Artykuł metodologiczny

Analizy konkurencyjnej endogennej sieci RNA u szczurów z niedrożnością tętnicy środkowej mózgu na podstawie ekspresji lncRNA, miRNA i mRNA

DOI:

10.3791/68876

⸱

7 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu wykorzystano analizy bioinformatyczne i walidację eksperymentalną w celu systematycznego badania ról regulacyjnych i mechanizmów leżących u podstaw długich niekodujących RNA (lncRNA) funkcjonujących jako konkurencyjne endogenne RNA (ceRNA) w udarze niedokrwiennym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ma na celu zbadanie ról regulacyjnych i mechanizmów leżących u podstaw lncRNA działających jako ceRNA w udarze niedokrwiennym. Opierając się na hipotezie ceRNA, lncRNA, miRNA i mRNA zidentyfikowano jako składniki sieci regulacyjnej zaangażowanej w udar. Do szczegółowej analizy wybrano kluczowe lncRNA z powstałej podsieci. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego z wykorzystaniem ontologii genów i mapowania szlaków za pośrednictwem Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto ujawniła krytyczne interakcje w sieci ceRNA związanej z lncRNA. Kluczowe szlaki, w tym sygnalizacja wapniowa, sygnalizacja połączenia szczelinowego i interakcja neuroaktywnego receptora liganda, zostały następnie zweryfikowane za pomocą analizy Western blot. Skonstruowana sieć ceRNA składała się z 334 lncRNA, miRNA i mRNA, z analizą wzbogacenia funkcjonalnego przewidującą ich role biologiczne. Trzy lncRNA o wysokim stopniu centralności zostały wybrane do skonstruowania reprezentatywnej podsieci ceRNA. Analiza Western blot wykazała, że w porównaniu z grupą pozorowaną, poziomy ekspresji kluczowych białek - CaMKII, kalmoduliny, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 i NPY1R były znacznie obniżone w grupie modelowej, podczas gdy ekspresja CaN była znacznie podwyższona (P < 0,05). Odkrycia te sugerują, że lncRNA są znacząco zaangażowane w patogenezę udaru. Podsumowując, lncRNA działające jako ceRNA pełnią kluczowe role regulacyjne w patogenezie udaru niedokrwiennego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar niedokrwienny, powszechne zaburzenie neurologiczne, prowadzi do trwałego uszkodzenia mózgu, długotrwałej niepełnosprawności lub śmierci 1,2,3,4. MikroRNA (miRNA lub miR), długie niekodujące RNA (lncRNA) i informacyjne RNA (mRNA) tworzą sieci regulatorowe za pośrednictwem RNA 5,6,7,8. Cząsteczki te regulują funkcje komórkowe poprzez różnezłożone mechanizmy, 9,10 są coraz częściej uznawane za czynniki przyczyniające się do patofizjologii udaru niedokrwiennego. Jednak pomimo ich rosnącego związku z chorobą, dokładne role tych niekodujących RNA pozostają niejasne. Dalsze badania nad nowymi niekodującymi RNA są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw udaru niedokrwiennego.

LncRNA działają jako kluczowe regulatory ekspresji genów podczas inicjacji i progresji różnych stanów patologicznych. Służąc jako konkurujące endogenne RNA (ceRNA), lncRNA wiążą się z miRNA, aby wywierać określone efekty regulacyjne11. Wei i wsp. donoszą, że lncRNA działa AK038897 jak ceRNA, celując w miR-26a-5p, modulując w ten sposób kinazę białkową 1 związaną ze śmiercią (DAPK1) w celu zaostrzenia uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mózgu12. Badania pokazują, że długi niekodujący RNA SNHG1 (lncRNA SNHG1) działa jako ceRNA do regulacji chorób naczyń mózgowych poprzez modulację szlaku sygnałowego HIF-1α / VEGF poprzez interakcję z miR-18a13. Dodatkowe badania pokazują, że długi niekodujący gen 3 z ekspresją matczyną RNA (lncRNA MEG3) moduluje apoptozę neuronów poprzez kaskadę sygnalizacyjną miR-21 / PDCD414. Chociaż liczne lncRNA, miRNA i mRNA zostały zidentyfikowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub analizy mikromacierzy, funkcje tych cząsteczek w udarze pozostają niejasne i pilnie potrzebne jest systematyczne tworzenie sieci regulacyjnych za pośrednictwem RNA.

W związku z tym niniejsze badanie ma na celu skonstruowanie kompleksowej sieci lncRNA-miRNA-mRNA w oparciu o hipotezę ceRNA z wykorzystaniem wcześniej zebranych danych oraz analizę wybranych podsieci ceRNA poprzez wzbogacenie Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) w celu lepszego zrozumienia funkcji lncRNA. Wyniki mogą ujawnić, że kilka lncRNA funkcjonuje jako ceRNA, potencjalnie regulując określone miRNA i ich docelowe mRNA. Wzbogacenie GO może uwypuklić kluczowe procesy biologiczne, takie jak rozwój komórkowy, transdukcja sygnału i regulacja cyklu komórkowego, podczas gdy wzbogacenie szlaku może ujawnić ich udział w szlakach związanych z udarem, odpowiedziach immunologicznych i metabolizmie. Odkrycia te mogą uwypuklić potencjalną rolę lncRNA w różnych procesach komórkowych i mechanizmach chorobowych.

W badaniach nad udarem niedokrwiennym zaproponowano kilka kluczowych ulepszeń w stosunku do istniejących metod analizy sieci ceRNA, co potwierdzają porównania z powiązanymi badaniami: po pierwsze, zintegrować wielowarstwową walidację poprzez połączenie budowy sieci z funkcjonalną weryfikacją szlaku; w przeciwieństwie do Li i wsp.15, który koncentruje się przede wszystkim na bioinformatycznym profilowaniu sieci ceRNA związanych z odpornością przy użyciu publicznych danych transkryptomowych, zbuduj sieć ceRNA składającą się z 334 lncRNA, miRNA i mRNA oraz zwaliduj krytyczne szlaki sygnałowe (sygnalizacja wapniowa, sygnalizacja połączenia szczelinowego i neuroaktywna interakcja ligand-receptor) poprzez analizę Western blot, odnosząc się do ograniczenia nadmiernego polegania na przewidywaniach in silico, jak widać w Fan i wsp.16, która konstruuje sieć ceRNA związaną z circRNA, ale brakuje eksperymentalnej walidacji dalszych szlaków i potwierdza funkcjonalne znaczenie przewidywanej sieci poprzez ilościowe określenie ekspresji białek (np. CaMKII, CX36, GRIA3) zarówno w grupie modelowej, jak i pozorowanej; skupienie się na rdzeniowych lncRNA o dużym znaczeniu topologicznym, zwiększając swoistość wyników; w przeciwieństwie do Cheng i wsp.17, który konstruuje sieć ceRNA lncRNA-miRNA-mRNA z 3 lncRNA, 2 miRNA i 24 mRNA, ale nie nadaje priorytetu kluczowym regulatorom, identyfikuje 3 lncRNA o wysokim stopniu centralności, aby zbudować reprezentatywną podsieć, zapewniając, że mechanistyczne wglądy są zakotwiczone w najbardziej wpływowych węzłach i poprawiając interpretowalność w porównaniu z szerszymi, mniej skoncentrowanymi sieciami, takimi jak te opisane w Li i wsp.18, który obejmuje 62 lncRNA, ale nie zawiera ukierunkowanej analizy podsieci; zapewnić szczegółowe parametry eksperymentalne w celu poprawy odtwarzalności: użyć 500 ng-1 μg całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanek mózgowych (6 szczurów na grupę: 20 modeli MCAO i 20 kontrolnych operacji pozorowanych) do przygotowania biblioteki, z numerem integralności RNA (RIN) > 8,0 w celu zapewnienia jakości, szczegół nieokreślony w Wang i wsp.19, który waliduje biomarkery circRNA, ale pomija specyfikacje wejściowe RNA; zatrudnia samce szczurów SPF SD (220 ± 30 g) z MCAO, szeroko stosowanym modelem, ale wyraźnie zwraca uwagę na jego ograniczenia, nie replikuje on w pełni złożoności naczyniowej ludzkiego udaru niedokrwiennego ani odpowiedzi immunologicznej, jak podkreślono w Li i wsp. - i łagodzić to przez stratyfikację szczurów według wyników neurologicznych (1-3) w celu standaryzacji ciężkości zawału; Uznaj ograniczenia badania: sieć ceRNA może nie wychwytywać modyfikacji potranslacyjnych, a wielkość próby do walidacji Western blot (n = 6 na grupę) może zostać rozszerzona, a przyszłe prace obejmą większe kohorty i analizy proteomiczne w celu wypełnienia tych luk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentalnej Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Anhui (numer licencji: AHUCM-rats-2024006) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i standardami wykorzystania zwierząt JoVE. W badaniu wykorzystano czterdzieści samców szczurów SD klasy SPF (220 g ± 30 g). Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Trzymanie zwierząt w Centrum Doświadczalnym dla Zwierząt w standardowych warunkach doświadczalnych. Utrzymuj 12-godzinny cykl światła/ciemności, codziennie zmieniaj pościel i zapewnij swobodny dostęp do jedzenia i wody.
  2. Poddać zwierzęta eutanazji pod koniec eksperymentu, podając 150 mg/kg pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu wywołania głębokiego stanu znieczulenia (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź głębokie znieczulenie przez brak odruchowej reakcji na uszczypnięcie łapy, monitoruj oddech, aby zapewnić całkowitą utratę parametrów życiowych, a następnie przystąp do dekapitacji.

2. Indukcja modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów

  1. Wywołać znieczulenie, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie 1% pentobarbitalu sodu w dawce 40 mg/kg20 (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i odruchów rogówkowych.
    1. Stale monitoruj oddech i tętno przez cały czas trwania zabiegu. Nałożyć sterylną maść do oczu na bazie oleju mineralnego natychmiast po indukcji znieczulenia w celu ochrony oczu21.
  2. Po całkowitym znieczuleniu wykonaj nacięcie szyi w linii środkowej i ostrożnie odsłoń prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Pod bezpośrednią wizualizacją użyj odpowiednich narzędzi mikrochirurgicznych (np. kleszczy i nożyczek), aby delikatnie oddzielić otaczającą tkankę łączną i całkowicie odsłonić każdą tętnicę.
    1. Po odsłonięciu tętnic należy podwiązać ECA i CCA za pomocą szwów chirurgicznych. Zawiąż bezpieczne węzły chirurgiczne, aby zablokować przepływ krwi i zminimalizować krwawienie podczas kolejnych zabiegów. Zapewnij odpowiednie napięcie, aby stworzyć stabilne pole do wprowadzenia szwów.
    2. Wykonaj małe nacięcie w miejscu rozwidlenia ECA i ICA za pomocą nożyczek okulistycznych, aby przygotować się do wprowadzenia szwów. Wybierz szew nylonowy o średnicy 0,25 mm i długości 18 mm od końcówki zaokrąglonego (w kształcie kuli) końca. Wprowadzić szew przez miejsce nacięcia na styku ECA-ICA i delikatnie przesunąć go wzdłuż ICA na głębokość około 18,5 mm ± 0,5 mm, aby zamknąć tętnicę środkową mózgu i wywołać ogniskowe niedokrwienie mózgu.
    3. Przymocuj wprowadzony nylonowy szew do otaczającej tkanki lub naczyń krwionośnych za pomocą szwów chirurgicznych, aby zapobiec przemieszczeniu. Po utrzymaniu MCAO przez 2 godziny wywołać uszkodzenie niedokrwienne/reperfuzyjne. Użyj cienkich kleszczy chirurgicznych, aby delikatnie chwycić nylonowy szew i powoli wycofać się o około 5 mm, aby częściowo przywrócić przepływ krwi w mózgu i wywołać uraz reperfuzyjny. W grupie pozorowanej podwiązać tylko tętnicę szyjną bez wprowadzania zator gwintowy22.
  3. Tydzień po pomyślnym ustanowieniu modelu MCAO, głęboko znieczulij szczury. Gdy nie ma reakcji na uszczypnięcie łapy, szybko odetnij głowę i zbierz mózgi. Opłucz tkanki mózgowe zwykłą solą fizjologiczną, a następnie przechowuj je w lodówce o temperaturze -80 °C w celu kriokonserwacji23.
  4. Ocena funkcji neurologicznych
    1. Oceń funkcję neurologiczną za pomocą metody punktacji Longa, aby określić sukces modelu MCAO24. Po 24 godzinach od reperfuzji oceń funkcję neurologiczną u każdego szczura i przypisz wynik na podstawie następujących kryteriów: Wynik 0: brak obserwowalnego deficytu neurologicznego; Wynik 1: zgięcie lewej kończyny przedniej podczas zawieszenia ogona, kończyna przednia nie jest w pełni wyprostowana; Wynik 2: zgięcie lewej kończyny przedniej podczas zawieszenia ogona ze znacznie zmniejszonym oporem po dotkniętej (lewej) stronie po umieszczeniu na płaskiej powierzchni; Wynik 3: taki sam jak wynik 2, z dodatkowym ruchem okrężnym lub mimowolnym obracaniem się podczas czołgania się; Punktacja 4: utrata przytomności lub śmierć w ciągu 24 godzin.
      UWAGA: Wyższy wynik wskazuje na poważniejsze zaburzenie zachowania i większe upośledzenie neurologiczne.
  5. Obliczać objętość zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)
    1. Podziel każdy mózg szczura ex vivo wzdłuż płaszczyzny koronalnej na pięć plasterków o równej grubości. Upewnij się, że każdy plasterek ma dokładnie 2,0 mm ± 0,1 mm grubości. Całkowicie zanurz sekcje w świeżo przygotowanym 2% (w/v) roztworze barwiącym TTC.
      1. Owinąć pojemnik do barwienia folią aluminiową w celu ochrony roztworu przed światłem i inkubować próbki w inkubatorze o stałej temperaturze w temperaturze 37 °C ± 0,5 °C przez 30 minut. Po barwieniu obserwuj barwienie na czerwono różane w normalnej tkance mózgowej, podczas gdy obszary niedokrwienne zawału pozostają niezabarwione (białe) z powodu utraty aktywności dehydrogenazy.
    2. Przenieść wycinki mózgu zabarwione TTC do 4% (w/v) roztworu paraformaldehydu i utrwalić w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, aby zachować morfologię tkanki. Po utrwaleniu uchwyć cyfrowe obrazy plastrów za pomocą systemu obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Rejestruj i archiwizuj dane 24 godziny po utrwaleniu.
    3. Użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo objętość zawału i całkowitą objętość tkanki mózgowej dla każdej grupy szczurów po barwieniu TTC. Obliczyć skorygowaną objętość zawału, korzystając z następującego wzoru25:
      Skorygowana objętość zawału (%) = {[całkowita objętość zmiany − (objętość lewej półkuli − objętość prawej półkuli)] / objętość prawej półkuli} × 100%.
    4. Użyj oprogramowania GraphPad Prism do wizualizacji i analizy statystycznej skorygowanych objętości zawału za pomocą niesparowanego testu t. Zdefiniuj istotność statystyczną jako P < 0,05.

3. Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe RNA

  1. Wybierz tkanki mózgowe od trzech szczurów w każdej grupie. Usuń rybosomalny RNA (rRNA) z wszystkich próbek RNA za pomocą zestawu do usuwania rRNA Ribo-Zero zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Skonstruuj komplementarne biblioteki DNA (cDNA) za pomocą zestawu TruSeq RNA Library Prep Kit zgodnie ze standardowym protokołem. Użyj oczyszczonych bibliotek cDNA do generowania klastrów i sekwencjonowania.
  2. Wykorzystaj wcześniej wygenerowane dane podstawowe26, które dostarczyły wszystkie biblioteki sekwencjonowania i zestawy danych na potrzeby tego badania, bez polegania na nowo utworzonych bibliotekach. Skoncentrowanie obecnych prac na zintegrowanej analizie fuzyjnej tych istniejących zestawów danych bez generowania nowych bibliotek sekwencyjnych RNA lub danych sekwencjonowania.
    1. Potwierdź zgodę odpowiednich instytucjonalnych komisji etycznych na poprzednie badanie. Przeprowadzić sekwencjonowanie wysokoprzepustowe w celu systematycznej oceny profilu ekspresji miRNA u szczurów z MCAO, przestrzegając standardowych protokołów, jak opisano wcześniej27.
      UWAGA: Dane kontroli jakości dla biblioteki sekwencjonowania RNA znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

4. Różnicowa analiza ekspresji długich niekodujących RNA, mikroRNA i informacyjnych RNA

  1. Uzyskaj adnotacje dla genów kodujących białka, miRNA i lncRNA z Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBazy (https://www.mirbase.org/) i NONCODE (http://www.noncode.org/), odpowiednio 28,29,30. Określ ilościowo ekspresję genów za pomocą StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Zbierz wyrównane odczyty z każdej próbki w transkryptomy za pomocą asemblera StringTie. Użyj modułu scalania StringTie, aby zintegrować zestawy transkryptomu ze wszystkich próbek, generując ujednolicony zestaw transkryptów spójny w całej kohorcie. Użyj tego scalonego transkryptomu, aby oszacować obfitość transkryptu32.
    2. Przeprowadź kwantyfikację genów kodujących białka i lncRNA, stosując normalizację wartości Trimmed Mean (TMM) i obliczając fragmenty na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (FPKM) dla każdego transkryptu33,34.
  2. Wykonaj analizę ekspresji różnicowej przy użyciu pakietu edgeR (https://bioconductor.org/) w celu identyfikacji lncRNA o zróżnicowanej ekspresji (DEL), miRNA (DEMis) i mRNA (DEM) między MCAO a grupami kontrolnymi. Przekonwertuj przefiltrowaną macierz zliczania nieprzetworzonych na obiekt DGEList krawędziR . Oszacuj wspólną dyspersję i przypisz tę samą wartość dyspersji do każdego genu lub miRNA.
    1. Wykonaj dokładny test, aby porównać ekspresję genów między grupami. Pobierz zmianę log2 krotności (log2FC), liczbę logarytmów na milion (logCPM), wartości P i wartości P skorygowane o współczynnik fałszywych odkryć (FDR) dla każdego gena o zróżnicowanej ekspresji35. Zdefiniuj istotność statystyczną jako P < 0,05 z progiem krotnej zmiany |log2(FC)| > 1.

5. Przewidywanie długich niekodujących RNA i informacyjnych celów RNA mikroRNA o zróżnicowanej ekspresji

  1. Pobierz sekwencje DEMis i DEL z odpowiednich baz danych. Użyj narzędzi do przewidywania interakcji miRNA-lncRNA miRanda36 i RNAhybrid37 , aby zidentyfikować potencjalne interakcje między DEMis i DEL. Uzyskaj pary interakcji miRNA-mRNA z bazy danych miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Budowa długiego niekodującego RNA - mikroRNA - sieci regulacyjnej informacyjnego RNA

  1. Skonstruuj sieć regulatorową lncRNA-miRNA-mRNA w oparciu o hipotezę ceRNA39,40.
    1. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona (PCC) między DEL i DEM. Wybierz pary lncRNA-mRNA do dalszej analizy, jeśli PCC > 0,99, a P < 0,01.
    2. Dla każdej pary lncRNA-mRNA o współekspresji zidentyfikuj wspólne miRNA ukierunkowane na oba transkrypty. Użyj tych współdzielonych miRNA do skonstruowania sieci koekspresji miRNA-mRNA-lncRNA.
    3. Użyj Cytoscape (https://cytoscape.org/) do skonstruowania i wizualizacji sieci interakcji lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Wykonaj następujące kroki:
      1. Użyj wtyczki CytoNCA, aby obliczyć centralność między węzłami (BC), centralność bliskości (CC) i centralność stopnia (DC) dla każdego węzła.
      2. Wybierz geny, których wyniki centralności przekraczają mediany wartości wszystkich trzech wskaźników, aby skonstruować ostateczną kluczową podsieć.
      3. Użyj wtyczki CytoHubba, aby zidentyfikować 10 najważniejszych genów piasty w sieci interakcji białko-białko i wyodrębnić kluczowe węzły zidentyfikowane w kroku 2.
      4. Oblicz stopień węzła dla każdego składnika sieci ceRNA.

7. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego

  1. Wykonaj analizy wzbogacenia szlaku GO i KEGG w celu dalszego zbadania funkcji RNA43. Użyj pakietu clusterProfiler (https://bioconductor.org/), aby zwizualizować wyniki wzbogacania44.

8. Analiza Western blot w celu wykrycia poziomów ekspresji kluczowych białek zaangażowanych w szlaki związane z lncRNA - ceRNA

  1. W głębokim znieczuleniu szybko usuń cały mózg. Po ostrożnym usunięciu opon mózgowych i naczyń krwionośnych wyizoluj tkankę korową w obszarze zawału szczura45. Użyj cienkich nożyczek, aby pokroić tkankę na małe kawałki, upewniając się, że każdy kawałek waży od 50 mg do 100 mg. Przenieść zważone próbki tkanek do wstępnie schłodzonych probówek homogenizacyjnych.
    1. Przygotować bufor do lizy białek w stosunku objętościowym PMSF do buforu do lizy RIPA wynoszącym 1:100 (stężenie końcowe 1 mM PMSF). Dodać bufor do lizy w proporcji 200 μl na 20 mg tkanki. Dokładnie homogenizować próbki za pomocą sterylizowanego termicznie homogenizatora szklanego, aż tkanka zostanie drobno rozbita.
    2. Inkubować homogenaty na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co 10 minut, aby ułatwić pełną lizę. Odwirować próbki w temperaturze 28 656,6 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant zawierający białko całkowite, nie naruszając osadu.
  2. Dodać 5× bufor ładujący do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) do próbki białka w stosunku 1:4 (1 objętość 5× buforu na 4 objętości próbki białka). Po rozcieńczeniu końcowe stężenie robocze bufora ładującego SDS-PAGE wynosi 1×.
    1. Dokładnie wymieszaj i podgrzej we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, aby całkowicie zdenaturować białka. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Załadować 30 μg każdej próbki do studzienek żelowych SDS-PAGE.
    2. Wykonaj elektroforezę w dwóch etapach: zastosuj 80 V przez 30 minut, aby rozpuścić białka w żelu do układania, a następnie zwiększ do 120 V przez 1 godzinę, aby oddzielić białka w rozdzielczym żelu.
  3. Przygotuj wstępnie przyciętą bibułę filtracyjną i membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) dopasowane do rozmiaru żelu. Namocz membranę PVDF w metanolu na 3 minuty, aby ją aktywować. Zanurzyć zarówno membranę PVDF, jak i bibułę filtracyjną w buforze transferowym na 5 minut.
    1. Zamontuj kanapkę transferową w następującej kolejności (od góry do dołu): płyta anodowa, trzy warstwy bibuły filtracyjnej, membrana PVDF, żel, trzy warstwy bibuły filtracyjnej, płyta katodowa. Upewnij się, że warstwy żelu, membrany i bibuły filtracyjnej są prawidłowo wyrównane. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza na każdym kroku, aby zapewnić równomierny transfer.
  4. Natychmiast po przeniesieniu białka przepłukać membranę PVDF w zachodnim buforze płuczącym przez 5 minut, aby usunąć resztki buforu transferowego. Zablokuj membranę w temperaturze pokojowej na 2 godziny, delikatnie potrząsając w zachodnim buforze blokującym zawierającym 5% odtłuszczonego mleka w proszku lub użyj 5% BSA w przypadku wykrycia fosforylowanych białek.
  5. Po zablokowaniu inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym (1:1000) w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (1:10 000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Wykonaj detekcję chemiluminescencyjną w ciemnym pomieszczeniu, aby zapobiec interferencji światła. Umieść białkową stronę membrany PVDF płasko na środku płytki naświetlającej w automatycznym systemie obrazowania.
    1. Bezpośrednio przed użyciem wymieszać równe objętości odczynnika A i odczynnika B ECL w czystej probówce wirówkowej. Mieszany roztwór ECL nanieść równomiernie na powierzchnię membrany, aby zainicjować reakcję luminescencyjną.
    2. Po 1-2 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej delikatnie usuń nadmiar płynu, nie naruszając powierzchni membrany. Dostosuj parametry ekspozycji w systemie obrazowania do intensywności luminescencji, aby zoptymalizować przechwytywanie sygnału.

9. Analiza statystyczna

  1. Analizuj wyniki Western blot za pomocą oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo wartości szarości pasma. Użyj GraphPad Prism do analizy statystycznej danych eksperymentalnych. Wyrazić wszystkie dane jako średnią ± odchylenie standardowe (x ± SD). Oceń różnice statystyczne między grupami za pomocą niesparowanego testu t.
    1. Wprowadź dane z dwóch niezależnych grup próbek do tabeli danych oprogramowania, przy czym każda grupa odpowiada oddzielnej kolumnie, a próbki są od siebie niezależne. Sprawdź normalność, wybierając "Testy normalności i symetrii" w funkcji "Analizuj" i stosując test Shapiro-Wilka do obu grup.
    2. Jeśli P > 0,05 dla obu grup, należy wziąć pod uwagę dane o rozkładzie normalnym. Na tej podstawie wybierz opcję Niesparowany test t w obszarze Testy t w funkcji Analizuj , aby przeprowadzić analizę. Istotność statystyczną należy zdefiniować jako P < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki eksperymentalne weryfikacji wskaźnika sukcesu dla każdej grupy modeli szczurzych przedstawiono na rysunku 1. Po modelowaniu na szczurach przeprowadzono ocenę funkcji neurologicznych (ryc. 1A). Grupa modelowa wykazywała poważne deficyty neurologiczne, a osoby z wynikami od 1 do 3 zostały włączone do kolejnych eksperymentów. Ryciny 1B i C pokazują wyniki barwienia TTC, przy czym kolor czerwony oznacza normalną tkankę mózgową, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogenezy udaru mózgu i zidentyfikować potencjalne cele diagnostyczne i terapeutyczne, przeprowadzono analizy RNA-Seq i małych RNA-Seq (sRNA-Seq) na tkankach mózgowych szczurów po MCAO. Badanie to ma na celu przede wszystkim zbadanie złożonych sieci regulacyjnych obejmujących lncRNA, miRNA i mRNA. Przeprowadzono kompleksową analizę zestawów danych RNA-Seq i sRNA-Seq z tkanek mózgowych szczurów indukowanych MCAO w celu wyjaśnienia sieci regulacyjnej lncRNA-miRNA-mRNA. Sk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy stwierdzają, że nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt był wspierany przez projekt finansowania rezerwowego kandydata na lidera akademickiego prowincji Anhui (nr 2022H287), kluczowy projekt badań nad zdrowiem prowincji Anhui (nr referencyjny: AHWJ2022a013), kluczowy projekt badawczy nauk przyrodniczych Anhui Provincial College (nr 2023AH050745) oraz projekt wybitnych talentów w dziedzinie higieny i zdrowia w prowincji Anhui (nr ahsjhmypygc20230074).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% (w/v) roztwór barwiący TTCBeijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd. 20230805Barwienie TTC
4% (w/v) roztwór paraformaldehyduBeyotimeZobacz materiał P0099Utrwalona tkanka mózgowa
40 samców szczurów SD klasy SPFHagzhou Ziyuan Laboratorium Hodowli Zwierząt Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004zwierzę laboratoryjne
5% odtłuszczonego mleka w proszkuPhygene naukowyPH1519 powiedział:WB
system elektroforezy agarozowejBeijing Liuyi Biotechnology Co., Sp. z o.o.DYCP-44PWB
Automatyczny przyrząd do ekspozycjiShanghai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Automatyczny miernik ekspozycjiShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Automatyczna kostkarka do loduChangshu City Xueke Urządzenie elektryczne Co., LTDIMS-20 (wersja angielska)WB
KalmodulinaPowinowactwo49B2443 powiedział:WB
KameraPowinowactwoNumer katalogowy: 14G0796WB
wirówkaHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
Pakiet clusterProfilerBioprzewodnikclusterProfiler_4.17Analizy wzbogacenia
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
Zestaw do ultraczułej chemiluminescencji ECLOstrze biologiczneBL520B (Zobacz materiał BL520B)WB
Elektryczny termostatyczny piec do suszenia powietrzaShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070 powiedział:WB
Aparatura do elektroforezyShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300 (płyta EPS300)WB
aparatura do elektroforezyNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.EPS300 (płyta EPS300)WB
zbiornik do elektroforezyNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.VE-180 powiedział:WB
GABRA6 powiedział:PowinowactwoNumer katalogowy: 46V5371WB
Kozia IgG Anty-MyszZs-BIO142637WB
Kozia IgG Anty-KróliczaZs-BIO139931WB
GRIA3PowinowactwoNumer katalogowy: 0C33051WB
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkościAnhui Jiawen sprzęt instrumentalny Co., LTDJW-3021HRWB
System HiSeq 2500Iluminacja/Sekwencjonowanie RNA o wysokiej przepustowości
Oprogramowanie ImageJNarodowe Instytuty ZdrowiaObraz J 1,54 tys.Barwienie TTC
Magnetyczne mieszadło grzewczeMiasto Changzhou i fabryka instrumentówJJ-79-1WB
MikropipetaNiemcy Eppendorf/WB
Mikrowirówka o normalnej temperaturzeHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RPowinowactwoNumer katalogowy: 2D38248 powiedział:WB
pipetaEppendorf powiedział:0,5-10ulWB
PKC (PKC)PowinowactwoNumer katalogowy: 17E3745WB
wstępnie wybarwiony marker białkowyOstrze biologiczneBL712CWB
Membrana PVDFMiliporyIPVH00010WB
Zestaw do usuwania rRNA Ribo-ZeroIllumina, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone/Ekstrakcja RNA
Lizat RIPAOstrze biologiczneBL504AWB
Pentobarbital soduBeijing Think-Far Technology Co., Sp. z o.o.MERCKZnieczulenia
Przyrząd do przenoszenia membranyNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.VE-186 powiedział:WB
Aparatura transbłonowaShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186 powiedział:WB
β-aktynaZs-BIOZobacz materiał 19AW0505 TGLWB

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X. Correlations between serum cxcl9/12 and the severity of acute ischemic stroke, a retrospective observational study. Neuropsychiatr Dis Treat. 19, 283-292 (2023).
  3. Wang, J., Shan, A., Shi, F., Zheng, Q. Molecular and clinical characterization of ang expression in gliomas and its association with tumor-related immune response. Front Med (Lausanne). 10, 1044402(2023).
  4. Ma, W., et al. Effects of ischemic postconditioning and long noncoding RNAs in ischemic stroke. Bioengineered. 13 (6), 14799-14814 (2022).
  5. Deng, Y., et al. High-throughput sequencing to investigate lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA networks underlying the effects of beta-amyloid peptide and senescence on astrocytes. Front Genet. 13, 868856(2022).
  6. Li, R. B., Yang, X. H., Zhang, J. D., Cui, W. Gas6-as1, a long noncoding RNA, functions as a key candidate gene in atrial fibrillation-related stroke determined by ceRNA network analysis and WGCNA. BMC Med Genomics. 16 (1), 51(2023).
  7. Shu, J., Yang, L., Wei, W., Zhang, L. Identification of programmed cell death-related gene signature and associated regulatory axis in cerebral ischemia/reperfusion injury. Front Genet. 13, 934154(2022).
  8. Zou, J. B., et al. Reconstruction of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in cerebral infarction. Sci Rep. 9 (1), 12176(2019).
  9. Zheng, H. Y., et al. Longitudinal transcriptome analyses show robust T cell immunity during recovery from COVID-19. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 294(2020).
  10. Lu, Z., Deng, M., Ma, G., Chen, L. Trim38 protects h9c2 cells from hypoxia/reoxygenation injury via the traf6/tak1/nf-κb signalling pathway. PeerJ. 10, e13815(2022).
  11. Zhang, C., et al. Long noncoding RNAs in intracerebral hemorrhage. Front Mol Neurosci. 16, 1119275(2023).
  12. Wei, R., Zhang, L., Hu, W., Wu, J., Zhang, W. Long noncoding RNA ak038897 aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury via acting as a cerna for mir-26a-5p to target dapk1. Exp Neurol. 314, 100-110 (2019).
  13. Retraction: LncRNA snhg1 regulates cerebrovascular pathologies as a competing endogenous RNA through hif-1α/vegf signaling in ischemic stroke. J Cell Biochem. 126 (4), e70017(2025).
  14. Yu, Z., et al. Tnf-α stimulation enhances the neuroprotective effects of gingival MSCs-derived exosomes in retinal ischemia-reperfusion injury via the meg3/mir-21a-5p axis. Biomaterials. 284, 121484(2022).
  15. Li, Y., et al. Profiling immune cell-related gene features and immunoregulatory ceRNA in ischemic stroke. Mol Biomed. 5 (1), 72(2024).
  16. Fan, R., et al. Integrated analysis of circRNA-associated ceRNA network in ischemic stroke. Front Genet. 14, 1153518(2023).
  17. Cheng, L., Zhao, Y., Ke, H. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA cerna network in ischemic stroke. Heliyon. 10 (9), e29651(2024).
  18. Li, S., et al. Construction of lncRNA-mediated ceRNA network for investigating immune pathogenesis of ischemic stroke. Mol Neurobiol. 58 (9), 4758-4769 (2021).
  19. Wang, X. Z., et al. Construction of circRNA-mediated immune-related ceRNA network and identification of circulating circRNAs as diagnostic biomarkers in acute ischemic stroke. J Inflamm Res. 15, 4087-4104 (2022).
  20. Movassaghi, S., et al. Effect of pentoxifylline on ischemia-induced brain damage and spatial memory impairment in rats. Iran J Basic Med Sci. 15 (5), 1083-1090 (2012).
  21. Saund, J., Dautan, D., Rostron, C., Urcelay, G. P., Gerdjikov, T. V. Thalamic inputs to dorsomedial striatum are involved in inhibitory control: Evidence from the five-choice serial reaction time task in rats. Psychopharmacology (Berl). 234 (16), 2399-2407 (2017).
  22. Fei, C., et al. Effects of tao hong si wu decoction on circular rna expression profiles in rats with middle cerebral artery occlusion. Chinese Pharmacological Bulletin. 40 (05), 954-963 (2024).
  23. Ma, R., et al. Correlation of thrombin and lc3II/I expression in different ischemic phases and different brain regions in the MCAO model rats. J Hunan Univ Chinese Med. 42 (06), 899-905 (2022).
  24. Li, S., et al. Regulation of nr4a1 by taohong siwu decoction inhibits endothelial cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120285(2025).
  25. Ji, Z. J., et al. Neuroprotective effect of taohong siwu decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury via mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway. Front Pharmacol. 13, 910217(2022).
  26. Duan, X., et al. RNA sequencing for gene expression profiles in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Biomed Res Int. 2018, 2465481(2018).
  27. Duan, X., et al. Identification and functional analysis of microRNAs in rats following focal cerebral ischemia injury. Mol Med Rep. 19 (5), 4175-4184 (2019).
  28. Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Res. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  29. Ji, X., et al. A comprehensive rat transcriptome built from large-scale RNA-seq-based annotation. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8320-8331 (2020).
  30. Zheng, Y., et al. Npinter v5.0: NcRNA interaction database in a new era. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D232-D239 (2023).
  31. Oliveira, L. A., et al. The widespread misuse of stringtie's gene identifier tags as de facto gene symbols does not allow consistent gene identification in published research. Gene. 954, 149440(2025).
  32. Pertea, M., et al. Stringtie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat Biotechnol. 33 (3), 290-295 (2015).
  33. Zaghlool, A., et al. Characterization of the nuclear and cytosolic transcriptomes in human brain tissue reveals new insights into the subcellular distribution of RNA transcripts. Sci Rep. 11 (1), 4076(2021).
  34. Zhang, W., et al. Transcriptomic data of peach varieties with different chilling requirement levels. BMC Genom Data. 25 (1), 99(2024).
  35. Chamorro Petronacci, C. M., et al. Identification of prognosis-associated microRNAs in HNSCC subtypes based on the TCGA dataset. Medicina (Kaunas). 56 (10), 535(2020).
  36. Wang, X., et al. Exosomes activate hippocampal microglia in atrial fibrillation through long-distance heart-brain communication. BMC Cardiovasc Disord. 24 (1), 627(2024).
  37. Jiang, P., et al. Circrna-phf21a_0002 promotes pyroptosis to aggravate hepatic ischemia/ reperfusion injury by sponging let-7b-5p. Heliyon. 10 (16), e34385(2024).
  38. Faraldi, M., et al. Circulating biomarkers associated with walking performance in elderly subjects: Exploring miRNAs, metabolic and inflammatory biomarkers. Geroscience. 47 (3), 3977-3996 (2025).
  39. Jiang, H., et al. Reconstruction and analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in rheumatoid arthritis. Mol Biosyst. 13 (6), 1182-1192 (2017).
  40. Alipour, S., et al. Innovative targets of the lncRNA-miRNA-mRNA network in response to low-dose aspirin in breast cancer patients. Sci Rep. 12 (1), 12054(2022).
  41. Ono, K., et al. Cytoscape web: Bringing network biology to the browser. Nucleic Acids Res. 53 (W1), W203-W212 (2025).
  42. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  43. Huckvale, E. D., Moseley, H. N. B. Predicting the pathway involvement of all pathway and associated compound entries defined in the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Metabolites. 14 (11), (2024).
  44. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  45. Ueno, Y., et al. Axonal outgrowth and dendritic plasticity in the cortical peri-infarct area after experimental stroke. Stroke. 43 (8), 2221-2228 (2012).
  46. Arkelius, K., et al. Lox-1 and mmp-9 inhibition attenuates the detrimental effects of delayed rt-PA therapy and improves outcomes after acute ischemic stroke. Circ Res. 134 (8), 954-969 (2024).
  47. Hou, L., et al. Itgam is a critical gene in ischemic stroke. Aging (Albany, NY). 16 (8), 6852-6867 (2024).
  48. Miao, M., Lyu, M., Zhong, C., Liu, Y. Correlation between mmp9 promoter methylation and transient ischemic attack/mild ischemic stroke with early cognitive impairment. Clin Interv Aging. 18, 1221-1232 (2023).
  49. Li, W., et al. Clec7a knockdown alleviates ischemic stroke by inhibiting pyroptosis and microglia activation. J Integr Neurosci. 23 (12), 219(2024).
  50. Shi, Y., et al. C5ar1 mediates the progression of inflammatory responses in the brain of rats in the early stage after ischemia and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 12 (21), 3994-4006 (2021).
  51. Yan, Y., Chen, L., Zhou, J., Xie, L. Snhg12 inhibits oxygen-glucose deprivation-induced neuronal apoptosis via the mir-181a-5p/negr1 axis. Mol Med Rep. 22 (5), 3886-3894 (2020).
  52. Wei, X. Y., et al. Long noncoding RNA RPL34-AS1 ameliorates oxygen-glucose deprivation-induced neuronal injury via modulating miR-223-3p/igf1r axis. Hum Cell. 35 (6), 1785-1796 (2022).
  53. Zhou, X., et al. Long noncoding RNA norad protects against cerebral ischemia/reperfusion injury-induced brain damage, cell apoptosis, oxidative stress, and inflammation by regulating miR-30a-5p/ywhag. Bioengineered. 12 (2), 9174-9188 (2021).
  54. Gao, H., et al. Long noncoding RNA Peg13 alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal mice via mir-20a-5p/xiap axis. Neurochem Res. 47 (3), 656-666 (2022).
  55. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  56. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-seq by poly (a) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15 (1), 419(2014).
  57. Wang, C., et al. The construction and analysis of lncRNA-miRNA-mRNA competing endogenous RNA network of Schwann cells in diabetic peripheral neuropathy. Front Bioeng Biotechnol. 8, 490(2020).
  58. Pillai-Kastoori, L., et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 295 (4), 926-939 (2020).
  59. Liu, Q., et al. Mir-190a potentially ameliorates postoperative cognitive dysfunction by regulating tiam1. BMC Genomics. 20 (1), 670(2019).
  60. Vella, D., Zoppis, I., Mauri, G., Mauri, P., Di Silvestre, D. From protein-protein interactions to protein co-expression networks: A new perspective to evaluate large-scale proteomic data. EURASIP J Bioinform Syst Biol. 2017 (1), 6(2017).
  61. Panfil, K., Deavours, A., Kirkpatrick, K. Effects of the estrous cycle on impulsive choice and interval timing in female rats. Horm Behav. 149, 105315(2023).
  62. Ouyang, S., et al. Comprehensive bioinformatics analysis to reveal key RNA targets and hub competitive endogenous RNA network of keratoconus. Front Genet. 13, 896780(2022).
  63. Chen, X., et al. Cx3cl1/cx3cr1 axis attenuates early brain injury via promoting the delivery of exosomal microRNA-124 from neuron to microglia after subarachnoid hemorrhage. J Neuroinflammation. 17 (1), 209(2020).
  64. Karim, M. R., et al. Explainable AI for bioinformatics: Methods, tools and applications. Brief Bioinform. 24 (5), bbad236(2023).
  65. Shainer, I., et al. Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology. Nature. 638 (8052), 1023-1033 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

udar niedokrwienny m zguekspresja lncRNAekspresja miRNAsie ceRNAwzbogacenie funkcjonalnesygnalizacja wapniowasygnalizacja poprzez po czenia szczelinowewestern blot

Powiązane artykuły