Artykuł metodologiczny

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

757 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Streszczenie

Guzy mózgu, zwłaszcza glejaki, są trudne do leczenia ze względu na ich agresywny charakter, złożone mikrośrodowisko guza i oporność na konwencjonalne terapie. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe często nie są w stanie odtworzyć prawdziwego środowiska guza, co prowadzi do niedokładnych przewidywań skuteczności leków. Technologia analizy strumienia zewnątrzkomórkowego, zwykle stosowana do analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym w kulturach 2D, mierzy kluczowe parametry metaboliczne, takie jak stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnik zużycia tlenu (OCR), zapewniając wgląd w metabolizm komórkowy. Zastosowanie modeli 3D stanowi znaczący postęp, ponieważ dokładniej naśladują one środowisko guza in vivo . Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego został dostosowany do trójwymiarowych (3D) modeli komórek glejaka, umożliwiając analizę krytycznych szlaków metabolicznych, w tym glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej, w bardziej odpowiednim kontekście fizjologicznym.

Komórki U87 wysiewano w odpowiedniej gęstości na 96-dołkowej płytce o niskim przyczepie i hodowano przez 5 dni. W 5 dniu zaobserwowano tworzenie sferoidów 3D za pomocą obrazowania o wysokiej treści. Pomyślnie uformowane sferoidy przeniesiono następnie na płytkę do oznaczania metabolizmu pokrytą poli-L-lizyną w celu analizy metabolicznej. Aby poprawić dokładność tych pomiarów, systemy obrazowania o wysokiej zawartości oceniają rozmiar komórek 3D, co pozwala na precyzyjną normalizację danych dotyczących strumienia zewnątrzkomórkowego i minimalizację zmian metabolicznych spowodowanych różnicami w wielkości komórek. To zintegrowane podejście zapewnia bardziej wiarygodną analizę odpowiedzi metabolicznych komórek glejaka na leczenie farmakologiczne, ujawniając potencjalne mechanizmy oporności na leki. Ostatecznie metodologia ta dostarcza cennych informacji na temat dynamiki metabolicznej glejaków i wspiera rozwój nowych, klinicznie istotnych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Glejaki, powszechna i agresywna postać guza mózgu, stanowią poważne wyzwanie kliniczne ze względu na ich szybki postęp, wysoce niejednorodne mikrośrodowisko guza i wyraźną oporność na konwencjonalne terapie1. Te zawiłości wymagają bardziej fizjologicznie istotnych modeli eksperymentalnych, aby poprawić dokładność ocen terapeutycznych. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) systemy hodowli komórkowych nie są w stanie odtworzyć architektury guza in vivo i interakcji komórka-komórka2, co często prowadzi do mylących wniosków dotyczących skuteczności leków i biologii nowotworu3.

Aby rozwiązać te problemy, trójwymiarowe (3D) modele nowotworów okazały się lepszą alternatywą, oferując zwiększone znaczenie biologiczne poprzez naśladowanie strukturalnych i funkcjonalnych cech nowotworów in vivo 4,5. Jednocześnie przeprogramowanie metaboliczne jest coraz częściej uznawane za cechę charakterystyczną progresji glejaka i oporności na leczenie 6,7,8. Analiza strumienia zewnątrzkomórkowego stała się szeroko stosowaną techniką pomiaru w czasie rzeczywistym kluczowych parametrów metabolicznych, takich jak szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR, pomiar wypływu protonów głównie z produkcji mleczanu glikolitycznego) i wskaźnik zużycia tlenu (OCR, kwantyfikacja mitochondrialnego wykorzystania tlenu w fosforylacji oksydacyjnej), dostarczając krytycznych informacji na temat szlaków fosforylacji glikolitycznej i oksydacyjnej 9,10,11.

W tym badaniu analiza strumienia zewnątrzkomórkowego została dostosowana do analizy sferoid glejaka 3D, umożliwiając badanie szlaków metabolicznych w kontekście, który bardzo przypomina warunki nowotworowe in vivo . Komórki glejaka U87 wysiewano w gęstości 1500 komórek na studzienkę na przezroczystych 96-dołkowych płytkach o okrągłym dnie, bardzo niskim przyłączeniu i hodowano przez 5 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu ułatwienia tworzenia sferoidów. Zastosowano obrazowanie o wysokiej treści, aby potwierdzić morfologię sferoidalną i ocenić wielkość komórki. Przed analizą metaboliczną gęste i okrągłe sferoidy komórek 3D o średnicy około 220 μm przeniesiono na płytki testowe wstępnie pokryte poli-L-lizyną w celu zapewnienia przyczepności i stabilności pomiaru. Co ważne, normalizację danych metabolicznych na podstawie wielkości sferoidy przeprowadzono za pomocą zintegrowanego obrazowania o wysokiej zawartości, co zmniejszyło zmienność i zwiększyło wiarygodność danych.

Ta zintegrowana platforma, łącząca hodowlę 3D, technologię analizy strumienia zewnątrzkomórkowego i normalizację opartą na obrazowaniu, umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych glejaka na interwencje terapeutyczne. Badanie to stanowi solidne ramy do badania metabolicznych podstaw oporności na leki i przyczynia się do opracowania bardziej skutecznych, możliwych do przełożenia klinicznego strategii leczenia glejaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Pełne specyfikacje wszystkich odczynników i materiałów eksploatacyjnych są wyszczególnione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla komórkowa 2D

  1. Utrzymuj komórki U87 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w sterylnych warunkach. Wykonaj standardowe procedury pasażowania, gdy komórki osiągną 80% zbieżności.
    UWAGA: Przez cały proces hodowli należy ściśle monitorować stan komórek i wykluczać komórki wykazujące nieprawidłowy wzrost lub zmiany morfologiczne z kolejnych doświadczeń.
  2. Wysiewaj komórki U87 na 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych i inkubuj w sterylnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% (v/v) CO2 i wilgotności względnej 90-95%.
    UWAGA: Pożywkę należy regularnie wymieniać, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu.

2. 3D tworzenie sferoidów komórkowych

  1. Przygotowanie eksperymentalne
    1. Przejrzyj cały przepływ pracy przedstawiony na rysunku 1 przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.
      UWAGA: Ściśle przestrzegaj technik aseptycznych podczas całego eksperymentu, aby zapewnić zdrowie komórek i zapobiec zanieczyszczeniu.
  2. Dysocjacja i zliczanie komórek
    1. Usunąć zużytą pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych i umyć komórki U87 trzykrotnie 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (3 ml na przemycie). Zużyte odczynniki należy umieścić w 20-25% (v/v) roztworze wybielacza, aby dezaktywować wszystkie materiały bioaktywne.
    2. Dodać 1 ml roztworu trypsyny do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty. Zneutralizować trypsynę za pomocą 2 ml DMEM zawierającego 10% FBS, podgrzanego do 37 °C, po odłączeniu wszystkich komórek pod mikroskopową obserwacją.
    3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy stężeniu 200 × g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS. Delikatnie odpipetować komórki, aby zapewnić równomierną zawiesinę komórek. Następnie policz za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i zarejestruj początkową liczbę komórek.
      UWAGA: Podczas mycia i dodawania mediów należy obchodzić się z ogniwami delikatnie, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych. Siłę pipetowania można kontrolować, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, które mogą wpływać na żywotność komórek i dokładność zliczania.
  3. Rozcieńczenie zawiesiny komórkowej
    1. Niewykorzystaną pożywkę podgrzać do temperatury 37 °C. Zawiesiny komórek należy utrzymywać w temperaturze pokojowej (RT; 25 ± 2 °C) przez 30 minut.
    2. Na podstawie początkowej liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek DMEM zawierającym 10% FBS do końcowej objętości 20 ml, zapewniając około 200 000 komórek.
      UWAGA: Przed ostatecznym rozcieńczeniem delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, aby zapobiec sedymentacji. Niewykorzystaną pożywkę utrzymywano w temperaturze 37 °C, a zawiesiny komórek inkubowano w temperaturze pokojowej. Jeśli wysiano 96 dołków po 1500 komórek na studzienkę, przygotowano łączną objętość 22 ml, aby uwzględnić nadmiar. Rozcieńczoną zawiesinę komórkową przeniesiono do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dokładnie wymieszano.
  4. Wysiew komórek w 96-dołkowych płytkach o bardzo niskim natężeniu
    1. Końcową zawiesinę komórek dokładnie wymieszać za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Powoli dodawać 200 μl zawiesiny (1500 komórek/studzienkę) do każdego dołka przezroczystej 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, o bardzo niskim mocowaniu, wzdłuż krawędzi.
      UWAGA: Aby zwiększyć wydajność, rozważ użycie pipety wielokanałowej.
    2. Po napełnieniu wszystkich studzienek należy wyrzucić pozostałą zawiesinę, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  5. Wirowania
    1. Szczelnie uszczelnij płytkę parafilmem, aby zapobiec wyciekom podczas wirowania. Odwirować mieszaninę o sile 200 × g przez 2 minuty, aby osadzać komórki na dnie każdej studzienki.
    2. Wyjąć płytkę z wirówki, ostrożnie usunąć parafilm i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Powłoka poli-D-lizynowa płytek do oznaczania metabolizmu

UWAGA: Mikropłytka do testu metabolicznego to specjalistyczna mikropłytka przeznaczona do adhezji sferoidalnej komórek podczas analizy strumienia zewnątrzkomórkowego.

  1. Przygotować roztwór powlekający, rozpuszczając 5 mg poli-D-lizyny w 50 ml sterylnej wody. Dokładnie wymieszaj.
  2. Dodać 30 μl roztworu powlekającego do każdego dołka na płytce do oznaczania metabolizmu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków, delikatnie potrząsając lub zasysając nadmiar roztworu.
  3. Inkubować płytkę i przykrywać ją przez 20 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Odessać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć studzienki 200 μl sterylnej wody.
  4. Suszyć płytkę na powietrzu przez co najmniej 30 minut, a następnie podgrzewać w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 30 minut, aby ustabilizować powłokę.
  5. Dodać 175 μl podgrzanego podłoża do każdej studzienki i utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 do czasu, aż będzie gotowa do przeniesienia sferoidów komórek.

4. Monitorowanie wzrostu sferoidów

  1. Po 5 dniach hodowli przenieś płytki sferoidalne do systemu obrazowania o wysokiej zawartości.
  2. Konfiguracja parametrów obrazowania: Ustaw temperaturę na 37 °C, a CO2 na 5%, a następnie dostosuj typ płyty, kanały i zakres ostrości.
  3. Uzyskuj obrazy sferoidalne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywami 10x i oprogramowaniem do obrazowania.
  4. Zidentyfikuj studzienki zawierające nienaruszone sferoidy (np. Rysunek 2A-C) i zapisz ich pozycje do transferu. Wykluczyć studzienki z nieregularnymi sferoidami (np. rysunek 2D)."

5. Leczenie sferoidów

UWAGA: Leczenie farmakologiczne przeprowadzono na dojrzałych sferoidach 3D w celu oceny odpowiedzi metabolicznej.

  1. Przypisanie grupy sferoidów
    1. Przypisz nienaruszone sferoidy do dwóch grup:
      Grupa kontrolna: 6 dołków replikowanych
      Grupa badawcza: 6 dołków replikowanych (leczonych fenofibratem)
  2. Przygotowanie roztworu leku
    1. Przygotować roztwór roboczy fenofibratu w świeżym, wstępnie ogrzanym podłożu o optymalnym stężeniu (np. 100 μM).
      UWAGA: Grupy poddane działaniu substancji zostały odtworzone w 100% DMSO w celu wytworzenia roztworów podstawowych, które następnie rozcieńczono w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu. Grupom kontrolnym podawano takie samo końcowe stężenie DMSO (0,1% v/v), jakie było obecne w próbkach leczonych lekiem. Końcowe stężenie oznaczono za pomocą testów dawka-odpowiedź.
  3. Wymiana medium
    1. Powoli odessać 100 μl pożywki z każdej studzienki wzdłuż ściany.
      UWAGA: Unikaj kontaktu z dnem studni, aby zapobiec zakłóceniom sferoidalnym.
    2. Dodać 100 μl świeżej pożywki do studzienek kontrolnych.
    3. Dodać 100 μl roztworu roboczego fenofibratu do studzienek zabiegowych.
  4. Inkubacja po zabiegu
    1. Delikatnie ustawić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Kultura przez 72 godziny.
  5. Ocena morfologiczna
    1. Oceń integralność sferoid zgodnie z procedurą obrazowania w kroku 4.

6. Przenoszenie sferoid komórkowych

  1. Ostrożnie wyjmij z systemu obrazowania płytkę o niskim stopniu mocowania zawierającą sferoidę i umieść ją na sterylnej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieścić płytkę testową pokrytą poli-L-lizyną obok siebie w celu przeniesienia.
  2. Przyciąć końcówkę pipety o pojemności 20 μl, aby ułatwić delikatne zasysanie sferoid komórek bez uszkodzenia.
  3. Delikatnie odessaj każdą nienaruszoną sferoidę z dna studzienki i przenieś ją do odpowiedniego dołka płytki komórkowej, pozwalając jej osiąść na 20 s. Potwierdź adhezję przez brak pływających fragmentów pod mikroskopią 10×.
  4. Powtórz te czynności dla wszystkich sferoid i sprawdź skuteczność transferu za pomocą systemu obrazowania opisanego w kroku 4.

7. Test metaboliczny

  1. Odgazowanie próbki
    1. Umieścić sferoidalną płytkę testową poddaną działaniu leku w komorze hydratacyjnej o temperaturze 37 °C pozbawionej CO2 .
      UWAGA: Ciągłe odgazowywanie prowadzono przez 1 godzinę przy ścisłej kontroli środowiska w celu zapewnienia dokładności pomiaru metabolicznego.
  2. Przygotowanie odczynnika i podawanie leków
    1. Równolegle przygotuj odczynnik i załaduj lek podczas 1-godzinnego okresu odgazowywania.
      UWAGA: Głównym celem tego eksperymentu jest ocena stresu mitochondrialnego; Wszystkie procedury muszą być skrupulatnie dostosowane do tego celu. W przypadku różnych typów eksperymentów należy przestrzegać określonych protokołów, aby zagwarantować dokładność i wiarygodność danych.
    2. Przygotowanie leku: Użyj następujących związków:
      Oligomycyna (inhibitor mitochondrialnego kompleksu V)
      Cyjanek karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazon (FCCP, rozprzęgacz)
      Mieszanina rotenonu (inhibitor kompleksu I) i antymycyny A (inhibitor kompleksu III)
      UWAGA: Leki uzyskano z zestawu Mitochondrialnego Testu Wytrzymałościowego użytego w tym badaniu. Niektóre związki są niebezpieczne biologicznie; Należy stosować ścisłe protokoły bezpieczeństwa biologicznego (środki ochrony osobistej i gotowość na wypadek sytuacji awaryjnej).
    3. Formulacja leku
      1. Przygotować roztwory podstawowe sproszkowanych leków, jak pokazano w Tabeli 1.
      2. Rozcieńczyć roztwory podstawowe do stężeń roboczych określonych w tabeli 2.
        UWAGA: Roztwory są dokładnie wirowane lub mieszane, aby zapewnić jednorodność w różnych gradientach stężeń.
  3. Ładowanie związków do wkładów sond detekcyjnych
    UWAGA: Wkład sondy detekcyjnej to jednorazowy wkład zawierający sondy biosensora do pomiaru tlenu i pH w czasie rzeczywistym.
    1. Aktywacja wkładu sondy (musi poprzedzać ładowanie mieszanki):
      UWAGA: Upewnij się, że czujnik jest aktywowany, wykonując następujące czynności co najmniej 12 godzin przed użyciem:
      1. Dodać 200 μl roztworu kalibru do każdego dołka płytki hydracyjnej.
      2. Ostrożnie umieść wkład sondy detekcyjnej na płycie hydratuacyjnej, zapewniając całkowite zanurzenie wszystkich sond w roztworze kalibru.
      3. Zmontowaną jednostkę należy inkubować w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C przez 12-24 godziny, aby aktywować czujniki.
        UWAGA: Niepełne zanurzenie lub niewystarczające nawodnienie powoduje dryft pomiaru (błąd OCR ±15%).
    2. Używaj pipet wielokanałowych lub elektronicznych, aby dostarczać precyzyjne objętości do studzienek, unikając resztek kropelek na krawędziach studzienek.
      UWAGA: Ponieważ ostra stymulacja lekami nie jest konieczna, postępuj zgodnie ze standardowymi sekwencjami ładowania.
    3. Po załadowaniu umieść płytkę sondy na stabilnej powierzchni, aby zapobiec zakłóceniom podczas transportu.
      UWAGA: Dokładność ładowania ma znaczący wpływ na wyniki.
  4. Konfiguracja oprogramowania
    1. Uruchom oprogramowanie i wybierz protokół testu wysiłkowego mitochondriów.
    2. Przypisywanie grup zgodnie ze wstępnie zdefiniowanym grupowaniem eksperymentalnym.
    3. Ustaw nazwę pliku i kliknij przycisk Rozpocznij uruchom.
  5. Kalibracja wkładów sond detekcyjnych.
    1. Delikatnie włóż załadowaną płytkę sondy do gniazda instrumentu zgodnie z monitem systemu.
    2. Rozpocznij kalibrację (15-20 min). Utrzymuj stabilne warunki; Unikaj wibracji.
    3. Wyjmij płytkę hydracyjną natychmiast po kalibracji (postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie).
      UWAGA: Zdejmij pokrywę płyty przed kalibracją.
  6. Profilowanie metaboliczne sferoid 3D
    1. Przenieś odgazowaną sferoidalną płytkę testową 3D do szczeliny pomiarowej przyrządu. Upewnij się, że jest dokładnie wyrównany z matrycą sondy, potwierdzając następujące elementy: (i) Prowadnice szczelin narożnych płytki; (ii) studzienka A1 pokrywa się z indeksowanym położeniem; (iii) Brak widocznej szczeliny między płytą a powierzchnią przyrządu
    2. Kliknij Start , aby rozpocząć testy stresu mitochondrialnego (czas trwania: ~1,5 h). Monitoruj parametry urządzenia przez cały czas.
      UWAGA: Przed pomiarem zdejmij pokrywki płytki testowej sferoidalnej 3D.
  7. Analiza danych
    1. Analiza obrazowa
      1. Przenieś płytki do testów sferoidalnych 3D do systemu obrazowania o wysokiej zawartości.
        UWAGA: Obrazy zostały uzyskane zgodnie z opisem w kroku 4. Obrazowanie wykazało, że większość sferoid pozostała nienaruszona, podczas gdy mniejszość doznała uszkodzeń podczas procesu przenoszenia, jak pokazano na rysunku 3.
      2. Przeanalizuj dane morfologiczne (np. powierzchnię, długość, szerokość) sferoid komórkowych za pomocą oprogramowania Harmony w wersji 5.2, wykonując kroki 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. Zastosuj moduł Region tekstury zgrubnie, aby oddzielić sferoidy 3D od tła, dzieląc zawartość obrazu na trzy klastry na podstawie cech tekstury obiektów na obrazach.
      4. Zastosuj moduł Znajdź region obrazu , aby udoskonalić separację wstępnie izolowanych sferoid 3D za pomocą charakterystyki rozmiaru opartej na objętości, aby usunąć zanieczyszczenia i zachować nienaruszone sferoidy.
      5. Zmierz parametry morfologiczne sferoid 3D za pomocą modułu Właściwości morfologii .
      6. Zastosuj moduł Select Population , aby ostatecznie odfiltrować prawdziwe sferoidy komórek 3D.
      7. Eksport wyników danych morfologicznych, jak pokazano w tabeli 3.
    2. Przetwarzanie danych
      UWAGA: Znormalizuj dane komórki za pomocą parametrów z wyjść obrazowania, aby zminimalizować artefakty eksperymentalne.
      1. Otwórz surowe dane metaboliczne za pomocą oprogramowania analitycznego.
      2. Wybierz opcję normalizacji , aby uzyskać dostęp do interfejsu edycji trybu normalizacji.
      3. Wprowadź pole przekroju poprzecznego sferoid zawartych w każdym odpowiednim dołku płytki testowej w polu Wartości normalizacji .
      4. Ustaw parametr współczynnika skali na 1 000 000.
      5. Kliknij przycisk Zastosuj , aby zakończyć proces normalizacji. Ostateczne wyniki przedstawiono na rysunku 4.

8. Utylizacja odpadów

  1. Utylizować wszystkie odpady eksperymentalne (pożywki, odczynniki, materiały eksploatacyjne i zawiesiny komórek) zgodnie z protokołami zarządzania zagrożeniami biologicznymi i odpadami laboratoryjnymi. Przed usunięciem należy autoklawować lub dezynfekować chemicznie odpady bioaktywne, aby zapobiec skażeniu środowiska.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trzy najbardziej krytyczne etapy w procesie wykrywania metabolizmu energetycznego sferoid komórkowych 3D to hodowla sferoid komórkowych 3D, proces transferu sferoidów oraz obrazowanie i kwantyfikacja sferoid po wykryciu (ryc. 1). Dodatkowo bardzo ważna jest obserwacja stanu sferoid komórkowych. Gdy eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wyżej wymienionymi procedurami eksperymentalnymi, sferoidy zostały wykryte w 5dniu (ryc. 2), a sferoidy osiągnęły śre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Adaptacja analizy strumienia zewnątrzkomórkowego do modeli 3D glejaka stanowi krytyczny postęp metodologiczny w badaniu metabolizmu komórek nowotworowych. Podczas gdy tradycyjne hodowle 2D od dawna służą jako podstawa do eksperymentów in vitro, nie są one w stanie uchwycić architektury przestrzennej, interakcji komórka-komórka i komórka-macierz oraz gradientów tlenu i składników odżywczych charakterystycznych dlanowotworów in vivo. Cechy te są szczególnie istotne w glejakach, gdz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin, granty o numerach 82471329 i 82001248.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 10 cmCorning430167
Probówka wirówkowa 15 mlCorning430791
Probówka wirówkowa 50 mlCorning430828
Calcein, AMInvitrogenZobacz materiał C1430
Hrabina 3Rybak termicznyAutomatyczny licznik komórek
Surowica bydlęca płoduGibco (firma Gibco)A5669701
Harmonia 5.2PerkinElmer powiedział:Oprogramowanie do obrazowania
Hoechst 33342 powiedział:Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał C0031
MEM EBSS ŚredniKlon HyCloneSH30024.01
Operetka CLSPerkinElmer powiedział:System analizy obrazowania o wysokiej zawartości
PBSKlon HyCloneSH30256.01
Bromowodorek lizyny poli-DSigma Zobacz materiał P7280
96-dołkowe płytki z okrągłym dnem o bardzo niskim nasadceCorning4515
Oprogramowanie Seahorse Wave DesktopAgilent
Konik morski XFe96AgilentMaszyna do pozaustrojowego badania metabolicznego
Sorvall ST8RRybak termicznyWirówka
TRYPSYNA 0,25% EDTAGibco (firma Gibco)25200072
Linia komórkowa U87MG Krajowa Infrastruktura Zasobów Komórkowych
XF 1,0 M roztwór glukozy, 50 mlAgilent103577-100
XF 100 mM roztwór pirogronianu, 50 mlAgilent103578-100
XF 200 mM roztwór glutaminy, 50 mlAgilent103579-100
Roztwór XF Calibrant 500 ml Agilent100840-000
Zestaw do testów warunków skrajnych XF Cell MitoAgilent103015-100
XF DMEM Podłoże, pH 7,4, 500 mlAgilent103575-100
Matryca sond XFe96/XF Pro FluxpakAgilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Płytki do testów metabolicznychAgilent103792-100

Bibliografia

  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza strumieni zewn trzkom rkowychszybko zu ycia tlenuanaliza glikolizyobrazowanie wysokotre ciowepowlekanie poli D lizyn3D hodowla kom rkowatraktowanie fenofibratem

Powiązane artykuły