Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Podsumowanie

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Streszczenie

Łagodna hipertermia (42-48 °C) jest dobrze znaną metodą terapeutyczną, która może indukować kontrolowaną śmierć komórek nowotworowych i stymulować przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Jednak precyzyjne dostarczanie ciepła do tkanki nowotworowej przy jednoczesnym oszczędzaniu otaczającej zdrowej tkanki pozostaje poważnym wyzwaniem. Tradycyjne metody hipertermii, takie jak izolowana perfuzja kończyn, wymagają złożonych, inwazyjnych procedur i niosą ze sobą znaczne ryzyko miejscowej toksyczności i zachorowalności pacjenta. Natomiast terapia fototermiczna wykorzystująca nanocząstki złota aktywowane światłem bliskiej podczerwieni (NIR) okazała się obiecującą, mniej inwazyjną strategią osiągania miejscowej hipertermii. W szczególności złote nanopręty (GNR) wykazują przestrajalne właściwości optyczne i wysoką wydajność konwersji fototermicznej, co czyni je idealnymi kandydatami do precyzyjnej modulacji termicznej miejsc nowotworu. Chociaż technika ta okazała się bardzo obiecująca, szczególnie w przypadku powierzchownych i dostępnych nowotworów, powtarzalne dostarczanie, ograniczenie przestrzenne i bezpieczeństwo pozostają aktywnymi obszarami udoskonalenia. W tym protokole przedstawiamy naszą zwalidowaną i zoptymalizowaną metodę osiągania zlokalizowanej, łagodnej hipertermii za pomocą donowotworowego wstrzyknięcia biokompatybilnych GNR, a następnie krótkotrwałej, ukierunkowanej ekspozycji na laser NIR. Takie podejście umożliwia szybkie, kontrolowane ogrzewanie w zakresie terapeutycznym, promując immunogenną śmierć komórek nowotworowych i stymulując wrodzoną odpowiedź immunologiczną, mechanizmy szczególnie istotne w przypadku immunologicznie "zimnych" nowotworów. Monitorowanie temperatury w czasie rzeczywistym i lokalne dostarczanie zapewniają powtarzalność, bezpieczeństwo i minimalne narażenie systemowe. Ten uproszczony protokół stanowi solidną i dostępną platformę dla badań przedklinicznych, wspierając szersze wysiłki na rzecz wykorzystania łagodnej hipertermii w immunoterapii nowotworów.

Wprowadzenie

Nadal istnieją poważne wyzwania związane z leczeniem nowotworów, w tym oporność na leki, unikanie odpowiedzi immunologicznej i toksyczność poza celem, z których wszystkie podważają długoterminowy sukces konwencjonalnych terapii. Ograniczenia te doprowadziły do opracowania uzupełniających strategii terapeutycznych mających na celu przezwyciężenie mechanizmów oporności przy jednoczesnej minimalizacji ubocznych uszkodzeń zdrowych tkanek. Łagodna hipertermia, definiowana jako podniesienie temperatury tkanek do 42-48 °C, od dawna uznawana jest za skuteczne uzupełnienie standardowych terapii przeciwnowotworowych¹. Historycznie rzecz biorąc, łagodna hipertermia była stosowana w połączeniu z chirurgią, chemioterapią lub radioterapią w celu zwiększenia skuteczności tych terapii poprzez zwiększenie perfuzji guza, zakłócenie architektury zrębu i uwrażliwienie komórek nowotworowych na czynniki cytotoksyczne¹. Ostatnio, wraz z rosnącym sukcesem immunoterapii w onkologii, rośnie zainteresowanie wykorzystaniem wrodzonego potencjału immunomodulacyjnego łagodnej hipertermii w celu poprawy przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej ^1,2,3.

Pomimo wykazanych korzyści klinicznych, szersze zastosowanie hipertermii nowotworowej pozostaje ograniczone ze względu na wyzwania związane z uzyskaniem zlokalizowanego, kontrolowanego i powtarzalnego ogrzewania guzów przy jednoczesnym unikaniu uszkodzenia tkanek poza celem⁴. Obecne kliniczne i eksperymentalne techniki hipertermii, takie jak regionalna perfuzja kończyn lub podejścia oparte na nanocząstkach dostarczane systemowo, często charakteryzują się ograniczoną precyzją przestrzenną, zmiennym wychwytem guza i potencjalną toksycznością ogólnoustrojową 2,5,6,7,8,9 . Celowana terapia hipertermiczna jest nową metodą w tej dziedzinie leczenia raka, zaprojektowaną w celu selektywnego podnoszenia temperatury guza przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń otaczających zdrowych tkanek. Mówiąc dokładniej, celowane dostarczanie nanoprętów złota (GNR) jest obiecującą metodą przezwyciężania obecnych ograniczeń związanych z precyzją i toksycznością łagodnej hipertermii guza. GNR szczególnie dobrze nadają się do zastosowań fototermicznych ze względu na ich przestrajalny powierzchniowy rezonans plazmonowy w obszarze NIR, wysoką wydajność konwersji fototermicznej i korzystne profile biodystrybucji w porównaniu z innymi nanostrukturami złota^10,11. Ich reakcja na fale NIR umożliwia wydajną absorpcję światła i miejscowe ogrzewanie nawet w głębszych tkankach, przy minimalnym uszkodzeniu otaczających struktur. W związku z tym GNR mogą zapewnić lepszą skuteczność, celowanie i bezpieczeństwo w terapiach hipertermicznych.

Celem tej metody jest zapewnienie wysoce wydajnego, mało zasobochłonnego i powtarzalnego protokołu do osiągnięcia łagodnej hipertermii za pośrednictwem nanoprętów złota w guzach litych. Technika ta, określana jako celowana terapia hipertermiczna (THT) za pośrednictwem GNR, rozwiązuje kluczowe ograniczenia konwencjonalnych metod hipertermii, łącząc bezpośrednie wstrzyknięcie GNR do guza z zewnętrzną aktywacją światła NIR. Zapewnia to wysokie lokalne stężenie nanocząstek, poprawiając odtwarzalność i bezpieczeństwo, szczególnie w przypadku małych lub słabo unaczynionych guzów, które mogą nie akumulować skutecznie czynników dostarczanych ogólnoustrojowo. Dodatkowo, zastosowanie bezpośredniego wstrzyknięcia GNR do guza, a następnie ekspozycji na światło bliskiej podczerwieni (NIR) zapewnia precyzyjne, kontrolowane i miejscowe ogrzewanie guzów, jednocześnie minimalizując ekspozycję ogólnoustrojową, toksyczność i efekty poza celem związane z konwencjonalnymi technikami hipertermii regionalnej.

Wiele nowotworów wykazuje złożone i zróżnicowane mechanizmy ucieczki immunologicznej, co pozwala im opierać się immunoterapii na różne sposoby, najbardziej ewidentnie poprzez słabą infiltrację komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza ^2,4,5. Łagodna hipertermia stanowi synergiczne rozwiązanie, gdy jest stosowana w połączeniu z immunoterapiami. Oprócz bezpośrednich efektów cytotoksycznych, łagodna hipertermia preferencyjnie indukuje immunogenną śmierć komórki (ICD), prowadząc do uwalniania antygenów związanych z nowotworem (TAA) i wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMPs)^1,2. Sygnały te aktywują wrodzone szlaki odpornościowe, poprawiają prezentację antygenu nowotworowego, promują dojrzewanie komórek dendrytycznych i zwiększają pobudzanie limfocytów T, ostatecznie zwiększając infiltrację komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza ^1,6,12. W naszych własnych modelach przedklinicznych ta technika THT za pośrednictwem GNR działała w celu aktywacji lokalnych odpowiedzi immunologicznych i wzmocnienia infiltracji immunologicznej guza¹³. W połączeniu z terapią interleukiną-2 (IL-2) wewnątrz guza lub ogólnoustrojowym hamowaniem punktów kontrolnych anty-PD1, ta technika THT za pośrednictwem GNR dodatkowo zwiększyła odporność przeciwnowotworową i przewyższyła samą monoterapię w modelach raka piersi i czerniaka¹³. Wyniki te są zgodne z rosnącą liczbą dowodów potwierdzających synergię między hipertermią za pośrednictwem nanocząstek a immunoterapią w guzach litych, w tym raku piersi ^14,15,16 i guzach mózgu ^17,18. Krótko mówiąc, przekształcając immunologicznie "zimne" guzy w "gorące", THT za pośrednictwem GNR może poprawić odpowiedź na immunoterapie, w tym inhibitory punktów kontrolnych ^1,2,12.

Przedstawiony tutaj protokół THT za pośrednictwem GNR jest mało zasobożerny, technicznie prosty i można go szeroko dostosować do guzów podskórnych lub powierzchownych. Technika ta jest szczególnie odpowiednia dla badaczy pracujących z mysimi modelami guzów podskórnych lub powierzchownych, w tym czerniaka i raka piersi. Jednak przy niewielkich modyfikacjach można go rozszerzyć na inne typy nowotworów i miejsca anatomiczne. Ponadto technika ta oferuje wszechstronną platformę do integracji hipertermii kontrolowanej przestrzennie z przedklinicznymi badaniami nad rakiem, szczególnie tymi, które badają strategie wzmacniające immunoterapię i mają na celu zbadanie łagodnej hipertermii w celu poprawy odpowiedzi na leczenie lub przezwyciężenia oporności na immunoterapię. Co więcej, wiedza i sprzęt niezbędne do wdrożenia tej techniki są dostępne i można je dostosować do różnych środowisk opieki zdrowotnej, co zwiększa jej wykonalność w szerszym zastosowaniu klinicznym³.

W tym manuskrypcie podajemy szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące implementacji naszego protokołu THT za pośrednictwem GNR w modelach mysich przy użyciu systemu laserowego NIR działającego przy długości fali 860 nm. Powodzenie tego protokołu zależy od skutecznej aktywacji głębokich tkanek złotych nanoprętów przy użyciu odpowiedniej długości fali światła bliskiej podczerwieni. Zwracamy również uwagę na względy proceduralne dotyczące osiągnięcia spójnego, bezpiecznego i skutecznego dawkowania łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów, takie jak dokładne monitorowanie wewnętrznej temperatury guza w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania procedury. Metoda ta opiera się na wcześniej opisanych podejściach do hipertermii nanocząstek i łączy je w sobie, oferując kompleksową, zwalidowaną, wysoce precyzyjną i powtarzalną alternatywę dla przedklinicznych badań nad rakiem. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten oferuje biologicznie bezpieczną, opłacalną i mało toksyczną metodę dostarczania hipertermii zlokalizowanej w guzie, z dużym potencjałem zwiększenia skuteczności istniejących immunoterapii nowotworów i poszerzenia klinicznej użyteczności hipertermii w onkologii.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Dalhousie zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council on Animal Care). Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów .

1. Wymagania dotyczące lasera i zakładu obróbki

1. Bezpieczny dostęp do w pełni skalibrowanego systemu laserowego zdolnego do dostarczania światła o długości fali 860 ± 10 nm o natężeniu do 4 000 mA. Upewnij się, że system laserowy ma odpowiednie mechanizmy wyłączania.
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystaliśmy specjalnie zaprojektowany laser. Model używany w tym protokole ma laserowy klucz aktywacyjny, przycisk zatrzymania awaryjnego i zworkę blokady (podłączona zworka może być również podłączona do wyłącznika bezpieczeństwa, który służy do zapewnienia zgodności z bezpieczeństwem, np. dostępu do drzwi do pomieszczenia laserowego klasy 4).
2. Podłącz wsuwaną, skalibrowaną sondę temperatury do monitorowania temperatury wewnątrznowotworowej, która może przesyłać dane o temperaturze na żywo za pośrednictwem odpowiedniego oprogramowania do rejestrowania termopar.
3. Przygotuj wyznaczone pomieszczenie laserowe, które spełnia wymagane normy bezpieczeństwa dla klasy lasera. Upewnij się, że miejsce pracy jest wolne od przeszkód, z dobrą wentylacją, odpowiednim oświetleniem i zakrytymi wszystkimi powierzchniami odbijającymi światło. Ogranicz dostęp do pomieszczenia podczas pracy lasera, aby zapobiec niezamierzonemu narażeniu. Upewnij się, że cały personel zaangażowany w badanie jest w pełni przeszkolony w zakresie obsługi lasera i protokołów bezpieczeństwa oraz nosi odpowiednie środki ochrony osobistej i oczy.
4. Stwórz przestrzeń roboczą w pomieszczeniu laserowym, w której znajduje się urządzenie anestezjologiczne w bliskiej odległości od konfiguracji laserowej. Upewnij się, że laser jest bezpiecznie zamontowany, ale regulowany, a obiekt eksperymentalny można ustawić w odległości około 1-2 cm od źródła wiązki laserowej, aby zapewnić dokładne celowanie w miejsce guza.
5. Użyj kamery termowizyjnej umieszczonej na statywie, ustawionej tak, aby rejestrować odczyty temperatury z powierzchni obiektu podczas ekspozycji laserowej.

2. Hodowla komórkowa i inokulacja (wstrzyknięcie komórek nowotworowych)

1. Wybierz odpowiednie modele myszy w oparciu o rodzaj nowotworu, który Cię interesuje, zgodnie ze standardowymi technikami przygotowania i utrzymania laboratoryjnych hodowli komórkowych. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, wybierz 6-8-tygodniowe samice myszy BALB/c do inokulacji guza CT26.
   UWAGA: W zależności od wymagań badania można użyć myszy immunokompetentnych lub z obniżoną odpornością w różnym wieku i ze szczepami.
2. Hodowla linii komórek rakowych CT26 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO_{2 .} Odnawiaj pożywkę co 2-3 dni i subkulturuj komórki przy zbiegu 70-80%, stosując stosunek podziału 1:4 do 1:10. Używaj komórek we wczesnych pasażach (np. ≤10 pasażach), aby zapewnić stały wzrost i wydajność inokulacji. W razie potrzeby należy rozszerzyć hodowle, aby uzyskać wymaganą liczbę komórek do inokulacji.
   UWAGA: Liczba komórek potrzebnych na mysz będzie się różnić w zależności od modelu, na przykład w przypadku modelu mysiego raka jelita grubego CT26 wymagaliśmy od 5 × 10⁵ komórek na mysz.
3. Odłącz przylegające komórki za pomocą trypsynizacji i przemyj 2x sterylnym 1x PBS. Zawiesić w sterylnym roztworze 1x PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie 5 × 10⁶ komórek/ml. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml na lodzie maksymalnie 1 godzinę przed wstrzyknięciem.
4. Przed wstrzyknięciem należy znieczulić myszy za pomocą komory indukcyjnej z 4% odparowanym izofluranem o natężeniu przepływu 0,8 l/min. Po znieczuleniu zmniejsz izofluran do 2% i utrzymuj znieczulenie stożkiem nosowym podczas procedury inokulacji. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że nie ma reakcji bólowej. Nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować potencjalne uszkodzenia lasera.
5. Ogolić miejsce wstrzyknięcia (np. lewy bok w przypadku tego heterotopowego modelu CT26) za pomocą golarki elektrycznej i oczyść obszar chusteczką nasączoną alkoholem, aby usunąć zanieczyszczenia i zdezynfekować skórę. Uszczypnąć skórę w miejscu wstrzyknięcia i wstrzyknąć podskórnie 100 μl zawiesiny komórek w ilości 5 × 10⁶ komórek/ml za pomocą igły 26 G i strzykawki o pojemności 1 ml. Po wstrzyknięciu należy wyjąć mysz ze stożka nosowego i umieścić ją z powrotem w klatce w celu odzyskania na kocu rozgrzewającym przez 1 godzinę.

3. Wzrost i pomiar guza

1. Rozpocznij codzienne pomiary guza, zwykle zaczynając od 7 dnia po wstrzyknięciu, za pomocą suwmiarki do pomiaru guza. Zmierz wymiary guza w trzech osiach: szerokość, długość i wysokość oraz oblicz objętość guza za pomocą wzoru na elipsoidalną objętość guza π/6 ×długości × szerokości × wysokości.
2. Zaplanuj rozpoczęcie THT za pośrednictwem GNR, gdy guzy osiągną przybliżoną objętość 50 mm³ (± 20 mm³).
   UWAGA: W przypadku naszego modelu CT26 ta objętość guza została osiągnięta między 10 a 12 dniem po wstrzyknięciu komórek nowotworowych).
3. Przed leczeniem laserowym należy zapewnić losowy przydział myszy do grup kontrolnych i leczonych. Grupa leczona otrzyma wstrzyknięcie do guza GNR, a następnie ekspozycję laserową; a grupa kontrolna otrzyma doguzowe wstrzyknięcie PBS (taka sama objętość jak wstrzyknięcie GNR) zamiast GNR, a następnie ekspozycję laserową.

4. Konwersja fototermiczna światła NIR za pomocą wewnątrznowotworowych GNR

1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj strzykawki o pojemności 0,3-1 ml z igłą 31 G, aby pobrać odpowiednią objętość GNR w oparciu o objętość każdego guza.
2. Znieczulić mysz w taki sam sposób, jak w przypadku wstrzyknięcia komórek rakowych (stożkiem nosowym dostarczającym 2% izofluranu z szybkością przepływu 0,8 l/min i potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania palca).
3. Po znieczuleniu zmniejsz izofluran do 2% i umieść mysz w pozycji leżącej na platformie laserowej, utrzymując znieczulenie za pomocą stożka nosowego. Nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować potencjalne uszkodzenia lasera.
4. W razie potrzeby należy ogolić nadmiar sierści wokół guza, aby zapewnić ekspozycję powierzchni skóry na działanie lasera. Użyj etanolu do dezynfekcji powierzchni guza, wycierając wszelkie futro/zanieczyszczenia.
   UWAGA: W tym badaniu użyliśmy GNR zoptymalizowanych pod kątem absorpcji przy 860 nm. Jeśli używasz innego produktu GNR niż sugerowany tutaj, upewnij się, że dostarczanie długości fali lasera NIR jest zoptymalizowane zgodnie z widmem absorpcyjnym GNR.
5. Przed ekspozycją na laser należy wstrzyknąć domięśniowo GNR w stężeniu 1 μg/^mm3 objętości guza. W razie potrzeby należy podzielić wstrzyknięcie między dwa miejsca wewnątrznowotworowe, aby zapewnić efektywną dystrybucję GNR wewnątrz guza.
   UWAGA: W tym filmie z protokołem użyto GNR w stężeniu 2 μg/μL; dlatego w przypadku guza o wielkości 50^mm3 wstrzyknięto do guza 25 μl GNR. Należy pamiętać, aby po odpowiednich wstrzyknięciach zetrzeć nadmiar GNR-ów z powierzchni skóry.
6. W przypadku myszy z grupy kontrolnej należy podać doguzowe wstrzyknięcie sterylnego PBS o równoważnej objętości stosowanej w grupie iniekcyjnej GNR (np. wstrzyknąć 25 μl PBS w przypadku guza o średnicy 50^mm3).
7. Zdezynfekuj wewnątrzguzową sondę temperatury etanolem i delikatnie włóż ją do środka masy guza.
8. Nałóż jednolitą warstwę żelu Aloe Vera o grubości około 5 mm na powierzchnię guza, aby zapobiec owrzodzeniu skóry i zminimalizować ryzyko obrażeń termicznych podczas zabiegu.
9. Upewnij się, że laser jest ustawiony tak, aby ustawił się bezpośrednio nad środkiem guza. Skorzystaj z tabeli przeglądowej natężenia promieniowania (Tabela 1), aby określić odpowiednią wysokość lasera w oparciu o wymaganą średnicę wiązki laserowej do pokrycia powierzchni guza. Zoptymalizuj wysokość lasera w oparciu o średnicę guza, aby zapewnić stałe dostarczanie energii.
   UWAGA: W naszym eksperymencie guz o średnicy 1,3 cm wymagał lasera o wysokości 1,5 cm).
10. Włącz źródło chłodzenia laserowego i termosowego (TEC), a następnie podłącz system laserowy do źródła zasilania (dostosowanego zgodnie z protokołem producenta). Włącz elektryczne źródło chłodzenia termosu; poczekaj, aż zaświeci się niebieska dioda LED, a temperatura źródła TEC lasera ustabilizuje się na poziomie 25 °C po 30 sekundach.
11. Skorzystaj z tabeli wyszukiwania natężenia promieniowania (Tabela 1), aby uzyskać docelowe natężenie promieniowania 1 W/cm² ± 0.2 W/cm² poprzez regulację prądu wyjściowego lasera (przekręć pokrętło źródła lasera na żądaną nastawę prądu).
    UWAGA: W naszym eksperymencie wysokość lasera 1,5 cm, średnica wiązki 1,3 cm i prąd lasera 1,800 mA dały wartość natężenia promieniowania 0,82 W/cm², która została zoptymalizowana dla tego modelu guza.
    Od tego momentu upewnij się, że wszystkie osoby w sali operacyjnej lasera noszą certyfikowane laserowe okulary ochronne dla używanej długości fali światła.
12. Ustaw kamerę termowizyjną przylegającą do platformy laserowej, skierowaną na mysz, aby monitorować temperaturę powierzchni skóry podczas zabiegu laserowego.
13. W oprogramowaniu do nagrywania termopar utwórz nowy file i kliknij przycisk nagrywania . Upewnij się, że wykres wewnętrznej temperatury guza w funkcji czasu jest wyświetlany w czasie rzeczywistym.
14. Przekręć klucz bezpieczeństwa, aby włączyć wyjście źródła laserowego. Rozpocznij podawanie lasera, naciskając pedał nożny.
    UWAGA: W tym protokole kontroler Raspberry Pi jest wewnętrznym interfejsem między pedałem nożnym a źródłem lasera.
15. Sprawdź i upewnij się, że oprogramowanie komputerowe wykrywa wzrost temperatury guza, gdy guz wstrzyknięty przez GNR jest wystawiony na działanie wiązki laserowej.
    UWAGA: Wewnętrzna temperatura guza zacznie rosnąć w momencie uruchomienia lasera, potrzebując około 15 s do 2 minut, aby wejść w docelowy zakres hipertermii 42 °C, w zależności od wielkości i rodzaju modelu guza.
16. Utrzymuj wewnętrzną temperaturę guza w zakresie hipertermicznym (od 42 °C do 48 °C) przez pełne 5 minut. Stale monitoruj wewnętrzną temperaturę guza, a jeśli zbliży się do 48 °C, zdejmij nogę z pedału i pozwól, aby temperatura ponownie spadła. Poszukaj tego spadku temperatury w czasie rzeczywistym na wykresie wyświetlania temperatury w funkcji czasu. Gdy wewnętrzna temperatura guza spadnie do ~43 °C, ponownie włącz podawanie lasera, ponownie naciskając pedał. Kontynuuj ten wzorzec włączania/wyłączania pedału laserowego, aby utrzymać wewnętrzną temperaturę guza w odpowiednim zakresie hipertermicznym przez pełne 5 minut i monitoruj wykres wyświetlania temperatury w funkcji czasu.
    1. Jeśli temperatura guza spadnie poniżej 42 °C w dowolnym momencie podczas 5-minutowego okresu hipertermii, wydłuż czas hipertermii, aby nadrobić stracony czas. Na przykład, jeśli temperatura spadnie poniżej 42 °C przez 20 s, dodaj 20 s do końca początkowego czasu 5 minut. Niektóre nowotwory, którym wstrzykuje się GNR, mogą nie osiągnąć 48 °C, a laserowe włączanie/wyłączanie nie będzie konieczne.
       UWAGA: U myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto doguzowo PBS, guzy nie osiągną zakresu hipertermicznego. W razie potrzeby włączanie/wyłączanie lasera u myszy kontrolnych powinno przebiegać zgodnie z tym samym wzorcem, który ustalono dla grupy leczonej GNR, pomimo spodziewanego braku odpowiedzi hipertermicznej.
17. Przez cały okres utrzymywania hipertermii guza należy stale monitorować temperaturę powierzchni skóry, aby upewnić się, że utrzymuje się poniżej 50 °C. Niezależnie od wewnętrznej temperatury guza, jeśli temperatura powierzchni skóry osiągnie 50 °C, wyłącz laser, aby umożliwić ochłodzenie. Jeśli temperatura wewnętrzna nie może osiągnąć pożądanego zakresu hipertermicznego bez spowodowania przekroczenia temperatury skóry 50 °C, zmniejsz moc lasera i/lub nałóż dodatkowy aloes na miejsce guza, aby pomóc w rozproszeniu ciepła. Po 5 minutach w zakresie hipertermicznym zwolnij pedał nożny, aby zatrzymać podawanie lasera i pozwól, aby wewnętrzna temperatura guza spadła do ~37 °C i wyłącz laserowy kluczyk bezpieczeństwa.
    UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować uszkodzenia skóry, które mogą prowadzić do owrzodzenia guza, utrzymując temperaturę skóry poniżej 50 °C¹⁹.
18. Monitoruj wewnętrzną sondę temperatury guza, pozwalając, aby temperatura guza spadła z powrotem do około 37 °C. Delikatnie wyjmij sondę temperatury z guza i zetrzyj pozostały żel aloesowy z powierzchni guza.
19. Wyjmij mysz ze środka znieczulającego stożek nosowy i monitoruj pobudzenie zwierzęcia przed powrotem do klatki. Umieść klatkę częściowo na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C w okresie rekonwalescencji po zabiegu, umożliwiając myszom przemieszczanie się między cieplejszymi i chłodniejszymi obszarami w zależności od potrzeb w celu regulacji temperatury ciała. Monitoruj każdą mysz, aby zapewnić powrót do normalnego zachowania przed powrotem do jej obiektu mieszkalnego.

Wyniki

Celem tego protokołu THT za pośrednictwem GNR jest konsekwentne i niezawodne podgrzewanie guzów litych do pożądanego łagodnego zakresu hipertermicznego 42-48 °C. Główne etapy tej procedury przedstawiono na rysunku 1. Sukces tego protokołu zależy od ustalenia i utrzymania kontrolowanej i powtarzalnej łagodnej hipertermii w danym modelu guza litego. Zastosowane GNR zsyntetyzowano przy użyciu opatentowanej metody wolnej od CTAB, w której sól złota została zredukowana w zastrzeżonym roztworze środka powierzchniowo czynnego w celu pobudzenia wzrostu kryształów w kształcie pręcików. Po syntezie rodzime środki powierzchniowo czynne zostały w dużej mierze zastąpione PEG o niskiej masie cząsteczkowej w celu zwiększenia biokompatybilności. Uzyskane GNR miały jednolitą wielkość (51,1 ± 10,8 nm na 12,2 ± 1,9 nm), miały optymalną długość fali wzbudzenia 860 ± 10 nm i były wolne od wykrywalnych endotoksyn.

Aby zapewnić prawidłowe ogrzewanie guza i dokładne śledzenie temperatury, do środka guza należy wprowadzić sondę temperatury wewnątrznowotworowej. Dodatkowo kluczowe znaczenie ma monitorowanie temperatury powierzchni skóry przez cały czas trwania zabiegu za pomocą kamery termowizyjnej. Możliwe jest, szczególnie w przypadku guzów o mniejszej objętości, że GNR wstrzyknięte domięśniowo mogą dyfundować do przestrzeni okołonowotworowej i / lub podskórnej wokół guza. Wystawienie na działanie światła NIR może spowodować podgrzanie skóry powyżej podstawowego poziomu fizjologicznego, a jeśli skóra osiągnie temperaturę powyżej łagodnego poziomu hipertermicznego (powyżej 50 °C), może to prowadzić do uszkodzenia skóry, takiego jak strupy i/lub owrzodzenia¹⁹. Nałożenie warstwy żelu Aloe Vera na powierzchnię guza jest ważnym krokiem zapobiegawczym, który pomaga regulować temperaturę powierzchni skóry i zapobiegać uszkodzeniom termicznym podczas ekspozycji na laser NIR. W każdym przypadku zaleca się monitorowanie leczonego obszaru pod kątem oznak owrzodzenia przez 48 godzin po THT. Rysunek 2 przedstawia wizualną reprezentację sugerowanej konfiguracji w celu optymalizacji zarządzania temperaturą guza, pokazując położenie wewnętrznej sondy temperatury guza i warstwy żelu Aloe Vera w stosunku do sondy laserowej NIR.

Względny sukces tego eksperymentalnego protokołu można określić na podstawie obserwacji wykresu wewnętrznej temperatury guza w funkcji czasu podczas pracy lasera. W przypadku myszy, którym wstrzyknięto doguzowo GNR, oczekuje się, że guzy nagrzą się do łagodnego zakresu hipertermicznego (42-48 °C) w ciągu 15 s do 2 minut. Gdy wewnętrzna temperatura guza wejdzie w łagodny zakres hipertermii, oczekuje się, że albo ustabilizuje się w odpowiednim zakresie, albo będzie wymagała cyklu włączania/wyłączania podawania lasera, aby upewnić się, że wewnętrzna temperatura guza nie wzrośnie powyżej 48 °C (jak pokazano na rysunku 3A). Pomyślne utrzymanie łagodnej hipertermii przez 5 minut uważa się za wynik pozytywny. W przypadku myszy, którym wstrzyknięto PBS do wnętrza nowotworu, nie oczekuje się, że guzy nagrzą się do zakresu hipertermicznego. Ekspozycja na światło NIR o długości fali 860 nm sama w sobie nie wystarczy, aby spowodować podgrzanie tkanek do łagodnego zakresu hipertermicznego i oczekuje się, że guzy kontrolne ustabilizują się w okolicach 39-40 °C. Rycina 3B przedstawia wykres wewnętrznej temperatury guza w funkcji czasu między GNR a myszami kontrolnymi (wstrzykniętymi PBS) przez cały 5-minutowy zabieg. Jeśli guz wstrzyknięty przez GNR nie jest w stanie osiągnąć zakresu hipertermicznego po wystawieniu na działanie światła NIR lub nie jest w stanie utrzymać go w odpowiednim zakresie hipertermicznym przez pełne 5 minut, uważa się to za wynik negatywny.

Dodatkowa dalsza analiza w celu określenia powodzenia tego protokołu THT za pośrednictwem GNR obejmuje pomiar zmian objętości guza po zabiegu. Pomyślnie przeprowadzone THT za pośrednictwem GNR powoduje ukierunkowaną śmierć komórek nowotworowych i aktywację przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych, co prowadzi do regresji guza i związanego z tym zmniejszenia objętości guza¹³. Rycina 4 przedstawia zmiany objętości guza po THT za pośrednictwem GNR dla dwóch podskórnych modeli mysiego raka bocznego (model czerniaka B16 i model heterotopowego raka jelita grubego CT26) i jednego modelu raka płuca poduszeczki tłuszczowej sutka (4T1-rak piersi). W każdym modelu widoczne jest znaczne zmniejszenie objętości guza w porównaniu z grupą kontrolną 48-72 godziny po zabiegu THT za pośrednictwem GNR. Oczekuje się, że czas i wielkość zmniejszenia objętości guza po zabiegu będą się różnić w zależności od szczepu myszy i modelu raka. Oprócz redukcji guza, zaobserwowaliśmy silną wrodzoną odpowiedź immunologiczną w ciągu 48 godzin od THT za pośrednictwem GNR, charakteryzującą się zwiększoną ekspresją genów zaangażowanych w szlak STING-cGAS oraz regulacją w górę i aktywacją komórek dendrytycznych, makrofagów i komórek NK zarówno w modelach B16F10, jak i 4T1¹³. Warto zauważyć, że w obustronnym modelu guza 4T1, THT z włączonym GNR indukował ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną, o czym świadczy zwiększona infiltracja limfocytów T CD8 ⁺ do nieleczonych nowotworów przeciwległych¹³. Odkrycia te dodatkowo potwierdzają potencjał tego podejścia w zakresie wywoływania zarówno bezpośrednich efektów cytotoksycznych, jak i szerszych immunomodulujących efektów przeciwnowotworowych.

Tabela 1: Tabela przeglądowa natężenia promieniowania. Tabela przedstawiająca wartości natężenia promieniowania (W/cm²) dla różnych ustawień prądu wyjściowego lasera (mA) i odległości roboczych (cm). Tabela służy do określenia odpowiedniej wysokości lasera w oparciu o wymaganą średnicę wiązki do pokrycia powierzchni guza i uzyskania docelowego natężenia promieniowania 1 W/^cm2 ± 0,2 W/^cm2. Wartości podświetlone na zielono wskazują optymalny poziom natężenia promieniowania w pobliżu 1 W/^cm2. Ta tabela natężenia promieniowania jest specyficzna dla lasera LDX i została dostarczona przez producenta. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 1: Schemat graficzny procedury THT za pośrednictwem GNR. Metodologia celowanej terapii hipertermicznej za pośrednictwem złotego nanopręta w podskórnych guzach bocznych w modelu mysim. Po ustaleniu wyczuwalnego palpacyjnie guza (około 50 mm³) i znieczuleniu myszym, (1) wstrzyknąć domięśniowo GNR w stężeniu 1 μg/mm³, (2) wprowadzić sondę temperatury do wnętrza guza w środku masy guza, (3) nałożyć warstwę żelu aloesowego ~5 mm na powierzchnię guza, (4) rozpocząć podawanie lasera NIR, oraz (5) utrzymuj wewnętrzną temperaturę guza w łagodnym zakresie hipertermicznym (42 °C-48 °C) przez 5 minut. Skróty: GNR = złoty nanopręt; THT = celowana terapia hipertermiczna; NIR = bliska podczerwień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wizualna reprezentacja konfiguracji eksperymentalnej. Mysz BALB/c z heterotopowym guzem jelita grubego z centralnie wprowadzoną sondą temperatury wewnątrz guza i miejscową warstwą żelu aloesowego nakładaną bezpośrednio pod ekspozycją na wiązkę lasera w bliskiej podczerwieni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wykresy temperatury wewnętrznej w czasie rzeczywistym. Reprezentatywny profil (profile) temperatury wewnętrznej guza w czasie (w ms) zarejestrowany przez wewnętrzną sondę temperatury podczas ekspozycji guza na laser NIR. (A) Włączanie/wyłączanie cyklu lasera NIR u myszy, której wstrzyknięto GNR, wymagane do utrzymania wewnętrznej temperatury guza w łagodnym zakresie hipertermicznym (42 °C-48 °C) przez 5 minut. Podkreśla to znaczenie ścisłego monitorowania wewnętrznej temperatury guza i cyklicznego podawania lasera w celu utrzymania zakresu hipotermii przez cały czas trwania zabiegu. (B) Średnia różnica w wewnętrznej temperaturze guza między myszami, którym wstrzyknięto GNR (n = 15) i kontrolnymi (PBS), którym wstrzyknięto GNR (n = 8) podczas 5-minutowej ekspozycji na laser NIR. Guzy myszy, którym wstrzyknięto PBS, nie nagrzewają się do łagodnego zakresu hipotermii i stabilizują się w temperaturze około 39-40 °C, pomimo otrzymania takiej samej długości ekspozycji na laser NIR, jak w grupie wstrzykniętej GNR, której guzy osiągają temperatury hipertermiczne 42-48 °C. Skróty: GNR = złoty nanopręt; NIR = bliska podczerwień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wykresy objętości guza po THT za pośrednictwem GNR. THT za pośrednictwem GNR indukuje zmniejszenie objętości guza w wielu modelach raka myszy w ciągu 48-72 godzin po leczeniu. (A) Pomiary objętości guza w modelu 4T1 (rak piersi) po THT za pośrednictwem GNR (n = 24 PBS, n = 28 THT). (B) Pomiary objętości guza w modelu B16-F10 (czerniak) po THT za pośrednictwem GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Pomiary objętości guza w modelu CT26 (rak jelita grubego) według THT za pośrednictwem GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). Zmniejszenie lub spowolnienie wzrostu objętości guza w ciągu 48-72 godzin po leczeniu wskazuje na pozytywny wynik. Dane dotyczące objętości guza dla modelu CT26 w punkcie czasowym "24 godziny przed" nie są łączone - wartości są podobne i nakładają się na siebie. Słupki błędów reprezentują SEM. * p < 0,05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Zaprojektowanie i wdrożenie tej techniki THT za pośrednictwem GNR zapewnia możliwość przeprowadzania ukierunkowanego, dokładnego, mało zasobochłonnego i powtarzalnego ogrzewania guzów litych in vivo. Kluczową zaletą tego systemu jest jego precyzja przestrzenna i kontrola termiczna, co pozwala na miejscowe leczenie bez uszkadzania otaczających tkanek. Jednym z kluczowych kroków dla udanej konwersji fototermicznej jest zapewnienie kompatybilności między zastosowanymi GNR a źródłem światła NIR. W tym badaniu użyliśmy GNR zoptymalizowanych pod kątem absorpcji przy 860 nm. Przy tej długości fali światło skutecznie przenika przez tkankę, a ciepło jest selektywnie generowane w guzach zawierających GNR, podczas gdy otaczająca zdrowa tkanka pozostaje bliska temperaturze fizjologicznej²⁰. Dodatkowo, podczas wykonywania tego protokołu, dokładne monitorowanie wewnętrznej temperatury guza w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia, że osiągnięto łagodny zakres hipertermiczny i że leczenie jest prowadzone konsekwentnie. Umieszczenie sondy temperatury wewnątrz guza, jak pokazano na rysunku 2, pozwala na monitorowanie dawki termicznej guza w czasie rzeczywistym, jak pokazano na rysunku 3B.

Rozwiązywanie problemów z techniką
W zależności od modelu in vivo i typu nowotworu, mogą być konieczne niewielkie modyfikacje protokołu w celu optymalizacji wyników. Na przykład w modelach czerniaka myszy, raka jelita grubego i raka piersi, o których mowa na rycinie 4, zoptymalizowaliśmy stężenie objętościowe GNR do guza na poziomie 1 μg/^mm3. Zoptymalizowaliśmy również skuteczność tego protokołu, przeprowadzając ekspozycję laserem NIR bezpośrednio po wstrzyknięciu GNR, ponieważ nie zaobserwowano różnic w skuteczności leczenia podczas porównywania tego wstrzyknięcia i czasu leczenia z dłuższymi odstępami 0,5, 1, 4, 18 lub 24 godziny. W przypadku modeli nowotworów, które różnią się od naszych modeli pod względem patofizjologii guza lub lokalizacji ciała, inne stężenie GNR, wstrzyknięte w innym punkcie czasowym, może być optymalne do osiągnięcia i/lub utrzymania w zakresie hipertermii. Po tej procedurze należy wykonywać codzienne pomiary objętości guza, aby zarejestrować zmiany objętości guza. Regresja guza w ciągu 2-3 dni jest pozytywnym wskaźnikiem powodzenia leczenia.

Ze względu na charakter protokołu laserowego, powierzchowne oparzenia i owrzodzenia skóry są potencjalnym czynnikiem ryzyka, szczególnie w przypadku skóry pigmentowanej lub wrażliwej. Dostosowanie strumienia wyjściowego lasera może być konieczne w celu utrzymania odpowiedniej równowagi między powierzchnią skóry a wewnętrzną temperaturą guza, w zależności od zastosowanego modelu in vivo . Na przykład odkryliśmy, że ze względu na różnice w zawartości wody i pigmentu melaniny w skórze²¹, myszy C57Bl / 6 wymagają podawania lasera NIR przy niższym prądzie w porównaniu do myszy BALB / c, aby utrzymać temperaturę skóry poniżej 50 °C. Podczas modyfikowania prądu wyjściowego lasera upewnij się, że wysokość lasera jest odpowiednio dostosowana, aby utrzymać docelowe natężenie promieniowania 1 W/^cm2 ± 0,2 W/^cm2, jednocześnie pokrywając większość powierzchni guza średnicą wiązki laserowej. Alternatywnie, nałożenie dodatkowego żelu Aloe Vera może pomóc obniżyć temperaturę skóry podczas zabiegu bez drastycznego wpływu na wewnętrzną temperaturę guza. Utrzymanie odpowiedniej temperatury powierzchni skóry poprzez niezbędne modyfikacje jest ważne, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia owrzodzeń, które zaobserwowano jako potencjalny efekt uboczny tego zabiegu. Dokonując modyfikacji warstwy żelu Aloe Vera, należy na chwilę przerwać podawanie wiązki laserowej NIR. W ciągu kilku dni po protokole laserowym upewnij się, że myszy są ściśle monitorowane pod kątem potencjalnych oparzeń i/lub owrzodzeń.

Ograniczenia technologii THT za pośrednictwem GNR
Główną kwestią bezpieczeństwa, którą należy rozwiązać podczas wykonywania tej procedury, jest stosowanie certyfikowanych laserowych okularów ochronnych dla długości fali światła używanego podczas pracy lasera. System laserowy powinien mieć wbudowane funkcje bezpieczeństwa, takie jak blokada na klucz, aby zapobiec przypadkowemu uruchomieniu. Wymagane jest jednak dodatkowe środki ochrony indywidualnej – w szczególności odpowiednie okulary ochronne do lasera – w celu ochrony przed potencjalnym narażeniem na promienie odbite lub rozproszone. Oko jest najbardziej podatne na urazy spowodowane wiązką laserową, a oparzenia siatkówki są poważnym problemem w przypadku laserów NIR²². Wreszcie, cały personel obsługujący laser musi przejść odpowiednie szkolenie.

W protokole tym zdecydowano się na wstrzyknięcie GNR do guza zamiast wstrzyknięcia ogólnoustrojowego, aby zminimalizować toksyczność systemu, ograniczyć dystrybucję nanocząstek w narządach poza celem, takich jak wątroba, śledziona i nerki, oraz zwiększyć dokładność, skuteczność i profil bezpieczeństwa leczenia hipertermicznego. Jednakże, ponieważ protokół ten wymaga doguzowych wstrzyknięć GNR, może mieć ograniczoną zdolność do wywoływania hipertermii w niektórych modelach nowotworów. Do tej pory udowodniliśmy skuteczność tej metody w guzach tłuszczowych podskórnych i poduszeczek sutkowych, które znajdują się blisko powierzchni skóry i są łatwo dostępne pod względem iniekcji GNR i ekspozycji na światło NIR. Trudności logistyczne mogą pojawić się przy celowaniu w guzy znajdujące się w jamach ciała, takich jak otrzewna, lub podczas próby celowania w miejsca przerzutów guza pierwotnego. Potencjalna modyfikacja tego protokołu może obejmować ogólnoustrojowe wstrzyknięcie GNR, pod warunkiem, że nanocząstki zostaną zaprojektowane lub zmodyfikowane w celu zapewnienia skutecznej akumulacji w miejscach guza przed ekspozycją na NIR²³. Ponadto możliwe jest, że wstrzyknięcie GNR do guza może spowodować nierównomierne rozmieszczenie nanocząstek w guzie, wpływając na równomierność ogrzewania. Oczekuje się jednak, że nierównomierne ogrzewanie guza nie będzie miało dużego wpływu na stopień skuteczności leczenia, biorąc pod uwagę, że głównym wynikiem tego protokołu THT za pośrednictwem GNR jest indukcja ICD w celu aktywacji odporności przeciwnowotworowej. Wreszcie, odczyt temperatury wewnątrz guza zależy od lokalizacji sondy temperatury w guzie. Środek guza jest najbardziej optymalnym miejscem, w którym sonda może dokładnie odzwierciedlić ogólną średnią temperaturę guza. Jeśli jednak trudno jest zapewnić i/lub potwierdzić wprowadzenie sondy centralnej ze względu na rozmiar i/lub kształt guza, może być konieczne zarejestrowanie za pomocą dwóch lub więcej sond temperatury w różnych lokalizacjach.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Manuskrypt ten zapewnia kompleksowy, zoptymalizowany i powtarzalny protokół dla THT za pośrednictwem GNR w litych i powierzchownie dostępnych nowotworach. W porównaniu z innymi metodami wywoływania hipertermii, technika ta ma wyraźne zalety, a mianowicie jest mało zasobożerna, precyzyjna przestrzennie i wiąże się z minimalną toksycznością ogólnoustrojową. Chociaż zastosowanie GNR w terapii fototermicznej jest dobrze udokumentowane, w literaturze nadal występują znaczne różnice w sposobie wdrażania tych protokołów. Kluczowe elementy proceduralne, takie jak czas napromieniania NIR, wybór narzędzi do monitorowania termicznego (sondy termoparowe lub kamera termowizyjna), przygotowanie roztworu GNR i metody wstrzykiwania GNR często różnią się w zależności od badania.

Na przykład inne metody wymagały dłuższej (20 minut)²⁴ lub wielokrotnych dawek (4 x 15 min)²⁵ ekspozycji na NIR, aby osiągnąć podobne wyniki jak nasza. Co więcej, większość protokołów wykorzystuje sondy termoparowe lub kamery termowizyjne, ale rzadko łączy oba narzędzia^26,27. Dodatkowo, roztwory GNR są często przygotowywane z CTAB ^28,29,30, a sposób ich dostarczania różni się między iniekcjami ogólnoustrojowymi ^24,30 a iniekcjami donowotworowymi³¹, co może wpływać na ich dyspersję/lokalizację w TME. W związku z tym nie opracowano jeszcze kompleksowej i elastycznej metody THT za pośrednictwem GNR, która optymalizuje i ulepsza obecne protokoły.

Nasz protokół rozwiązuje te braki, integrując najbardziej efektywne i powtarzalne komponenty z literatury w jedno, ustandaryzowane podejście. W szczególności stosujemy podwójny monitoring termiczny (zarówno termoparę, jak i kamerę termowizyjną), aby zapewnić precyzyjne i bezpieczne dostarczanie ciepła; stosujemy wstrzyknięcie do guza GNR wolnych od CTAB, aby zmaksymalizować lokalizację guza i zminimalizować toksyczność; Włączamy również stosowanie żelu Aloe Vera w celu ochrony przed powierzchownymi oparzeniami skóry. Dodatkowo, GNR używane w tym protokole są zoptymalizowane pod kątem wydajnej konwersji fototermicznej przy NIR 860 nm, co pozwala na szybkie osiągnięcie łagodnych temperatur hipertermicznych w ciągu kilku sekund. Po osiągnięciu tego zakresu temperatur można go stabilnie utrzymywać przez 5 minut trwania leczenia, co uznaliśmy za wystarczające do wywołania immunogennej śmierci komórek i aktywacji immunologicznej. Sama długość fali NIR 860 nm zapewnia również korzystną równowagę między głębokością penetracji tkanek a bezpieczeństwem, co jeszcze bardziej zwiększa okno terapeutyczne tej metody.

Podsumowując, nasz protokół oferuje skonsolidowaną, zwalidowaną i biologicznie skuteczną alternatywę dla istniejących podejść do hipertermii za pośrednictwem GNR i wypełnia krytyczną lukę w tej dziedzinie, zapewniając w pełni szczegółową i adaptowalną metodę odpowiednią do przedklinicznych badań nad rakiem i rozwoju terapii skojarzonej.

Przyszłe zastosowania tej techniki
Wreszcie, chociaż protokół ten można łatwo łączyć z różnymi metodami leczenia raka, szczególnie dobrze nadaje się do zwiększania skuteczności immunoterapii, biorąc pod uwagę wrodzoną zdolność THT do stymulowania odporności przeciwnowotworowej. Indukując immunogenną śmierć komórki, promując uwalnianie antygenów specyficznych dla nowotworu i zwiększając liczbę wrodzonych komórek odpornościowych rekrutowanych do TME w ciągu 48 godzin po leczeniu, THT za pośrednictwem GNR pomaga "ponownie uwrażliwić" immunologicznie zimne guzy na wykrycie i atak przez układ odpornościowy¹³. W rezultacie, technika ta może być wykorzystana do poprawy skuteczności immunoterapii w leczeniu nowotworów, które mogły wcześniej rozwinąć oporność, oferując potencjalną strategię pokonywania barier leczenia raka i progresji choroby¹³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Trypsyna	Thermo Fisher Naukowy	25200-056
10 ml paski	Fisher Naukowy	7200574
Probówka Falcon 15 ml	Corning	352095
Strzykawka 1 ml	BD Nauki biologiczne	3331431
Igła 28 G	BD Nauki biologiczne	1298811
Linia komórkowa raka piersi 4T1	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	CRL-2539
5 ml pasiaka	Fisher Naukowy	7200573
Probówka Falcon 50 ml	Fisher Naukowy	14-432-22
70% etanolu	Alkohole komercyjne	36195
Żel Aloe Vera	Marka życia	57800985495
Linia komórkowa czerniaka B16-F10	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	CRL-6475
Tynk biologiczny	Tynk biologiczny	N/A
Dwustopniowa szafa bezpieczeństwa	Nuaire powiedział:	N/A
Laserowe okulary ochronne klasy 4	Wizja laserowa	F22. Zobacz materiał P5P18.5000 TGL	Zastosowaliśmy ramkę P22 z filtrem P5P18
Inkubator CO2 (37 ° C, 5% CO2)	Nuaire powiedział:	N/A
Corning 1-200 i mikro; L Uniwersalna pipeta zębatkowa  Porady	Corning	4865
Pipeta z filtrem Corning  Napiwki, 30 i mikro; L	Fisher Naukowy	07-200-265
Mysia linia komórkowa jelita grubego CT26	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	CRL-2638
DPBS (Polskie Biuro Obsługi Klienta	Thermo Fisher Naukowy	10010-049
Rurki Eppendorfa	Thermo Fisher Naukowy	3451
Samice myszy BALB/c	Charles River Laboratories (Montreal, Kanada)	028
Gniazdo C57Bl/6	Charles River Laboratories (Montreal, Kanada)	027
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher invitrogen naukowy	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Sonda temperatury wewnątrz guza	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Sonda termopary model HYP-1
IsoTip 1000 µ L Uniwersalny pipet z filtrem  Porady	Corning	4809
Laser LDX (model: LDX-3520-860-HHLFC)	Minnetronix (Małość)	N/A	Prąd lasera z maksymalną wartością zadaną przy 4600 mA
Optixcare Lubrykant do oczu	Aventix (Aventix)	N/A
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140148
Pryzmat 10.6.0	Podkładka graficzna	N/A
RPMI 1640 Średni	Thermo Fisher Naukowy	11875119
Oprogramowanie rejestratora danych termopary TC-08	Technologia Pico	PicoLog w wersji 5.25.3
Kamera termowizyjna	HIKmicro powiedział:	EA-1086922 EA-1086922
Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mm	Fisher Naukowy	877222
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%	Thermo Fisher Naukowy	15250061
Suwmiarka do pomiaru guza	Giles scientificKorporacja Mitutoyo	500-321