwiącej. Inkubuj w zakrytej komorze wilgotności, umieszczonej na noc w lodówce (4 °C). Użyj ~400 μL mieszanki do barwienia do komorowego szkła okrywowego. Przygotuj przekroje barwione tylko jednym z fluoroforów w panelu oraz kontrolę ujemną bez barwień, aby określić widmo fluoroforów i autofluorescencję tkanek.
    UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał powinny być eksperymentalnie optymalizowane poprzez stopniowe zwiększanie do 1:50, 1:100 i 1:200 lub inne rozcieńczenie w razie potrzeby. Wybierz minimalną ilość przeciwciał, która da sygnał optymalny. Celuj, aby intensywność wszystkich przeciwciał w panelu była mniej więcej równoważna, aby zmaksymalizować skuteczność rozmieszania spektralnego. Chroń próbki przed światłem po tym etapie, aby zminimalizować fotobielenie fluoroforów.
  5. Aspiruj mieszankę do barwienia i myj 3 razy PBS (10 μL, po 2 minuty każda), zasysając płyn między każdym praniem. Użyj ~1 mL PBS do komorowego szkła osłonowego.
  6. Dodaj ~10 μL materiału montażowego do każdej sekcji. Pipetuj powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogą powodować optyczne aberracje podczas obrazowania. Aspiruj wszelkie powstałe pęcherzyki pipetą. Do komorowego szkła pokrywowego dodaj 1 mL materiału montażowego do każdego otworu.
    UWAGA: Następujące kroki, 6.7 i 6.8, nie są potrzebne dla komorowego szkła pokrywowego.
  7. Delikatnie połóż na okaz szkło osłonowe nr 1 o wymiarach 22 mm x 50 mm.
    UWAGA: Powstawanie pęcherzyków można zminimalizować, mocno dociskając jeden koniec szkła pokrywowego do nośnika montażowego i pozwalając szkłu opaść na próbkę, rozprowadzając medium równomiernie. Grubość szkła osłony powinna odpowiadać specyfikacji obiektywu (np. slip #1.5 dla większości obiektywów o wysokiej przysłonie numerycznej). Jeśli obiektyw ma kołnierz korekcyjny, upewnij się, że jest ustawiony do odpowiedniego rozmiaru slipu osłonowego. Użycie niewłaściwej grubości lub ustawienia kołnierza może powodować aberrację sferyczną i powodować rozmycie lub zniekształcenie obrazu.
  8. Odwróć suwak i delikatnie naciśnij na chusteczkę bez kłaczków, aby wypchnąć nadmiar materiału montażowego.
    UWAGA: Unikaj naciskania zamka z dużą siłą. Nadmierna siła może uszkodzić lub zdeformować tkankę, co może wpłynąć na ustawienie między rundami obrazowania.

7. Montaż mikroskopu i obrazowanie

UWAGA: Protokół ten odnosi się konkretnie do ZEISS LSM980 oraz innych systemów ZEISS. Te kroki mogą różnić się w innych systemach. Szczegółowo opisano dwa procesy pracy: tradycyjny konfokalny + rozłączanie (wielościeżkowe pozyskiwanie z obliczeniowym rozłączaniem spektralnym post hoc), które można zastosować, gdy detektor spektralny nie jest dostępny, ale ma dłuższy czas akwizycji i pewne resztkowe przepuszczanie; oraz pełną detekcję spektralną (jednoprzepustowe, 34-kanałowe akwizycje spektralne), naszą preferowaną metodą, ponieważ zapewnia najlepszy SBR, niemal zerowe przesłuchy i najszybsze czasy obrazowania.

  1. Tradycyjna mikroskopia konfokalna
    1. Włączanie systemu mikroskopowego (w tym laserów, detektorów i komputera) około 30 minut przed obrazowaniem.
    2. Na ekranie sterowania mikroskopem, dostępnym po kliknięciu Obiektywy > mikroskopie, wybierz odpowiednią soczewkę obiektywu (np. 20x 0,8 NA) i w razie potrzeby wyczyść ją bezpiecznym przecieradłem do obiektywu.
    3. Zamontuj próbkę mocno na scenie. Spróbuj ustawić szklaną lub pokrywową komorę szklaną do tego samego rogu/końca uchwytu zamka, aby ułatwić wyrównanie X-Y kolejnych nabojów. To zależy od zamontowanego uchwytu.
    4. Skup się na próbce za pomocą okularów na oświetleniu GFP, YFP lub RFP, a następnie przejdź do zakładki Akwizycja na ekranie komputera.
      UWAGA: Nie używaj filtra DAPI podczas ustawiania ostrości próbki za pomocą okularów, ponieważ naświetlenie barwy DAPI na światło UV (przy użyciu kostki filtra DAPI) spowoduje jej fotokonwersję w cząsteczkę zielonofluorescencyjną (Ilustracja uzupełniająca 1A).
    5. Konfiguruj ścieżki obrazowania minimalizujące nakładanie się i wzbudzenie krzyżowe lasera (Tabela Uzupełniająca 1, Tabela Uzupełniająca 2 opisuje ustawienia akwizycji dla tradycyjnych eksperymentów mikroskopii konfokalnej pokazane tutaj).
      UWAGA: Idealne kombinacje obejmują wyraźne szczyty wzbudzenia i emisji, takie jak DAPI lub AF488 razem z AF594, AF647 lub AF700.
      1. Przypisz optymalny laser wzbudzenia dla każdego toru. Dostosuj rozmiar otworku do 1 AU lub jednostki Airy dla każdego toru, aby optymalnie podzielić się przekrojami optycznymi.
      2. Dostosuj zakres długości fal nabycia dla każdego regulowanego detektora na ścieżce osobno, zgodnie z fluoroforami dla ścieżki.
      3. Stunuj moc lasera i ustawienia wzmocnienia detektora, aby zmaksymalizować SBR. Upewnij się, że bardzo niewiele pikseli, jeśli w ogóle, osiągnie maksymalną intensywność.
        UWAGA: Aby uniknąć fotobielenia i/lub nadmiernego naświetlania detektorów, utrzymuj moc lasera na możliwie najniższym poziomie. Optymalizuj rozcieńczenia przeciwciał, aby silny sygnał był wykrywany ponad tłem.
    6. Naciśnij przycisk trybu ciągłego skanowania, aby podglądać próbkę i ustawić parametry skanowania (prędkość skanowania, rozdzielczość i uśrednianie, jeśli to konieczne).
      UWAGA: Dla małych kafelków i minimalizacji tła zaleca się czas zatrzymania między 0,2 a 0,3 μs, z 1-2 rundami uśredniającymi. Aby zmaksymalizować szybkość przy zachowaniu segmentacji i rozdzielczości pojedynczej komórki, należy stosować najszybszą prędkość skanowania bez uśredniania oraz rozmiar piksela 0,2-0 μm/piksel. Na przykład obrazowanie w 2048 x 2048 pikseli na kafelek z obiektywem 20x/0,80 NA daje 0,20 μm/piksel na polu 424,26 x 424,2 μm2.
    7. Wykonaj skanowanie testowe dla każdego śladu, aby sprawdzić przesłuchy lub przepuszczanie sygnału.
      1. Na szkiełku barwionym wszystkimi markerami, w trybie ciągłego skanowania, uruchamiaj każdy laser z niską mocą i podtrzymuj go tylko do momentu, gdy marker będzie wyraźnie widoczny bez nasycenia (użyj wskaźnika LUT/nasycenia).
        UWAGA: Jeśli to możliwe, zaleca się użycie próbki replikowanej lub niepożądanego obszaru do optymalizacji ustawień mikroskopu przed zobrazowaniem próbki eksperymentalnej. Jest to szczególnie ważne podczas barwienia DAPI (aby uniknąć ryzyka fotokonwersji) lub fluoroforami, które szybko wybielają (np. PE).
      2. Przejdź do kontroli pojedynczej barwy dla tego fluoroforu. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora, aby sygnał był jasny i nienasycony.
      3. Na tym samym pojedynczym szkiecie zeskanuj wszystkie pozostałe kanały detekcyjne. Jeśli intensywność poza kanałem przekracza tło, zawęż okno detekcji i/lub obniż wzbudzenie/wzmocnienie.
      4. Powtarzaj 7.1.7.1-7.1.7.2 dla każdego fluoroforu. Po każdej korektie krótko sprawdź wcześniej zoptymalizowane bejce, aby utrzymać podobne intensywności, zwłaszcza jeśli markery współlokalizują.
    8. Włącz funkcję Tiles i zdefiniuj region pozyskiwania kafelków.
      1. Optymalizuj ostrość dla obszaru pozyskiwania kafelków w centrum tkanki. Znajdź unikalną cechę (zestaw komórek w określonym układzie) jako punkt odniesienia do wyrównania w kolejnych rundach.
    9. Włącz funkcję Z-stack i przejdź do zakładki Z-stack. Przejdź do zakładki Centrum. Ustaw liczbę fragmentów w stosie Z na co najmniej 6, z odstępem co najmniej 1 μm między fragmentami. Następnie kliknij przycisk Center , aby ustawić aktualny punkt ostrości (określony w kroku 6.1.8.1) jako środkowy fragment stosu.
    10. Kliknij przycisk Start eksperymentu , aby rozpocząć zbieranie zdjęć. Zapisz ustawienia akwizycji i zrób kopię zapasową danych obrazu, klikając prawym przyciskiem myszy na miniaturę obrazu i wybierając Zapisz jako. Następnie wybierz lokalizację pliku i nadam nazwę obrazowi.
    11. Rozmieszaj obraz przy użyciu tych samych zoptymalizowanych ustawień co przy pozyskiwaniu obszaru kafelkowego, uchwyć Snap z każdego pojedynczego barwionego kontrolera, aby uzyskać prawdziwe widmo sygnału, a z niebarwionego kontrolera uchwycić tło/autofluorescencję, przygotowane w kroku 6.4.
      1. Obrazy te służą do rozdzielania spektralnego; Nie wybieraj prawdziwego sygnału z multipleksowanych próbek. Potwierdź, że wybrany region rzeczywiście reprezentuje sygnał, najpierw upewniając się, że intensywność/morfologia jest nieobecna lub równoważna tłu w kontrolnym badaniu bez barwników, a następnie dopasowując się do oczekiwanej lokalizacji markera (np. membrana vs jądro, cytoplazmatyczna vs wzorce wydzielane).
      2. Otwórz zdjęcie snap. Kliknij zakładkę Rozłączanie . Użyj jednego z narzędzi do wyboru regionu w zakładce Unmix tools, aby narysować zwrot z inwestycji wokół dodatniego sygnału (pojawi się spektrum tego obszaru). Powtarzaj to dla każdego zdjęcia każdego fluoroforu, aby stworzyć widma odniesienia do rozmieszania.
        1. Porównaj to widmo z teoretycznym widmem fluoroforu, aby upewnić się, że wybrany obszar reprezentuje prawdziwy sygnał. Nazwij widmo według każdego fluoroforu i zapisz je do bazy danych spektralnej.
          UWAGA: Widmo autofluorescencji można zidentyfikować i traktować jako osobny fluorofor, aby oddzielić je od innych sygnałów. Po kompletnej optymalizacji panelu nie jest wymagane pozyskiwanie nowych referencji, ponieważ można ponownie używać tych samych ustawień, o ile używany jest ten sam protokół i typ tkanki.
      3. Załaduj kafelkowy obraz i przejdź do narzędzia Rozłączanie. Użyj przycisku +, aby dodać widma odniesienia dla każdego fluoroforu do listy rozłączania, a następnie kliknij przycisk Liniowe rozmieszanie .
    12. Zachowaj niezmieszany obraz na późniejszą analizę.
      UWAGA: Wyjściem jest obraz wielokafelkowy z kanałem dla każdego markera. Eksperyment można tu zatrzymać przed kontynuacją.
    13. Pobierz obraz odniesienia cieniowania
      1. Używając dokładnie tego samego ustawienia, co do zdjęcia próbki, uzyskaj obraz slajdu kalibracyjnego DAPI. Zapisz obraz, a następnie wyodrębnij tylko kanał DAPI, aby służyć jako referencja do cieniowania. Wyjściem jest obraz płaskiego pola (Rysunek uzupełniający 1B).
        UWAGA: Nie trzeba pobierać obrazu referencyjnego dla każdej próbki. Dopóki używany jest ten sam instrument z tymi samymi ustawieniami, odniesienie powinno być takie samo. Nie ma potrzeby tego odniesienia, jeśli uzyskane obrazy nie zawierają artefaktów cieniowania, jak pokazano na Dodatkowym Rysunku 1C.
  2. Spektralna mikroskopia konfokalna
    1. Zasilanie systemu mikroskopowego (w tym laserów, detektorów i komputera). Wybierz odpowiedni obiektyw (np. 20x 0,8 NA lub inny obiektyw) i w razie potrzeby czyść.
    2. Zamontuj próbkę mocno na scenie. Upewnij się, że slip jest skierowany w stronę celu.
    3. Skup się na próbce za pomocą brightfield lub DIC, a następnie przełącz się w tryb fluorescencji. Konfiguruj akwizycję widmową. Tabela uzupełniająca 3 przedstawia ustawienia pozyskiwania dla eksperymentów mikroskopii konfokalnej spektralnej pokazane tutaj.
      1. Przypisz odpowiednie lasery.
        UWAGA: Niektóre lasery mogą wzbudzić wiele fluoroforów. Dlatego może nie być konieczne posiadanie osobnego lasera dla każdego fluoroforu.
      2. Wybierz rozdzielacz wiązki odpowiedni dla używanych linii laserowych. Umożliwić wszystkim detektorom uchwycenie jak największej części widma. Dostosuj rozmiar otworu do 1 AU, aby uzyskać optymalne przekrojony optyki.
    4. Optymalizacja ustawień lasera
      1. Używając sekcji barwionej wszystkimi markerami, rozpocznij tryb ciągłego skanowania laserami o niskiej mocy. Dostrajaj intensywność każdego lasera, aż można zidentyfikować markery na dobrym SBR.
        UWAGA: Chociaż nie pozwoli to na precyzyjną korektę dla fluoroforów nakładających się spektralnie, pomoże zminimalizować liczbę przypadków, gdy pojedyncze barwione szkiełka muszą być podłączane do mikroskopu.
      2. Użyj pojedynczych sekcji barwników, aby precyzyjnie dostroić intensywność lasera dla każdego fluoroforu. Iteracyjnie przełączaj się z pojedynczych sekcji barwników z powrotem do sekcji ze wszystkimi markerami, aż sygnał każdego markera będzie widoczny bez przesycenia.
        UWAGA: Za każdym razem, gdy regulujesz intensywność lub wzmocnienie lasera, należy ponownie sprawdzić wcześniej zoptymalizowane slajdy z pojedynczym barwnikiem, aby upewnić się, że sygnał pozostaje optymalny. Aby uzyskać najbardziej optymalne rozdzielanie, poziomy intensywności sygnału powinny być jak najbardziej zbliżone między markerami, zwłaszcza między markerami, które się kolokalizują. Jeśli to możliwe, zaleca się użycie próbki replikowanej lub niepożądanego obszaru do optymalizacji ustawień mikroskopu przed wykonaniem obrazowania próbki eksperymentalnej. Jest to szczególnie ważne podczas barwienia DAPI (aby uniknąć ryzyka fotokonwersji) lub fluoroforami, które szybko wybielają (np. PE).
    5. Wykonaj kroki 7.1.8 - 7.1.14.

8. Usunięcie pokrywy (dotyczy tylko zamków, nie komorowego szkła pokrywowego)

  1. Zanurz zasuwkę w PBS i pozwól, by slip się odłączył. Nie próbuj zdejmować pokrywy pokrywowej, ponieważ może to odkształcić tkankę, powodując problemy z ustawieniem podczas kolejnych rund obrazowania lub całkowite odłączenie od szkiełka. Użyj pojemnika wystarczająco dużego, by zmieścić zjeżdżalnię i upewnić się, że można go całkowicie zanurzyć w PBS.

9. Wybielanie i cykliczność fluoroforu

  1. Tylko do szkła osłonowego komorowego: Aspiruj jak najwięcej materiału montażowego pipetą, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.
    UWAGA: Przechylenie komory na bok może ułatwić aspirację.
  2. Myj 3 razy z ~1 mL (komorowe szkło osłonowe) lub ~100 μL (szkiełki) PBS przez 2 minuty, aż materiał montażowy zostanie całkowicie usunięty.
  3. Przygotuj roztwór wybielający w okapu. Waż 10 mg LiBH4 bezpośrednio do suchej zlewki za pomocą mikrołopatki. Ostrożnie dodaj 10 ml ultraczystej wody bezpośrednio do zlewki zawierającej LiBH4 i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwór wybielający.
    UWAGA: Przygotować się bezpośrednio przed użyciem, aby uzyskać maksymalną reaktywność.
    UWAGA: LiBH4 jest bardzo łatwopalny, dlatego ten etap wymaga szczególnej ostrożności – upewnij się, że okap jest używany prawidłowo (np. szarda na odpowiedniej wysokości, odpowiednia ochrona itp.) i pracuj tylko z <10 mg LiBH4 naraz. Upewnij się, że zlewka jest całkowicie sucha przed dodaniem LiBH4 – niestosowanie tego może spowodować pożar.
  4. Dodaj ~100 μL roztworu wybielającego, używając szklanej pipety Pasteura, do każdej sekcji tkanki i inkubuj w temperaturze pokojowej w okapie przez 15 minut. Do szkiełek komorowych używaj 2 mL roztworu wybielającego.
  5. Jeśli wybielasz barwniki BV (np. BV421, BV510 itp.), ostrożnie przenieś dołek do mikroskopu epifluorescencyjnego. Wybierz filtr DAPI, wyostrz próbkę i rozświetl ją na pełną moc.
    1. Użyj obiektywu 5x, aby uzyskać większe pole oświetlenia. Obniż stopień jak najniżej, aby zapobiec uszkodzeniom celów i obudów.
  6. Roztwór LiBH4 wylej z studni za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodaj go z powrotem do zlewki roztworu LiBH4 .
    UWAGA: To teraz jest odpad LiBH4; Rozwiązanie nie może być przechowywane do przyszłego użytku.
  7. Przemyj szkiełka 3 razy buforem rozcieńczeniowym i inkubuj przez ~3 minuty. Całkowita objętość dla zamków komorowych wynosi 2 mL.
  8. Dodaj mieszankę przeciwciał i barw zgodnie z procedurą (kroki 6.3 - 6.8).
  9. Dodaj 2N H2SO4 krople do odpadów LiBH4 w okapu, regularnie mieszając.
    UWAGA: LiBH4 będzie się agresywnie rozwijać. Te pęcherzyki to gaz H2 uwalniany z LiBH4; H 2 jest bardzo łatwopalny, więc zachowaj szczególną ostrożność na tym etapie i dodawaj H2SO4 bardzo powoli.
  10. Wlej go do chłonnego podkładu, gdy roztwór przestanie się bąbelkować. Przepłucz zlewkę wodą ultraczystą i wlej ją do chłonnego podkładu.
    UWAGA: Włóż chłonną podkładkę do worka chemicznego/biohazardowego, zabezpiecz ją i wyrzuć zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zagrożeń chemicznych.

10. Przetwarzanie obrazu po akwizycji

  1. Otwórz obraz referencyjny (od kroku 7.1.14) w oprogramowaniu Zen, klikając Plik > Otwórz > Wybierz obraz referencyjny.
    UWAGA: Etapy przetwarzania obrazu po akwizycji mogą być alternatywnie wykonywane w programach open-source. (np. ImageJ).
  2. Dostosuj jasność i kontrast, aby zoptymalizować zakres dynamiczny, klikając Przetwarzanie > Intensywność > Kontrast Stretch > Auto > Zastosowaj.
  3. Zmień typ piksela na 32-bitowy, klikając Processing > Image > Convert Pixel Type > 32-bit (Float).
  4. Normalizuj obraz referencyjny, klikając Processing > Intensity > Normalize (Nasycone Pixels = 0%) > Apply.
  5. Wygładz obraz referencyjny, klikając Processing > Smooth > Gaussowski > wprowadź promień (np. 2-5 px) > Apply (Ilustracja uzupełniająca 1B).
    UWAGA: Optymalizuj promień rozmycia Gaussa, testując różne wartości. Aby znać właściwy podział wartości (kalkulator procesu > obrazu), surowy obraz referencyjny przez przetworzony obraz i obraz wynikły powinny mieć jednolitą intensywność (wszystkie piksele mają mniej więcej tę samą wartość).
  6. Otwórz obraz wielokafelkowy do korekty, klikając Plik > Otwórz > wybierz obraz wielokafelkowy.
  7. Stosuj korektę szycia i cieniowania, korzystając z przetworzonego odniesienia, klikając Processing > Stitching z następującymi parametrami.
    1. Sprawdź pole blend. Zaznacz odpowiednie pole cieniowania i z rozwijanego menu wybierz przetworzony obraz referencyjny (krok 10.5). Zachowaj wszystkie pozostałe parametry bez zmian.
      UWAGA: Parametry mogą wymagać strojenia, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
    2. W menu Input/Output wybierz obraz wielokafelkowy jako wejście i referencję cieniowania jako odniesienie.
    3. Naciśnij przycisk Zastosowanie na górze, a wygenerowany zostanie nowy obraz z poprawionym szyciem i cieniowaniem (Ilustracja uzupełniająca 1D).
      UWAGA: Korekta zszywania (Ilustracja uzupełniająca 1I-J) jest konieczna, aby zapewnić dokładność wyrównania obrazu w późniejszym etapie procesu.
    4. Zapisz poprawiony obraz, klikając Plik > Zapisz > Wybierz Folder.

11. Ustawienie obrazu

  1. Przekonwertuj przetworzone obrazy z dowolnego formatu (.czs, .tif itp.) do formatu Imaris za pomocą narzędzia Imaris File Converter.
    UWAGA: Narzędzie można pobrać i zainstalować zgodnie z instrukcjami na tej stronie (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. Uruchom narzędzie do rejestracji rozszerzeń Imaris, aby rejestrować (wyrównywać) obrazy ze wszystkich rund w jeden obraz ze wszystkimi kanałami.
    UWAGA: Aby zainstalować narzędzie i pomyślnie wyrównać obrazy, należy postępować zgodnie z instrukcjami na poniższej stronie internetowej (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Kliknij przycisk Imaris Extensions. Wybierz narzędzia SimpleITK > eksport ustawień kanału do CSV.
  4. Kliknij Przeglądaj, przejdź do obrazu .ims (z jednej z rund), wybierz go i kliknij Otwórz.
  5. Kliknij Eksport i wybierz lokalizację, aby zapisać plik CSV. Wpisz nazwę i kliknij Zapisz.
  6. Otwórz zapisany plik CSV i sprawdź, czy nazwy kanałów są poprawne. Edytuj, jeśli trzeba.
  7. Jeśli zostaną wprowadzone zmiany, przejdź do Imaris Extensions > narzędzi SimpleITK > Batch Configure Channel Settings.
    UWAGA: Ten krok nie jest potrzebny, jeśli w poprzednim kroku nie dokonano żadnych edycji.
  8. Kliknij Przeglądaj, przejdź do pliku CSV, wybierz go i kliknij Otwórz. Kliknij Następny, potem ponownie Przeglądaj , aby wybrać ten sam obraz .ims i kliknij Otwórz.
  9. Kliknij Konfiguruj, aby zastosować zmiany. Powtórz kroki 11.3-11.8 dla wszystkich obrazów z różnych rund.
  10. Gdy kanały zostaną poprawnie nazwane, przejdź do Imaris Extensions > SimpleITK Algorithms > Affine Registration of Z-stacks using a Common Channel.
  11. Kliknij Przeglądaj, przejdź do folderu zawierającego wszystkie rundy, wybierz wszystkie obrazy i kliknij Otwórz.
  12. Kliknij Dalej, wybierz kanał rejestracji (kanał fiducialny). Do tego protokołu użyto kanału DAPI. Następnie wybierz obraz stały.
    UWAGA: Wybierz kanał/marker, który pozostaje stały przez kolejne rundy i jest odporny na chemiczne lub fotobielenie (np. barwniki nuklearne, takie jak DAPI). Następnie wybierz obraz stały.
  13. Kliknij Zaawansowane ustawienia rejestracji, zaznacz wszystkie opcje oprócz Auto Mask i ustaw Gaussian smoothing sigma na 5.0.
  14. Kliknij Gotowe, a następnie Zarejestruj się, aby wykonać wyrównanie. Po zakończeniu rejestracji kliknij Ponowne próbowanie i Zapisz Połączony Obraz.
  15. Po ponownym próbkowaniu wybierz kanał fiducial i kliknij Oblicz korelację. Pliki wyjściowe obejmują wyrównany obraz output.ims, dwa pliki PDF pokazujące jakość wyrównania przed i po rejestracji, plik JSON zawierający ustawienia użyte do rejestracji oraz plik TXT z logiem całego procesu.

12. Wyrównanie obrazu

  1. Segmentuj komórki/obiekty za pomocą CellPose (v2.5)25
  2. Dla każdego zbioru danych z pojedynczym barwieniem wygeneruj jedną maskę segmentacyjną z własnego kanału detekcyjnego markera (Przykład: dla pojedynczego barwienia CD20 wygeneruj maskę z kanału detekcyjnego AF488 (kanał przeznaczony dla CD20)).
  3. Maskę segmentacji od kroku 2 należy zastosować do każdego kanału w tym samym zbiorze danych (w przykładzie CD20 maska pochodząca z AF488 jest stosowana do AF488 do pomiaru prawdziwego sygnału oraz do wszystkich innych kanałów detekcji do pomiaru przenikania).
  4. Ekstrakt intensywności i obszarów poszczególnych obiektów w Pythonie za pomocą scikit-image (regionprops_table) i NumPy.
  5. Stosunek sygnału do tła (SBR)
    1. Oblicz średnią intensywność obiektu dla wszystkich segmentowanych ROI w zamierzonym kanale detekcji markera.
    2. Zdefiniuj intensywność tła jako średnią intensywność wszystkich pikseli poza ROI w tym samym polu widzenia, z wyłączeniem wypłaszania o wartości zerowej lub pikseli poza granicami.
      Oblicz SBR jako:
      figure-protocol-1
    3. Wizualizuj rozkłady SBR za pomocą wykresów skrzypiec, pokazujących wartości dla obiektu jako punkty (lub wartości dla pola, jeśli wskazano).
  6. Kwantyfikacja przepuszczająca się
    1. Dla każdego kanału nieprzeznaczonego oblicz przebijanie (%) przy użyciu tych samych zwrotów z inwestycji z maski w kroku 12.2:
      figure-protocol-2
    2. UWAGA: wpisy diagonalne równają się 100%, ponieważ w zamierzonym kanale obrazu z pojedynczym barwieniem licznik i mianownik są identyczne (prawdziwy sygnał markera mierzony w swoim własnym kanale).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa podstawowe wyzwania związane z technikami obrazowania immunofluorescencyjnego to niespecyficzne wiązanie sond przeciwciał sprzężonych z fluoroforem oraz autofluorescencji tkankowej. Protokół ten został zaprojektowany, aby pomóc odróżnić prawdziwy sygnał od tła i zoptymalizować techniki multipleksowanej immunofluorescencji.

Blokowanie heparyny zmniejsza niespecyficzne wiązanie fluoroforów, jednocześnie zachowując sygn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektralny IBEX, adaptacja protokołu IBEX, skutecznie rozwiązuje dwa kluczowe problemy w obrazowaniu immunofluorescencji: wiązanie niespecyficzne oraz autofluorescencję. Traktowanie wysoce eozynofilnych tkanek heparyną oraz stosowanie spektralnego rozdzielania w celu wyeliminowania autofluorescencji i nakładania się spektralnego między kanałami znacząco zwiększyło wykrywanie prawdziwego sygnału powyżej tła. Przechwycenie wszystkich markerów w jednym przebiegu skraca czas pozyskiwania, co może zwiększyć tempo cyklowania I...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ otrzymują finansowanie od ALK Abello A/S. JFEK otrzymuje opłaty konsultacyjne od Merida Biosciences.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Andrei Radtke i dr Zivowi Yaniv za wsparcie podczas wdrażania i doskonalenia IBEX. Dziękujemy dr João Bronze de Firmino i dr Mouhanad Babi za wsparcie mikroskopii i rozwiązywanie problemów oraz Centrum Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej na McMaster za dostęp do ich mikroskopów. Dziękujemy Tinie Walker, Jianpingowi Wenowi i Ranganowi Talpe Guruge za wsparcie techniczne. Prace te są wspierane przez recenzowany grant badawczy na temat alergii pokarmowych, finansowany wspólnie przez CIHR Institute of Infection and Immunity (CIHR-III), CIHR Institute of Circulatory and Respiratory Health (CIHR-ICRH) oraz Canadian Allergy Asthma and Immunology Foundation (CAAIF). Prace te zostały sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research (PJT-198169; JFEK), GRANT BADAWCZY J.P. Bickell Foundation (JFEK), Kanadyjska Fundacja Astmy i Immunologii (JFEK, MJ), Kanadyjskie Towarzystwo Alergii i Immunologii Klinicznej (VO, MJ), Fundacja Schroeder (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Family (SW, MJ), Buckrell Family (JFEK), Ontario Graduate Scholarship (SD) oraz program licencjacki z nauk o zdrowiu na Uniwersytecie McMaster (VO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór kwasu siarkowego 2N (H2SO4)Nie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Zlewka 500 mLNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Płyta 6-dołkowaNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Bcl-6 - Alexa Fluor 647BD Biosciences561525Współczynnik rozcieńczenia 1:100
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554722
Mikroskop do dyssekcii stołowejNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biosciences561352Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Współczynnik rozcieńczania 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD23 - PEBioLegend338507Współczynnik rozcieńczania 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Współczynnik rozcieńczenia 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Klej chromowo-żelatynowyDostawa dla nowicjuszy1033A
CryomoldFisher Scientific  NC9511236Również numer katalogowy 50-465-347 dla większych próbek
Suwak kalibracyjny DAPIAgar ScientificAG2273
Roztwór DAPI, 1 mg/mLThermoFisher Scientific62248Współczynnik rozcieńczenia 1:3000
E-kadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Współczynnik rozcieńczenia 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Rury Eppendorf/FalconNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
KleszczeNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Szkiełka mikroskopowe z matowym końcemChemScienceGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Sól sodowa heparynySIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PEWspółczynnik rozcieńczania 1:200
Human TruStain FcX (Roztwór blokujący receptory Fc)BioLegend422302Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Komora wilgotnościNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Wiadro na lód z pokrywkąNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Współczynnik rozcieńczenia 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Współczynnik rozcieńczania 1:200
Konwerter plików ImarisInstrumenty OXFORDNie maPokrywanie dowolnego formatu pliku obrazu do formatu .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Izopentan (2-metylobutan)Nie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD Biosciences558616Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne Wycieraczki Zadaniowe, 1-PNauka Kimtech06-666
Duże (czyli 25 cm długości) kleszczeNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Ciekły azotNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Borowodnikiem litu (LiBH4)SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Invitrogen53603680Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Szkło szkła szkła szkiełka mikroskopowego nr 1 22x50 mmFisher Scientific  12-542A
Woda Milli-QNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Współczynnik rozcieńczenia 1:100
Nunc Lab-Tek Komora Pokrywa OsłonowaThermoFisher Scientific155380
Długopis PAPabcamAB2601
Roztwór soli fosforanowej z buforem fizjologicznym (PBS)Nie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
SkalpelNie maNie maCokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium
Rozszerzenia SimpleITK ImarisNie maNie maOprogramowanie używane do wyrównywania obrazów z różnych rund (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
SacharozaSIGMA-ALDRICHS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek USA4583
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980Mikroskopia ZEISSNie maSystem obrazowania użyty w tym badaniu
Zen BlueMikroskopia ZEISSNie maOprogramowanie używane do przetwarzania obrazu po akwizycji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics. Proteomics. 18 (18), (2018).
  3. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genet. 10 (1), (2014).
  4. de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies. Front Oncol. , 10(2020).
  5. van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment. Cancers. 14 (13), (2022).
  6. Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. The dawn of spatial omics. Science. 381 (6657), (2023).
  7. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Gen Med. 14 (1), (2022).
  8. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), (2016).
  9. Pascal, L. E., et al. Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate. BMC Genom. 9, (2008).
  10. Patel, S. S., Rodig, S. J. Overview of Tissue Imaging Methods. Methods Mol Biol. 2055, (2020).
  11. Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. Protein expression analyses at the single cell level. Molecules. 19 (9), (2014).
  12. Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. , 1075(2014).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), (2022).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).
  15. Kothurkar, A. A., et al. ’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types. J Cell Sci. 137 (23), (2024).
  16. Cohn, D. E., et al. Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging. Front Immunol. 14, (2023).
  17. Radtke, A. J., et al. IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues. arXiv. , (2021).
  18. Radtke, A. J., et al. The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  19. Croce, A. C. Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms. Photochem. 1 (2), (2021).
  20. Wizenty, J., et al. Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading. J Immunol Methods. 456, (2018).
  21. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).
  22. Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ. Genes. 12 (5), (2021).
  23. Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual. , NSCC. (2022).
  24. Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique (2023).
  25. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), (2021).
  26. Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence. J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).
  27. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).
  28. Vlaminck, S., et al. The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study. Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).
  29. Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), (2017).
  30. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).
  31. Valnes, K., Brandtzaeg, P. Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies. J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).
  32. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).
  33. Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte. Respiratory Res. , 12(2011).
  34. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cyt Part A. 89 (6), (2016).
  35. Saitou, T., et al. Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation. Front Med. 5 (DEC), (2018).
  36. Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge. Biophys Rev. 14 (2), (2022).
  37. Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging. J Microscopy. 234 (2), (2009).
  38. Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging. Nat Comm. 13 (1), (2022).
  39. Chang, Q., et al. Imaging Mass Cytometry. Cyt Part A. 91 (2), (2017).
  40. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med. 20 (4), (2014).
  41. Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies. Front Immunol. 10, (2019).
  42. Goltsev, Y., Nolan, G. CODEX multiplexed tissue imaging. Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).
  43. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), (2021).
  44. Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. Development of Spectral Imaging Cytometry. Methods Mol Biol. 2635, (2023).
  45. Hernandez, S., et al. Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues. Front Mol Biosci. 8, (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iterative BleachingSpectral UnmixingHeparin BlockingTissue AutofluorescenceMultiplexed ImmunolabelingSignal To BackgroundHuman Nasal PolypSpatial Proteomics

Powiązane artykuły