Neurofibromoza typu 1 (NF1) prowadzi do łagodnych guzów osłonki nerwowej obwodowej (neurofibromów), które wymagają specyficznego mikrośrodowiska nerwowego do wzrostu. Opracowano zoptymalizowany model ksenotransplanttu ortotopowego, wykorzystujący intraneuralne wstrzykiwanie ludzkich komórek Schwanna do myszy NSG. Model ten przypomina ludzkie neurofibromy i stanowi cenną platformę do oceny strategii terapeutycznych.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy ksenoprzeszczep nerwu kulszowego dla neurofibromozy typu 1
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurofibromoroza typu 1 (NF1) to zaburzenie genetyczne spowodowane patogennymi wariantami w genie NF1 , prowadzące do utraty funkcji neurofibrominy oraz rozwoju łagodnych guzów nerwów obwodowych znanych jako neurofibromy. Chociaż genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) pogłębiły naszą wiedzę o patofizjologii NF1, często nie potrafią odtworzyć spontanicznej nowotwory i mikrośrodowiskowej złożoności neurofibromów pochodzących od pacjentów. Kluczowym wyzwaniem w modelowaniu łagodnych neurofibromów jest ich zależność od mikrośrodowiska nerwowego, którego konwencjonalne metody ksenotransplantacyjne nie powtarzają. Tutaj opracowano zoptymalizowany model ortotopowego ksenoprzeszczepu dla neurofibromów związanych z NF1. Wykorzystując intraneuralne wstrzykiwanie uwiecznionych ludzkich komórek Schwanna pochodzących z neurofibroma do nerwu kulszowego myszy NSG z niedoborem odpornościowym, model ten odtwarza kluczowe cechy biologii neurofibroma u ludzi, w tym wzrost zależny od nerwów oraz interakcje z mikrośrodowiskiem nowotworowym. Protokół ten umożliwia dynamiczne, w czasie rzeczywistym monitorowanie postępu guza za pomocą obrazowania bioluminescencji, zapewniając powtarzalną i ilościową metodę oceny wzrostu neurofibroma. W przeciwieństwie do GEMM, ten model umożliwia kontrolowane inicjowanie guzów i precyzyjną ocenę strategii terapeutycznych przedklinicznych. Dodatkowo stanowi pomost między GEMM a modelami ksenoprzeszczepów pochodzącymi od pacjentów, zwiększając translacyjne znaczenie badań nad neurofibromą. Oferując fizjologicznie istotne środowisko do badania interakcji guz-nerw, model ten stanowi cenną platformę do badania biologii neurofibroma oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Przyszłe udoskonalenia, w tym integracja komponentów odpornościowych lub zaawansowane techniki obrazowania, mogą dodatkowo wzmocnić jego zastosowanie w badaniach nad NF1.
Wprowadzenie
Neurofibromatoza typu 1 (NF1) to zaburzenie genetyczne spowodowane patogennymi wariantami w genie NF1, prowadzące do utraty funkcji neurofibrominy, kluczowego supresora guza, który obniża poziom szlaku sygnalizacyjnego RAS-mitogen-aktywowanej kinazybiałkowej (MAPK) 1. NF1 to zespół predyspozycjinowotworowej typu 2, o głównych objawach klinicznych dotyczących układu nerwowego, skóry i układu szkieletowego, głównie dotykającym tkanki pochodzące z grzebienia nerwowego. Charakterystyczną cechą NF1 jest rozwój łagodnych guzów nerwów obwodowych, znanych jako nerwiakowaki. Guzy te składają się głównie z komórek Schwanna zawierających inaktywację dwuallelicznego NF1 (NF1-/-)3, wraz z innymi elementami stromalnymi, w tym fibroblastami NF1+/-, komórkami kroczowymi, komórkami odpornościowymi oraz składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej4.
Modele zwierzęce są niezbędne do zrozumienia patofizjologii neurofibroma oraz testowania strategii terapeutycznych. Myszy homozygotyczne dla mutacji Nf1 knockout (KO) (Nf1-/-) zmarły w łonie matki; Myszy Nf1+/− są zdolne do życia, płodne i podatne na raka, podobnie jak ich ludzkie odpowiedniki5. Jednak te zwierzęta nie rozwijają charakterystycznych cech ludzkiej choroby NF1: myszy Nf1+/− nie wykazywały ani nieprawidłowości pigmentacyjne, ani nerwowiaków. W ostatniej dekadzie powstała duża gama genetycznie modyfikowanych modeli myszy (GEMM), które niezależnie modelują niektóre objawy za pomocą podejść warunkowych KO. Niektóre GEMM zostały opracowane w celu indukowania powstawania neurofibroma poprzez warunkową inaktywację Nf1 w prekursorach komórek Schwanna 6,7,8.
Chociaż te GEMM znacząco poszerzyły naszą wiedzę o NF19, ich złożoność fenotypowa i heterogeniczność wymagają alternatywnych i komplementarnych modeli mysich do testów terapeutycznych. Ortotopowe ksenoprzeszczepy stanowią cenną alternatywę, pozwalając na bezpośrednie wszczepienie ludzkich komórek do ich rodzimej niszy anatomicznej, oferując tym samym model bardziej fizjologicznie istotny. Jednak większość badań opartych na ksenoprzeszczepie koncentrowała się na złośliwych, złośliwych guzach pochwy nerwowej obwodowej (MPNST)10, prawdopodobnie dlatego, że neurofibromy nie przeszczepiają się ektopicznie, co pozostawia lukę w modelowaniu łagodnych guzów.
Niniejsze badanie opisuje nowy ortotopowy model neurofibroma NF1, oparty na intraneuralnym wstrzyknięciu uwiecznionych ludzkich komórek Schwanna pochodzących z neurofibroma (linia komórkowa hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78) do nerwu kulszowego myszy NOD SCID gamma (NSG) niedoborczych immunonie. To podejście w pełni wykorzystuje natywne mikrośrodowisko nerwowe, umożliwiając łagodne powstawanie guzów, jednocześnie umożliwiając dynamiczne monitorowanie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI).
Celem tego protokołu jest: (1) Ustanowienie powtarzalnego modelu ortotopowego neurofibroma dla NF1, (2) Zapewnienie solidnej platformy przedklinicznej do badania interakcji guz-nerw oraz oceny nowych terapii oraz (3) Zbudowania luki między GEMMs11,12 a ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów (PDX)13 poprzez oferowanie pośredniego, kontrolowanego systemu eksperymentalnego. Model ten umożliwia szybki i opłacalny rozwój guza – zazwyczaj w ciągu 5 dni po wstrzyknięciu – bez konieczności tworzenia transgenicznych linii myszy, łącząc tym samym dostępność ksenotransplantatów z anatomicznym znaczeniem umieszczenia ortotopowego.
Ten model myszy z ortotopowej linii komórek neurofibroma (CDX) oferuje kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. W przeciwieństwie do GEMM, które opierają się na predyspozycjach genetycznych do napędzania nowotworów, ten model umożliwia bezpośrednią kontrolę nad inicjacją i postępem guza.
Protokół ortotopowego przeszczepienia złośliwych guzów nerwowej nerwu obwodowego (MPNSTs)10 został dostosowany do modeli łagodnych nerwiaków. Stanowi to znaczący krok naprzód w badaniach translacyjnych NF1, z potencjalnymi zastosowaniami w identyfikacji nowych celów terapeutycznych i testowaniu innowacyjnych strategii leczenia.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez komitet etyczny Institut Curie CEEA-IC #118 (Autoryzacja #50186 wydana przez Krajowy Organ) zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i przeprowadzane przez wykwalifikowany personel zgodnie z wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na zwierzętach. NOD SCID Gamma (NSG) myszy (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) zostały wybrane do tego badania ze względu na ciężki niedobór odporności, co umożliwia skuteczne wszczepienie ludzkich komórek. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Model zwierzęcy i przygotowanie linii komórkowej
- Usuń owłosienia w miejscu operacji za pomocą maszynki elektrycznej dzień przed przeszczepem, aby usprawnić zabieg dla dużych grup myszy NSG.
- Aby zapobiec obustronnemu uszkodzeniu kończyn tylnych, we wszystkich eksperymentach należy wstrzyknąć tylko jeden nerw kulszowy (lewa strona) na mysz. Monitoruj myszy pod kątem oznak stresu, utraty wagi i deficytów ruchowych.
- Po zabiegu pozwól myszom całkowicie się zregenerować na termoforze w klatce bez ściółki, aby zapobiec przypadkowemu wdychaniu materiału na ściółkę. Gdy myszy będą w pełni mobilne i nie wykazują oznak otępienia, należy je ponownie wprowadzić do ośrodka dla zwierząt.
- Do ksenografowania użyj linii komórkowej NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78), czyli ludzkiej linii komórkowej Schwanna uwiecznionej przez hTERT, pochodzącej od pacjentaNF1 14. Komórki te zostały stabilnie transdukowane za pomocą konstrukcji CMV-lucyferazy, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), umożliwiającej śledzenie podłużne za pomocą BLI przy użyciu komercyjnego systemu testów lucyferazy.
- Utrzymuj komórki w DMEM uzupełnione o 5% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz 1% penicylin-streptomycyny przy 37 °C z 5%CO2. Rozwinąć komórki do 80% konfluentności, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu.
- W dniu szczepienia komórki trypsynizują (≤4 min w 37 °C); liczyć i ponownie zawiesić je przy 5 × 103 komórkach w 4 μL na mysz.
2. Zabieg chirurgiczny w ksenografowaniu ortotopowym
- Przygotowanie przedoperacyjne
- Przygotuj stanowisko chirurgiczne przed indukcją znieczulenia, dokładnie dezynfekując miejsce pracy. Pokryj wszystkie powierzchnie styku mikroskopu chirurgicznego i systemu oświetleniowego sterylną przezroczystą folią oraz upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wcześniej sterylizowane przez autoklaw.
- Myszy przed leczeniem podłożono przedoperacyjnie z buprenorfiną podskórną (0,1 mg/kg) na 30 minut przed operacją, aby zapewnić odpowiednią początkową analgezję.
- Indukowanie i utrzymywanie znieczulenia poprzez intraperitonealne zastrzyki ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (15 mg/kg), przygotowywanych świeżo w soli sterylnej i dostosowujących do masy ciała (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Przed rozpoczęciem potwierdzenia głębokości znieczulenia odruchem uszczypnięcia palca u stóp.
- Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą termoforu przez cały zabieg, w tym podczas znieczulenia, przeszczepów i rekonwalescencji.
- Stosuj krople nawilżające oczy, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
- Procedura iniekcji
- Połóż mysz na prawym boku, z tylnymi łapami delikatnie rozstawionymi. Przed rozpoczęciem nacięcia przykryj obszar operacyjny sterylną zasłoną.
- Przygotuj sterylne pole chirurgiczne, aplikując jod povidon-w kilku przejściach w ruchach odśrodkowych kołowych.
- Nacięcie i sekcja: wykonaj małe nacięcie skóry (~5 mm) równolegle do kości udowej za pomocą cienkich nożyczek. Ostrożnie rozdziel mięsień pod spodem, aby odsłonić nerw kulszowy: użyj cienkich kleszczy i mikronożyczek, aby delikatnie oddzielić warstwy mięśni, uważając, by nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Zidentyfikuj nerw kulszowy jako białą, przypominającą sznurek strukturę położoną przyśrodkowo od kości udowej.
- Przechowuj zawiesinę komórkową w probówce 1,5 mL i delikatnie przełącz, aby ponownie zawiesować osadzone komórki. Załaduj 4 μL zawiesiny komórkowej do strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μL igłą 33 G (wybraną tak, by zminimalizować uraz nerwowy przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek).
- Włóż igłę równolegle do osi nerwu kulszowego (aby zapobiec przebiciu) na głębokość ~2 mm. Powoli zacznij wstrzykiwać, aby wywołać nacisk i zrobić szczelinę między nerwem a osłoną obwodową. Powoli przesuwaj igłę o kolejne 4 do 5 mm. Następnie powoli wstrzyknij zawiesinę, jednocześnie wyciągając igłę z nerwu. Unikaj napięcia lub ruchu nerwu.
- Wykonuj zabieg bez rozciągania nerwu kulszowego, aby zapobiec uszkodzeniom, i nie używaj zacisków. Odczekaj 10-15 sekund przed powolnym wyciągnięciem igły, aby zminimalizować refluks.
- Po wstrzyknięciu upewnij się, że nerw kulszowy jest lekko spuchnięty w miejscu wstrzyknięcia, bez przecieku czy przebarwień. Udany zastrzyk oznacza stabilny wygląd nerwu bez wycieknięcia.
- Zamknąć nacięcie chirurgiczne za pomocą 3 do 4 prostych szwów przerwanych z materiałem niewchłaniającym (3-0, 30 mm, 3/8 c), aby uniknąć zapalenia w miejscu operacji. Jeśli operacja trwa dłużej niż 10 minut, podaj 1 ml mleczanu Ringera (s.c.). Na koniec dnia podawaj meloksykam (5 mg/kg, podskórnie).
- Oznacz każdą mysz dla unikalnej identyfikacji, używając dziurka lub tagu bezpośrednio po operacji i przed powrotem do zdrowia po znieczuleniu.
- Pozwól myszom na rekonwalescencję w warunkach o kontrolowanej temperaturze i monitoruj ewentualne powikłania pooperacyjne.
3. Obrazowanie bioluminescencji do monitorowania przeszczepu i wzrostu guzów
- Aby ocenić skuteczność przeszczepu i postęp guza, wykonaj BLI w kilku punktach czasowych. Do monitoringu in vivo użyj systemu obrazowania in vivo , aby uchwycić światło emitowane w reakcji enzymatycznej między lucyferazą świetlika, ekspresją komórek nowotworowych, a jej substratem, D-lucyferyną. To podejście dostarczało dokładnej metody wizualizacji i ilościowego określania aktywności guza, dostarczając cennych informacji o dynamice guza w czasie.
- Ilościowo określić sygnały bioluminescencji w określonych punktach po szczepieniu, w tym w dniach 5, 12, 19, 26, 30 i 33 po szczepieniu (Rysunek 1). Zazwyczaj jednocześnie wykonuje się obrazy pięciu myszy, aby usprawnić proces i zachować spójność w pomiarach.
4. Konfiguracja obrazowania
- Znieczulaj myszy 2% izofluranem podczas akwizycji obrazu i używaj termoforu zintegrowanego z obrazem IVIS.
- Ustawiaj myszy konsekwentnie w tej samej orientacji i obrazuj je 10 minut po wstrzyknięciu D-Lucyferiny wewnątrzotrzewnejowej w dawce 10 μL/g masy ciała (stężenie zapasowe: 15 mg/mL w PBS, świeżo przygotowane i przefiltrowane).
- Uzyskaj obraz w ciągu 1 minuty, używając oprogramowania do akwizycji danych, zapewniając, że żadne piksele nie zostaną nasycone podczas procesu.
- Mierz intensywność sygnału bioluminescencyjnego jako względną liczbę fotonów/s. Użyj systemu obrazowania z następującymi ustawieniami: Czas naświetlania: Auto; Binning: średni; F/Stop: 1,2; Pole widzenia: 12,5 cm; Oprogramowanie: Living Image Software v4.7.3.
- Mierz emisję światła z obszarów guza, podawaną jako względna liczba fotonów na sekundę, za pomocą własnego oprogramowania. Wizualizuj intensywność bioluminescencji za pomocą skalowania pseudokolorów, które jest nakładane na czarno-białe obrazy wykonane jednocześnie.
5. Kryteria sukcesu wszczepienia
- Wyklucz myszy, jeśli nie wykazują wykrywalnej bioluminescencji lub jeśli sygnał z czasem słabnie.
- Włączaj tylko myszy z postępującym wzrostem luminescencji między 5. a 12. dniem.
- Przystąpić do monitorowania guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, jak opisano w sekcji Reprezentatywne Wyniki.
Wyniki
Stosując opisaną powyżej procedurę, model guza nerwu kulszowego został pomyślnie opracowany u myszy NSG z uwiecznionymi komórkami pochodzącymi z neurofibroma (ipNF04.4). Bioluminescencja za pomocą D-lucyferyny wykazała wyraźną lokalizację guza w nerwie kulszowym już od 5. dnia, z dowodami na wzrost wykładniczy w czasie. Przeszczep zakończył się sukcesem u 90% (37/41) wstrzykniętych myszy. Postęp guza monitorowano w dniach 5, 12, 19, 26, 30 i 33 (Rysunek 1A) i przez cały okres monitorowania nie zaobserwowano żadnych niespecyficznych sygnałów. Myszy zostały uśpione 33. dnia, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, przy pierwszych oznakach stresu lub nadmiernego obciążenia guza. Po rozwarstwieniu guz wydawał się dobrze rozwinięty i zintegrowany z nerwem kulszowym, bez oznak powstawania ropnia (Rysunek 1B). Co istotne, myszy wykazywały prawidłowy ruch zaraz po wyzdrowieniu z narkozy.
Rysunek 1: Obrazowanie bioluminescencji i makroskopowa analiza ortotopowych ksenograftów nerwu kulszowego u myszy NSG. (A) Podłużne obrazowanie bioluminescencji (BLI) dwóch myszy NSG wstrzykniętych intraneuralnie komórkami ipNF04.4 do lewego nerwu kulszowego. Zdjęcia zostały wykonane w dniach 5, 12, 19, 26, 30 i 33 po podaniu iniekcji, ilustrując postępujący wzrost guza w czasie u dwóch tych samych myszy. Wzrost intensywności sygnału bioluminescencyjnego odzwierciedla pomyślne przeszczepienie i rozszerzenie guza w mikrośrodowisku nerwowym. (B) Makroskopowy obraz nerwu kulszowego w 33. dniu po przeszczepie, ukazujący dobrze rozwinięty, zintegrowany guz bez oznak powstawania ropnia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Fotomikrografia miejsca przeszczepu tej myszy demonstrująca wzrost guza i ogniskową inwazję. Tkanki w parafinie barwione hematoksyliną i eozyną (H&E). Przedstawiono przykłady typowych guzów u trzech myszy. Skala: 2000 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Ilustracja uzupełniająca 1: Reprezentatywna ewolucja masy ciała myszy NSG (n=15) w trakcie eksperymentu z ksenotransplanttem. Nie zaobserwowano istotnej utraty wagi. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.
Dyskusja
Udane ustanowienie ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego z linii komórkowej (CDX) z neurofibromami u myszy NSG stanowi istotny postęp w badaniach NF1, odpowiadając na kluczowe ograniczenia istniejących modeli. Protokół potwierdza, że ludzkie uwiecznione komórki Schwanna związane z NF1 (ipNF04.4)14,15,16 mogą być efektywnie wszczepiane w nerw kulszowy myszy niedoborowych immunodeficytów, co prowadzi do powtarzalnego rozwoju guza w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku. Ortotopowe ksenoprzeszczepy linii komórkowych Schwanna zostały wymienione w oryginalnych badaniach ustanawiających ludzkie linie komórkowe Schwanna14,15, a szczegółowy protokół przedstawiono tutaj.
Kluczem do sukcesu tego protokołu było skrupulatne przygotowanie i monitorowanie zarówno komponentów komórkowych, jak i zwierząt gospodarzy. Podczas zabiegu znieczulenie było starannie prowadzone, dbając o to, by myszy były w odpowiednim stanie znieczulenia bez większego stresu. Aby zminimalizować ewentualne uszkodzenia, nerw kulszowy nie był rozciągany zaciskami ani kleszczemi, a szczególną ostrożność poświęcono unikaniu mechanicznych obciążeń tkanek. Zastosowanie BLI opartego na lucyferazie umożliwiło nieinwazyjne, podłużne monitorowanie wzrostu guza, dostarczając danych ilościowych i powtarzalnych. Ta metoda obrazowania nie tylko potwierdziła żywotność przeszczepu, ale także umożliwiła identyfikację wczesnych odchyleń w dynamice nowotworów. Brak znaczącej utraty masy ciała (Rysunek uzupełniający 1), dysfunkcji motorycznej lub innych oznak niepokoju u myszy podkreśla zgodność tego protokołu z zasadami etycznymi dobrostanu zwierząt oraz 3R (Zastępstwo, Redukcja, Udoskonalenie).
W porównaniu do GEMM, które opierają się na warunkowej inaktywacji Nf1 6,7,9, to podejście oferuje kilka wyraźnych zalet. GEMM wymagają specyficznych modyfikacji genetycznych, ale mogą nie w pełni odwzorować złożonych interakcji guz-zrów obserwowanych u ludzkich neurofibromów 1,17. Model ten pozwala na bezpośrednie badanie ludzkich komórek Schwanna w ich rodzimej niszy nerwowej, zachowując czynniki zewnętrzne komórki4. W przeciwieństwie do GEMM, gdzie guzy rozwijają się nieprzewidywalnie w czasie, model ksenoprzeszczepu umożliwia precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną nad powstawaniem guza. Model ten zapewnia szybką i powtarzalną platformę do testowania terapii kandydatów, a BLI umożliwia monitorowanie progresji guza i odpowiedzi na leczenie w czasie rzeczywistym.
Ponadto te wyniki są zgodne z wcześniejszymi badaniami nad MPNST, gdzie ortotopowe ksenoprzeszczepowanie wykazało poprawę wierności modeli nowotworowych5. Jednak łagodne nerwiaki stanowią wyjątkowe wyzwania, ponieważ ich wzrost jest silnie zależny od specyficznych interakcji nerwowych, których konwencjonalne metody przeszczepu podskórnego nie potrafiąodwzorować. Wyniki potwierdzają, że iniekcje wewnątrznerwowe zapewniają optymalne warunki do długotrwałego rozwoju neurofibroma.
Dlatego ten model in vivo można uznać za istotną alternatywę uzupełniającą GEMM do badań terapeutycznych przedklinicznych. Jednak model ma swoje ograniczenia. Ludzkie komórki Schwanna pochodzące z neurofibromów zostały uwiecznione i wykazują fenotyp guza, który można uznać za bardziej agresywny niż neurofibroma pleksiformnego, z gęstą proliferacją komórek (Rysunek 2). Nie zaobserwowano dowodów na odległe rozprzestrzenianie się u zwierząt, a całkowita przemiana złośliwa nie została wykazana. Potrzebne są dalsze badania, aby wykazać, czy fenotyp komórki może odpowiadać fenotypowi "pośrednim" przypominającemu atypowy neurofibroma, podobny do atypowych nowotworów neurofibromatycznych o nieznanym potencjale biologicznym (ANNUBP)18. Kolejnym istotnym ograniczeniem modelu jest jego zależność od myszy niedoborczych odpornościowo. Brak adaptacyjnego układu odpornościowego u myszy NSG ogranicza badania interakcji immuno-guz, które są coraz częściej uznawane za kluczowe czynniki w biologii neurofibroma 7,19,20,21. Przyszłe udoskonalenia mogą obejmować humanizowane modele myszy lub alternatywne strategie lepiej uchwycające immunologiczne aspekty choroby. Dodatkowo, poleganie na ekspresji lucyferazy w monitorowaniu guza, choć jest bardzo skuteczne, może ograniczać zastosowanie tego protokołu do eksperymentalnych urządzeń pozbawionych dostępu do sprzętu BLI. Chociaż BLI jest metodą wrażliwą i nieinwazyjną, nie dostarcza bezpośrednich informacji o zmianach histopatologicznych. Analizy uzupełniające, takie jak MRI czy zaawansowana histologia, mogą dodatkowo poprawić charakterystykę postępu neurofibroma.
Kilka etapów proceduralnych może wymagać optymalizacji, aby zapewnić skuteczne przeszczepienie guza. Awaria wtrysku może być spowodowana nieprawidłowym ustawieniem igły lub nadmiernym wyciekiem zawiesiny komórkowej. Aby temu zapobiec, igła musi być ostrożnie wprowadzana równolegle do nerwu kulszowego i powoli wyjmowana po wstrzyknięciu. Zmienność sygnałów bioluminescencyjnych może wynikać z nieregularnego dawkowania lucyferyny lub niewyrównania podczas obrazowania. Zaleca się ustandaryzowanie czasu podawania po podaniu lucyferyny (10 min) oraz utrzymanie identycznych ustawień obrazowania we wszystkich zwierzętach. Jeśli zmienność wzrostu guza pozostaje wysoka, należy potwierdzić żywotność komórek przed podaniu i zminimalizować stres zwierzęcy podczas manipulacji.
Podsumowując, to badanie ustanawia nowy i powtarzalny ortotopowy model ksenoprzeszczepu neurofibroma, oferując skuteczną przedkliniczną platformę do badania łagodnych guzów związanych z NF1. Wykorzystując ludzkie komórki Schwanna w ich naturalnym mikrośrodowisku nerwowym, model ten wiernie naśladuje biologię ludzkiego neurofibroma, umożliwiając monitorowanie guzów w czasie rzeczywistym oraz kontrolowane interwencje terapeutyczne. Model ten stanowi kluczowy krok między GEMM a modelami pochodzącymi od pacjentów (PDX), torując drogę do bardziej klinicznie istotnych podejść do badań i leczenia neurofibroma.
Przyszłe udoskonalenia powinny dążyć do integracji komponentów odpornościowych, takich jak humanizowane modele myszy, aby badać rolę mikrośrodowiska guza6. Rozszerzenie możliwości obrazowania, w tym MRI lub PET, mogłoby uzupełnić BLI o wgląd strukturalny i metaboliczny22. Wydłużenie terminów eksperymentalnych będzie niezbędne do badania długoterminowego rozwoju nerwiaka i potencjalnych ryzyk przemiany złośliwej. Łącząc modele GEMM i PDX, platforma ta wzmacnia badania translacyjne w NF1, oferując nowe możliwości innowacji terapeutycznych w łagodnych guzach osłony nerwów obwodowych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych
Podziękowania
Prace te były wspierane przez Institut national du cancer (Inca_18828). Chcielibyśmy podziękować platformie HistIM (kierowanej przez Maryline Favier) oraz Pierre'owi Sohierowi z Instytutu Cochin.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Buprecare | Dla przedoperacyjnej anestezji | |
| Maty grzewcze | ANIPHY | VI-653246 | Za utrzymanie normotermii podczas operacji myszy |
| hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) linia komórkowa | Stosowane materiały biologiczne | T0194 | Uwieczniona ludzka linia komórek Schwanna z zerowym NF1 |
| Izofluran | Iso-Vet | Do znieczulenia myszy podczas obrazowania bioluminescencyjnego | |
| IVIS Lumina Seria III | Revvity | Do obrazowania bioluminescencji | |
| Ketamina | Ketamina 1000 Virbac | Do znieczulenia chirurgicznego u myszy | |
| Oprogramowanie do Żywego Obrazu | Revvity | Zawarte w IVIS | Do akwizycji i ilościfikacji obrazów |
| System testów lucyferazowych | Promega | E1500 | Do wykrywania BLI |
| Meloksykam | METACAM | Niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) | |
| Monofilamentowy niewchłaniający szew | ETHILON | F2419H | Do zszycia nacięcia |
| Igła zamiast strzykawki | Hamilton | Zwyczaj | GA33/12,7mm/PST4-12 stopni i stopień obrony; |
| NOD SCID gamma (NSG) myszy | Rzeka Charles | 614NSG | |
| pLenti CMV Puro LUC (w168-1) | Addgene | 17477 | Do ekspresji lucyferazy świetlików |
| jod-okrutny povidone; E dermique 10% | Viatris | 330200775 | Miejscowy środek antydezynfekowy do dezynfekcji skóry |
| Ostrze skalpela | FST | 10015-00 | Za nacięcie skóry podczas operacji |
| Mikroskop stereo L125 | Leica | Do wizualizacji miejsca wstrzyku komórki w nerw kulszowy | |
| Strzykawka 10 & mikro; l | Hamilton | 1701RN | Do wstrzykiwania komórek do nerwu kulszowego |
| Xilazyna | Rompun 2% | Do znieczulenia chirurgicznego u myszy |
Bibliografia
- Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
- Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
- Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
- Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
- Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
- Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
- Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
- Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
- Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
- Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
- Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
- Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
- Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
- Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
- Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).
Przedruki i uprawnienia
