Artykuł badawczy

Bioinformatyka – identyfikacja kandydatów na biomarkery związane z zapaleniem przyzębia w komórkach macierzystych więzadła przyzębia leczonych cytokinami

DOI:

10.3791/68863

⸱

31 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology and Oral Mucosa, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Department of Preventive dentistry, Heilongjiang Provincial Stomatological Disease Prevention and Treatment Hospital, 3Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne badanie ma na celu zbadanie zaburzenia regulacji genów poprzez analizę bioinformatyczną w komórkach macierzystych więzadeł przyzębia leczonych cytokinami. Zidentyfikowano podwyższoną ERC2-IT1 oraz obniżoną EPB41L4A-AS1 jako kluczowe cząsteczki w tych komórkach, które mogą służyć jako kandydaty na biomarkery potencjalnie związane z zapaleniem przyzębia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem obecnego badania było zbadanie potencjalnego mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw komórek macierzystych więzadeł przyzębia indukowanych cytokinami (PDLSC). Dane mikromacierze z zestawu danych GSE260558 zostały pobrane z bazy danych gene expression omnibus (GEO). Po normalizacji zidentyfikowano geny z zaburzeniami regulacji. Następnie różne ekspresowane mRNA (DE-mRNA) poddano analizom wzbogacania genów (GO) oraz analizom wzbogacenia encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG). Następnie geny hubowe zostały odfiltrowane na podstawie sieci interakcji białko-białko (PPI). Na koniec ustalono konkurencyjne endogenne sieci regulacyjne RNA (ceRNA) zawierające geny hubowe za pomocą strony internetowej ENCORI. Łącznie zidentyfikowano 739 różnych ekspresowanych lncRNA (DE-lncRNA) oraz 809 różnych ekspresowanych mRNA (DE-mRNA) za pomocą pakietu limma w języku programowania R. Następnie analizy GO i KEGG wykazały, że DE-mRNA są ściśle powiązane ze stanem zapalnym i formowaniem macierzy zewnątrzkomórkowej u PDLSC leczonych cytokinami. Zbudowano sieć interakcji białko-białko (PPI) dla DE-mRNA, a geny hubowe uzyskano na podstawie oceny stopnia. Przebadanych było łącznie 12 genów upregulated hub oraz 12 downregulated hub genów. Te geny upregulated i downregulated hub zostały następnie wykorzystane do budowy odpowiednio sieci regulacyjnej ceRNA. W tych sieciach podwyższone ERC2-IT1 i downregulated EPB41L4A-AS1 były traktowane jako kluczowe lncRNA w leczeniu zapalenia przyzębia. Podsumowując, analiza bioinformatyczna ujawniła kilka kluczowych genów oraz sieć regulacyjną ceRNA, które uczestniczyły w progresji PDLSC indukowanych cytokinami. Chociaż badanie to zidentyfikowało kilka kandydatów na biomarkery związane z zapaleniem przyzębia, konieczna jest dalsza walidacja eksperymentalna na modelach zwierzęcych lub próbkach klinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według Światowej Organizacji Zdrowia, zapalenie przyzębia jest uznawane za szóstą co do szóstej co do liczby występującej, wszechobecnej i nieodwracalnej przewlekłej choroby zapalnej u ludzi 1,2. W obecnych czasach dotyka prawie 15% światowej populacji 1,2,3. Zgłaszano, że zapalenie przyzębia jest silnie skorelowane z wieloma czynnikami, takimi jak wiek, płeć, praktyki higieny jamy ustnej, status palenia, pochodzenie etniczne, niższy status społeczno-ekonomiczny oraz szereg chorób ogólnoustrojowych 2,3,4,5. Zapalenie przyzębia, które ma szczególnie wysoką częstość występowania wśród osób starszych, jest patologicznie wywoływane przez dysbiotyczne zmiany w mikrobiocie poddziąsłowej przylegającej do zębów 6,7. Jeśli nie zostanie leczony, stan ten ostatecznie prowadzi do zniszczenia kości, przesuwania zębów oraz niefortunnej utraty zębów8. W związku z tym pilnie potrzebne jest kompleksowe zrozumienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw zapalenia przyzębia oraz identyfikacja markerów diagnostycznych tej choroby.

Złożoność strukturalna i interaktywna tkanki przyzębia jest powszechnie uważana za jeden z istotnych czynników przyczyniających się do znacznych trudności napotykanych podczas procesu regeneracji przyzębia 9,10. Spośród różnorodnych komórek macierzystych mezenchymalnych (MSC) wykorzystywanych do regeneracji przyzębia, komórki macierzyste więzadeł przyzębia (PDLSC) zostały gruntownie udowodnione jako wysoce wiarygodne źródło tworzenia nowych struktur przypominających cement w środowisku in vivo 11,12. W ostatnich badaniach przedklinicznych przeprowadzonych leczenie oparte na PDLSC wykazało niezwykle obiecujące wyniki w dziedzinie regeneracji tkanek13,14. W porównaniu z tkanką dziąseł pacjenta, analiza transkryptomiczna PDLSC wykazała silniejszą orientację funkcjonalną i potencjał transformacji terapeutycznej13,14.

Technologia bioinformatyczna i metody analizy bioinformatycznej umożliwiają badaczom identyfikację potencjalnych procesów biologicznych i powiązań ze statystykami proteomicznymi, genomicznymi i metabolomicznymi15,16. Ponadto wysokoprzepustowość technologii bioinformatycznej umożliwia badaczom analizę dużych zbiorów danych biologicznych, takich jak te powstałe w wyniku eksperymentów sekwencjonowania nowej generacji i mikromacierzy17,18. Ta możliwość umożliwia identyfikację potencjalnych biomarkerów do diagnozy i prognozy chorób19,20. Na przykład disintegrina i metalloproteinaza 28 (ADAM28) oraz domena podobna do dezintegriny i metaloprotezy z motywami trombozpondyny typu I podobnymi do 3 (ADAMTSL3) zostały zidentyfikowane jako nowe biomarkery w tkankach dziąseł pacjentów z zapaleniem przyzębia na podstawie kompleksowej analizy opartej na technologii bioinformatycznej21. Ponadto kilka genów związanych z ferroptozą, w tym koaktywator receptora jądrowego 4 (NCOA4), transporter nośnika substancji rozpuszczonej 1A5 (SLC1A5) oraz białko szoku cieplnego B1 (HSPB1), wykazano lepszą wartość diagnostyczną w przypadku zapalenia przyzębia22. Jednak mechanizm molekularny zapalenia przyzębia zasługuje na dalsze badania. W niniejszym badaniu naukowcy starają się wykorzystać technologię bioinformatyczną do badania genów hubowych w PDLSC indukowanych cytokinami oraz do identyfikacji potencjalnych procesów biologicznych i szlaków związanych z zapaleniem przyzębia. Analiza bioinformatyczna PDLSC leczona cytokinami obejmuje programy transkrypcyjne wywołane zapaleniem istotne dla dysfunkcji PDLSC, które rozwiązują różnicę między dysfunkcją PDLSC a zapaleniem przyzębia. Te podstawowe geny i szlaki w PDLSC indukowanych cytokinami dostarczają cennych informacji na temat jednolitych mechanizmów leżących u podstaw zapalenia przyzębia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbiór danych

Analiza ta wykorzystała publicznie dostępne dane i nie obejmowała osób ani zwierząt, zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucjonalnymi i JoVE. Wszystkie informacje dotyczące używanych platform są dostępne w Tabeli Materiałów.

  1. Wybierz łącznie 6 próbek (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 i GSM8119442) z zestawu danych GSE260558 (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) do analizy bioinformatycznej.
  2. W tych próbkach hoduje się komórki macierzyste więzadła przyzębia (PDLSC) w normalnym medium lub w pożywce zawierającej cytokiny zapalne przez 7 dni.
  3. Wyodrębnić całkowite RNA z PDLSC i poddać je sekwencjonowaniu wysokoprzepustowemu23. Proces analizy bioinformatycznej przedstawiono na Rysunku 1.

2. Identyfikacja DEG

  1. Przeanalizuj profile ekspresji lncRNA i mRNA za pomocą oprogramowania limma (wersja: 3.46.0), jak opisano wcześniej24.
  2. Wykonaj porównania parowe między cytokinami a grupami normalnymi.
  3. Użyj korekty wskaźnika fałszywego wykrywania (FDR) ze standardowym progiem < 0,05, aby zidentyfikować geny o istotnym zróżnicowaniu ekspresji. Użyj skorygowanych wartości p (FDR), aby kontrolować odsetek fałszywie pozytywnych wyników wśród statystycznie istotnych wyników.
  4. Stosuj skorygowany próg wartości P < 0,05 oraz próg zmiany fałdowania > 1, aby zidentyfikować istotnie dysregulowane lncRNA lub mRNA.
  5. Przedstawienie różnicowej ekspresji genów w wykresach wulkanów (ggplot2: wersja 3.4.1), które zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania R (wersja 4.0.4).
  6. Wymień 10 najczęściej dysregulowanych lncRNA i mRNA w tabelach.

3. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

  1. Przeprowadz analizę wzbogacenia DE-mRNA GO z wykorzystaniem internetowej bazy danych DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
    1. Zgłoś zaburzone geny na stronę internetową i wybierz terminy GO, w tym funkcję molekularną (MF), procesy biologiczne (BP) oraz komponenty komórkowe (CC), aby przeprowadzić analizę GO.
    2. Prześlij zaburzone geny do wtyczki Cytoscape (wersja: 3.8.2) ClueGO [16]+ oraz aplikacji Cluepedia.
    3. Zastosuj korektę Benjamini-Hochberga dla wielu porównań i ustaw próg istotności na skorygowanej wartości P < 0,05.
    4. Pobierz wyniki z Cytoscape. Uszereguj wzbogacenia w kolejności malejącej na podstawie wartości P i przedstawij 5 najlepszych wzbogaceń w każdej kategorii.
  2. Encyklopedia genów i genomów z Kioto (KEGG) to cenne źródło bazy danych do zrozumienia wysokiego poziomu funkcji i wpływu systemów biologicznych (http://www.genome.jp/kegg/).
    1. Analizę KEGG można przeprowadzić w podobny sposób, wybierając KEGG-PATHWAY na stronie internetowej.
    2. Ustaw próg istotności na skorygowanej wartości P < 0,05 i przedstawij 10 najlepszych wzbogaceń w tym badaniu. Wykonaj te analizy wzbogacania według raportowanych badań 25,26.

4. Sieć PPI

  1. Przewiduj i konstruuj sieć interakcji białko-białko (PPI) za pomocą narzędzia wyszukiwania oddziałujących genów (STRING, wersja 12.0).
  2. Złóż 318 zwykłych lub 465 zwykłych mRNA na stronę STRING, aby zbudować sieć PPI.
  3. Eksportuj dane interakcji z sieci PPI i przesyłaj je do oprogramowania Cytoscape.
  4. Ukryj pojedynczy węzeł w sieci PPI. Pobierz sieć PPI obecną w tym badaniu.
  5. Oblicz właściwości topologiczne sieci, w tym rozkład stopni, za pomocą aplikacji CentiScaPe, wtyczki do Cytoscape.
  6. Określ lokalną topologię każdego genu, sumując liczbę sąsiadujących genów i licząc interakcje dla danego węzła.
  7. Uszereguj wszystkie geny z sieci PPI w kolejności malejącej na podstawie stopnia ich łączności.
  8. Wybierz 12 najwyżej zwykłych i 12 najsłabszych genów z tej listy jako gnezony.

5. sieć regulacyjna miRNA-mRNA

UWAGA: Baza danych ENCORI (wersja 12.0, https://rnasysu.com/encori/) została wykorzystana do przewidywania powiązań regulacyjnych między mikroRNA (miRNA) a DE-LNCRNA (czyli genami hubowymi).

  1. Zgłosz do ENCORI geny podwyższonych lub downregulated hub do ENCORI, a program kryterium progu ustal ≥5, łącznie sześć programów, w tym PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar i TargetScan, do analizy predykcyjnej w ENCORI.
  2. Pobierz przewidywane miRNA i złóż je do ENCORI w celu uzyskania potencjalnych lncRNA.
  3. Pobierz przewidywane lncRA i zidentyfikuj nakładające się lncRNA pomiędzy krokiem 5.2 a rysunkiem 2.
  4. Złóż do oprogramowania Cytoscape (wersja 3.4.0) geny hubowe, miRNA uzyskane w sekcji 5.1 oraz lncRNA uzyskane w kroku 5.3, aby zbudować sieć ceRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja DEG
Oprogramowanie limma R zostało użyte do analizy różnicowych profili ekspresji lncRNA i mRNA. Różnice między tymi grupami zostały określone za pomocą nieparowanego t-testu. Jak pokazano na diagramie wulkanicznym (Rysunek 2), zidentyfikowano łącznie 739 różnych ekspresowanych lncRNA (DE-lncRNA, wartość p<0,05, |log2FC|>1). Wśród tych DE-lncRNA zidentyfikowano 340 zwiększo-zwykłych lncRNA oraz 399 obniżonych lncRNA w grupie cytokin w porównaniu d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste więzadeł przyzębia (PDLSC) są uważane za kluczowe komórki odgrywające kluczową rolę w tłumieniu uszkodzeń przyzębia zarówno na etapie progresji, jak i rekonwalescencji zapalenia przyzębia32,33. Znaczna ilość dowodów wyraźnie wykazała, że inkubacja w warunkach zapalnych może znacząco przyspieszyć starzenie się PDLSC34,35. Warto jednak zauważyć, że zjawisko starzenia komórkowego w odpowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że w tym badaniu nie ma konkurujących ze sobą interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wsparcie Drugiego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego w Harbinie, Fundacji Nauk Przyrodniczych prowincji Heilongjiang (LH2023H037) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (82201070).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RR Foundation for Statistical Computing4.0.4Podstawowe środowisko open-source do obliczeń statystycznych. Stanowi podstawę wszystkich kolejnych analiz. Zazwyczaj używane z RStudio.
LimmaSpołeczność Bioconductor (główny deweloper: Walter & Eliza Hall Institute)3.46.0Specjalistyczny pakiet do analizy różnicowej ekspresji mikromacierzy i RNA-seq. 
CytoscapeKonsorcjum Cytoscape3.8.2Open-source platforma do wizualizacji sieci. Wymaga osobnej instalacji; obsługuje wtyczki takie jak ClueGO i cytoHubba przez App Store.
STRINGEuropejskie Laboratorium Biologii Molekularnej12Największa na świecie baza danych przewidywanych i znanych interakcji białko-białko (PPI). Dostęp dostępny przez wtyczkę internetową lub Cytoscape; dostarcza oceny pewności.
ENCORIUniwersytet Sun Jat-sena3Publiczna baza danych koncentrująca się na sieciach ceRNA (miRNA-mRNA-lncRNA).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

leczenie cytokinamianaliza bioinformatycznaekspresja gen wgeny r nicowo eksprimowaneoddzia ywania bia ko bia kosie ceRNAwzbogacenie GOszlak KEGG

Powiązane artykuły