Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Summary

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Abstract

W badaniach nad patogenezą poostrego zapalenia trzustki (PPDM-A) kluczowym obszarem jest nieprawidłowa dwukierunkowa komunikacja między komórkami acynarnymi trzustki (PAC) a komórkami wysp. Jednak uwiecznione linie komórkowe nie są w stanie odtworzyć warunków patofizjologicznych, co czyni ekstrakcję wysokiej jakości komórek pierwotnych kluczową. Obecne metody ekstrakcji pierwotnych wysetek z myszy opierają się głównie na perfuzji trzustki in vivo poprzez kanilowaną przewodów żółciowych, co stanowi wysoką barierę techniczną i nie sprzyja działaniu przez badaczy bez doświadczenia.

To badanie zmodyfikowało metodę, eliminując potrzebę złożonej, in vivo perfuzji. Myszy klasy SPF C57BL/6J (6-8 tygodni) zostały znieczulone i uśpione, a następnie poddane izolacji trzustki. Trzustka była trawiona in vitro kolagenazą P; główne wysepki oddzielono za pomocą wirowania gradientu gęstości Ficolla, a komórki acynarne uzyskano przez filtrację i wirowanie przez sito komórkowe. Żywotność i funkcjonowanie komórek oceniano za pomocą barwienia kalceiny/jodku propidium (kalceina/PI), testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą oraz wykrywania aktywności amylazy.

Wyniki wykazały, że zmodyfikowana metoda była łatwa w obsłudze: plon na mysz wynosił (120 ± 5) wysetek pierwotnych oraz 1,6-1,95 × 10⁷ komórek anickich; wskaźniki żywotności wysep i komórek acynarowych wynosiły odpowiednio (97,52 ± 0,16)% oraz (96,55 ± 0,95%). Ponadto wysepki wykazywały prawidłową zdolność wydzielania insuliny, a komórki acinne były wrażliwe na stymulację ceruleiną. Ta metoda jest prosta i niezawodna, zapewniając wykonalne ramy do badania interakcji między trustką a endokryną oraz PPDM-A. Jednak ma ona ograniczenia, takie jak niezweryfikowane zastosowanie u szczurów.

Introduction

Ostre zapalenie trzustki (AP) może zakłócać funkcjonowanie układu naczyniowego trzustki poprzez wiele szlaków, takich jak uszkodzenie przydziela trzustki czy kaskady zapalne, wywołując tym samym poostre zapalenie trzustki (PPDM-A)^1,2. Obecnie główna patogeneza PPDM-A pozostaje niejasna, a nieprawidłowa dwukierunkowa komunikacja między przedziałami endokrynnym a egzokrynowym trzustki jest kluczowym obszarem badań³. Chociaż istniejące uwiecznione linie β-komórkowe (np. INS-1, MIN6) są powszechnie wykorzystywanymi narzędziami do modelowania komórek cukrzycowych in vitro, ich natura pochodząca z nowotworów prowadzi do istotnych różnic w stosunku do normalnych komórek pierwotnych wysetek pod względem reakcji na glukozę i heterogeniczności komórkowej. W rezultacie nie mogą one naprawdę odtworzyć stanu patofizjologicznego w mikrośrodowisku ostrego zapalenia trzustki ^4,5. Dlatego uzyskanie wysokiej jakości pierwotnych wysepek i komórek acynarnych stało się podstawową podstawą techniczną do wyjaśnienia mechanizmu ich oddziaływania.

Obecne metody izolowania pierwotnych wysetek u myszy opierają się głównie na technologii kanilacji przewodów, która polega na precyzyjnej lokalizacji i kanilowaniu przewodu żółciowego w celu wstrzyknięcia roztworu kolagenazy do mięczarniego trzustki w celu perfuzji in vivo ^6,7. Jednak w izolacji pierwotnych wysepek od noworodkowych myszy Huang i ^in.8 osiągnęli doskonałe rezultaty, stosując trawienie in vitro bez perfuzji trzustki in vivo. Na podstawie praktycznego doświadczenia naszego zespołu badawczego, wykonanie optymalnej perfuzji trzustki przez kaniulację przewodów żółciowych jest trudne do szybkiego i skutecznego wykonania bez specjalistycznego szkolenia. Zainspirowani metodą izolowania pierwotnych wysepek od noworodkowych myszy, nasz zespół zmodyfikował protokół ekstrakcji, aby był prostszy i bardziej dostępny dla badaczy bez doświadczenia z perfuzją. To zmodyfikowane podejście stanowi również prostszą alternatywę dla izolowania pierwotnych wysepek od młodych myszy lub tych z delikatnymi przewodami żółciowymi. Ponadto ta metoda oferuje korzyści zarówno w zakresie efektywności izolacji (ilości), jak i czystości (jakości) wysepek i komórek acynarycznych. Pozwala to badaczom prowadzić eksperymenty w tym samym kontekście patologicznym i fizjologicznym, ułatwiając dogłębną analizę mechanizmu interakcji między wyspami a komórkami acynarowymi.

Metoda wymaga ścisłej kontroli czasu trawienia trzustki; Drobne rozdrobnienie trzustki przed trawieniem to również kluczowy krok. Dodatkowo należy zwrócić uwagę na intensywność mechanicznej dyspersji tkanki trzustkowej po trawieniu. Wszystkie te czynniki wpływają na ilość i jakość izolowanych wysepek oraz komórek acynarnych. Ta metoda nie została zatwierdzona u szczurów i obecnie nie może być skalowana do produkcji.

Protocol

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki lub Komisję Etyki Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Szpitala w Changhai (nr zatwierdzenia: CHEC (A.E)-2025-026). Myszy klasy SPF C57BL/6J (6-8 tygodni, ważące 18-25 g, samce lub samice, n = 3) były utrzymywane w cyklu światła/ciemności 12 godzin z swobodnym dostępem do jedzenia (dieta utrzymawcza) i wody.

Ostre przedmioty odpadowe, takie jak strzykawki i igły, powinny być zbierane w dedykowanych pojemnikach na ostre przedmioty laboratoryjne i utylizowane przez wykwalifikowane agencje zawodowe. Zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi Etyki Opieki i Użycia Zwierząt Nieludzkich w badaniach, tusze myszy powinny być umieszczane w dedykowanej zamrażarce na tuszą myszy laboratorium i spalane przez profesjonalne agencje.

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Roztwory takie jak sterylne medium gradientowe gęstości powinny być zbierane w "Bębnie do zbierania odpadów chemicznych" laboratorium. Wszystkie odpady chemiczne mają być utylizowane przez wykwalifikowane agencje profesjonalne, zgodnie z ustaleniami laboratorium.

1. Przygotowanie roztworu kolagenazy P
   1. W probówce wirówki o pojemności 50 mL kolejno ważyć 25 mg kolagenazy P, 42 mg bezwodnego chlorku wapnia oraz 0,02 g inhibitora trypsyny. Dodaj 45,5 mL roztworu Hank's Balanced Salt Solution i 500 μL roztworu HEPES, a następnie wiruj aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizuj roztwór przez filtrację przez filtr 0,22 μm, a następnie przelej przefiltrowany roztwór do nowej sterylnej rurki wirówki o pojemności 50 mL. Daje to roztwór kolagenazy P o stężeniu 0,5 mg/mL, który jest stosowany do dalszego trawienia tkanki trzustkowej.
2. Obróbka roztworu sterylnego gradientu gęstości
   1. Przefiltruj roztwór gradientu gęstości sterylnej przez filtr 0,22 μm do sterylizacji, a następnie przelej go do nowej sterylnej rurki wirówki o pojemności 50 mL. Wyraźnie oznacz informacje o roztworze i przechowuj je w temperaturze 4 °C na późniejsze użycie. Od tego momentu nazywa się go "Ficoll".
3. Przygotowanie bufora stopowego i medium kompletnego
   1. Dodaj 10% surowicy bydła płodowej (FBS) oraz 1% roztwór penicylin-streptomycyny odpowiednio do pustego medium DMEM i RPMI-1640, aby przygotować DMEM kompletne medium i RPMI-1640 kompletne (również bufor stop dla trawienia trzustki). Wyraźnie oznacz informacje o roztworze i przechowuj w temperaturze 4 °C na późniejsze użycie.
4. Przygotowanie roztworów glukozy o różnych stężeniach
   1. W probówce wirówki o pojemności 50 mL dodaj 50 ml buforu oczyrowęglanowego HEPES Krebs-Ringer (KRBH) oraz 0,25 g albuminy surowicy bydłej (BSA)-V, aby przygotować roztwór KRBH zawierający 0,5% BSA. Następnie w 28,33 mL roztworu KRBH zawierającego 0,5% BSA dodaj 168 μL glukozy (1 M) i 1,5 mL roztworu chlorku wapnia (50 mM), aby przygotować roztwór glukozy o pojemności 5,6 mM. W 9,28 mL roztworu KRBH zawierającego 0,5% BSA dodaj 220 μL glukozy (1 M) oraz 500 μL roztworu chlorku wapnia (50 mM), aby przygotować roztwór glukozy o pojemności 22 mM.

2. Izolacja wysepek trzustkowych i komórek acynarnych (PAC)

UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą przejść sterylizację autoklawową.

1. Dodaj roztwór Hanka Zrównoważonej Soli i Roztwór kolagenazy P do płytki 12-dołkowej. A następnie dodaj 3 mL roztworu kolagenazy P do rurki wirówki o pojemności 50 mL do dalszego trawienia.
   UWAGA: Dodaj 2 mL roztworu Zrównoważonej Soli Hanka do trzech dołków oraz 2 mL roztworu kolagenazy P do jednego dołku.
2. Waż i znieczulaj mysz przez podanie wewnątrzotrzewnej 1,25% tribrometanolu w dawce 0,025 mL/g przed zabiegiem, sprawdź stan znieczulenia, szczypiąc podkładkę stóp myszy: głębokość znieczulenia zależy od stopniowego spadania oddechu i braku reakcji na szczypanie poduszki stopy. Gdy głęboka znieczulenie zostanie potwierdzone, uśpij myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Zanurz myszy w 75% etanolu na 5 minut w celu dezynfekcji, a następnie przenieś je do szafki z zabezpieczeniem biologicznym na izolację trzustki.
   UWAGA: Tribrometanol (1,25%) jest dostarczany jako gotowy roztwór przy zakupie; nie jest wymagane ręczne przygotowanie. Naukowcy muszą nosić rękawiczki i maseczki przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli podczas wstrzyknięcia 1,25% tribrometanolu nastąpi kontakt ze skórą, natychmiast usuń pozostałości odczynnika bezwodnym etanolem, spłuknij przez 5 minut bieżącą wodą i nałóż krem nawilżający łagodzący suchość. W badaniu nie ma udziału żadnych substancji. Odczynniki chemiczne odpadów, takie jak 1,25% tribrometanol, powinny być zbierane w dedykowanych, szczelnie zamkniętych pojemnikach oznaczonych jako "Niebezpieczne Odpady Chemiczne".
3. Wykonaj nacięcie w kształcie litery "V", aby otworzyć jamę brzuszną myszy. Ciemnoczerwonym narządem limfoidalnym w lewym obszarze hipochondrycznym jest śledziona, a białym organem przymocowanym do śledziony jest trzustka. Ostrożnie wykonaj rozwarstwienie trzustki wzdłuż dolnej krawędzi żołądka oraz połączenia trzustkowo-dwunastnicy.
4. Przemyj izolowaną tkankę trzustkową w roztworze Hank's Balanced Salt Solution i usuń pozostałości przyczepów krezkowych, śledziony oraz tkanki tłuszczowej okołotrzncowej.
5. Przenieś wcześniej przetworzoną trzustkę na płytkę z 12 dołkami zawierającą 2 mL roztworu kolagenazy P. Trzymaj trzustkę na miejscu pęsetą lewą ręką, a strzykawką o pojemności 1 ml prawą ręką wstrzykuj roztwór kolagenazy P do przydusznego miąższa trzustki, aż tkanka trzustkowa stanie się przezroczysta i obrzękowa.
   UWAGA: Objętość roztworu kolagenazy P do perfuzji wynosi 600-800 μL.
6. Szybko pokrój trzustkę na kawałki tkanki o powierzchni 1-2 mm³ nożyczkami chirurgicznymi.
   UWAGA: Rozmiar fragmentów tkanki jest mniej więcej równy wewnętrznej średnicy standardowej pipety o pojemności 200 μL.
7. Odetnij dalszy 1-1,5 cm końcówki pipety o pojemności 1 mL (aby powiększyć otwór) i użyj tej zmodyfikowanej końcówki do przeniesienia fragmentów tkanki trzustkowej razem z 2 mL roztworu kolagenazy P do rurki wirówki o pojemności 50 mL z wstępnym załadowaniem 3 mL roztworu kolagenazy P.
8. Inkubuj rurkę wirówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 12 minut, delikatnie potrząsając rurką co 5-6 minut w tym czasie.
   UWAGA: Celem potrząsania rurką wirówki jest zapewnienie pełnego kontaktu między tkanką trzustkową a roztworem kolagenazy P.
9. Dodaj 10 ml kompletnego medium RPMI-1640, aby zakończyć działanie trawienne roztworu kolagenazy P.
10. Pipetować granulat wielokrotnie pipetą Pasteura o pojemności 5 mL (15-20 ruchów w górę i w dół), aż nie pozostaną widoczne duże grudki tkanki.
11. Dodaj 10 mL kompletnego medium RPMI-1640, następnie wiruj w wirówce 180 × g przez 2 minuty w 4 °C i wyrzuć supernatant.
12. Ponownie zawiesić śrut z 20 mL RPMI-1640 pełnego medium. Przefiltruj zawiesinę przez sito o średnicy 40 oczek, a następnie wiruj w 180 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
13. Delikatnie wyrzuć supernatant, dodaj 20 mL roztworu Ficoll, aby ponownie zawiesić granulat, i powoli dodaj 15 ml pełnowartościowego medium RPMI-1640.
    UWAGA: W tym momencie można zaobserwować wyraźną ciecz.
14. Delikatnie wiruj w 640 × g przez 20 minut w 25 °C.
    UWAGA: Unikaj gwałtownych wstrząsów podczas wirowania, aby zapobiec zakłóceniom interfejsu.
15. Ostrożnie wyjmij rurkę wirówki i zasysaj górną warstwę czerwonego medium pipetą Pasteura o pojemności 5 mL. Następnie ostrożnie zasysaj ciecz zawierającą wysce na granicy warstwy cieczy i przelej ją do nowej rurki wirówki o pojemności 50 mL. Dodaj 20 mL pełnego medium RPMI-1640, wiruj w wirówce 180 × g przez 2 minuty w 4 °C i wyrzuć supernatant.
16. Ponownie zawiesić granulkę z 20 mL pełnego medium RPMI-1640, wirować w 180 × g przez 2 minuty w 4 °C i wyrzucić supernatant.
17. Ponownie zawiesić pellet z 10 mL kompletnego medium RPMI-1640 i przenieść go do naczynia do hodowli komórek o średnicy 60 mm.
18. Pod odwróconym mikroskopem biologicznym (powiększenie 100x) ręcznie wybieraj wysepki za pomocą pipety 20 μL. Przenieś wysewki na 24-dołkową płytę do hodowli komórek z preadencją 500 μL pełnego medium RPMI-1640 na dołek.
19. Usuń warstwę roztworu Ficoll, ponownie zawiesij granulkę (od kroku 2.15) z 10 mL kompletnego medium DMEM, przefiltruj przez sitko ogniwow 100 μm, wiruj w 180 × g przez 2 minuty w 4 °C i wyrzuć supernatant.
20. Ponownie zawiesić pellet z 10 mL kompletnego medium DMEM, wirować w 180 × g przez 2 minuty w 4 °C i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawiesz pellet z 5 mL kompletnego medium DMEM na potrzeby kolejnych eksperymentów.

3. Wykrywanie żywotności wysepek trzustkowych i komórek acynarnych

1. Przenieś izolowane wysepki oraz odpowiednią liczbę komórek acynarnych na płytki hodowlane z 12 dołkami/24 dołkami zawierającymi odpowiednio 1 mL kompletnego medium RPMI-1640 i 1 mL kompletnego DMEM. Umieść płytki w inkubatorze komórek o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 15 minut, aby się wyrównać.
2. Wirować płytki hodowli komórek 12-dołkowe/24-dołkowe w temperaturze 180 × g przez 30 sekund w temperaturze 25 °C. Jednocześnie przygotuj odczynnik barwiący zgodnie z instrukcjami zestawu do analizy żywotności i cytotoksyczności komórek kalcein/propidium (kalcein/PI) (chronić przed światłem podczas przygotowania).
3. Delikatnie wyrzuć podłoże, raz przemyj wysepki i komórki acynarne solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie wiruj w takich warunkach jak krok 3.2.
4. Usuń PBS i ponownie zawiesij wyspy i komórki acynary przygotowanym odczynnikiem barwiącym. Owiń płytkę hodowlą folią aluminiową (chroniącą przed światłem) i inkubuj w inkubatorze komórek o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut.
5. W środowisku chronionym przed światłem wykonuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 100x) i wykonuj analizę żywotności komórek za pomocą ImageJ.

4. Badanie amylazy acynarowej

1. Komórki acjarowe zasiewaj w płytkę z 12 dołkami o gęstości 1,5 × 10^{6 komórek}/dołek z 1 mL podłoża. Ustaw komórki kontrolne (Ctrl) i stymulowane ceruleiną (10 nM, 20 nM, 50 nM; oznaczone jako C10, C20, C50). Po 30 minutach stymulacji pobierz supernatanty do wykrywania aktywności amylazy zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Test uwalniania insuliny stymulowany glukozą

1. Siej 10 wysepek na odwiert w 24-dołowej płytce. Ustabilizuj wysepki w pełnym RPMI-1640 medium przez 2 godziny, a następnie wyrzuć medium.
2. Inkubuj wysce w 1 mL roztworu glukozy 5,6 mM przez 1 godzinę. Potem zbierz supernatant.
3. Opłucz wysepki buforem KRBH. Następnie inkubuj wysepki w roztworze glukozy 22 mM przez 1 godzinę i ponownie zbieraj supernatant.
4. Wykrywaj stężenia insuliny w dwóch supernatantach (w warunkach niskiej i wysokiej glukozy) za pomocą zestawu ELISA INS (insulina) dla myszy. Oblicz indeks insuliny stymulowanej glukozą (GSI):
   GSI = Stężenie insuliny w ośrodku o wysokiej zawartości glukozy / Stężenie insuliny w ośrodku o niskiej zawartości glukozy

Results

Po wirowaniu w roztworze Ficoll z gradientem gęstości, wysepki obserwowano w pobliżu granicy między przezroczystą, bezbarwną warstwą cieczy a ośrodkiem, z PAC obecnymi jako osad na dnie rurki (Rysunek 1).

Pod mikroskopem optycznym wysepki były zazwyczaj okrągłe lub owalne i złocistobrązowe, z stabilną wydajnością (120 ± 5) wysew na mysz (Rysunek 2A,B). Świeżo wyizolowane PAC były kuliste i głównie rozmieszczone w klastrze (3-8 komórek acynarnych na klaster). Końce wierzchołkowe komórek acynarnych były ciemniejsze, z wyraźnie widocznymi ziarnistkami zymogenu; Nie zaobserwowano granulek ani struktur pęcherzykowych wokół komórek, a tło roztworu było czyste. Wydajność komórek acynarnych wahała się od 1,6 do 1,95 × komórek 10⁷ na mysz [(1,77 × 10⁷) ± (1,75 × 10⁶)] (Rysunek 2C,D).

Wyniki barwienia kalcein/PI na wyspach i komórkach acynarnych przedstawiono na Rysunku 3A: Komórki barwione kalceiną (zielone) stanowiły większość, natomiast komórki barwione PI (czerwone) były rzadkie. Analiza ilościowa obrazów barwienia na żywo/martwe została przeprowadzona za pomocą ImageJ. Wyniki wykazały, że wskaźniki żywotności izolowanych wysepek i komórek acynarnych wynosiły odpowiednio (97,52 ± 0,16)% oraz (96,55 ± 0,95)% (Rysunek 3B).

Aktywność bazalnej amylazy izolowanych komórek acinowych trzustki wyniosła (0,79 ± 0,01) U/mL. Po stymulacji ceruleiną w stężeniach 10 nM, 20 nM i 50 nM, aktywność amylazy komórek amicowych wyniosła odpowiednio (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL oraz (1,39 ± 0,02) U/mL. Wyniki jednokierunkowej ANOVA wskazywały, że w porównaniu z grupą kontrolną (Ctrl) wszystkie grupy stymulowane ceruleiną wykazywały istotne różnice w aktywności amylazy (wszystkie P < 0,001). Dodatkowo zaobserwowano istotną różnicę w aktywności amylazy między grupami ceruleinowymi 20 nM i 10 nM (P < 0,001) (Rysunek 4A).

Po stymulacji roztworem glukozy 5,6 mM, wydzielanie insuliny z izolowanych wysetek wynosiło (0,27 ± 0,04) ng/mL/wyspa/h. Po stymulacji roztworem glukozy 22 mM wydzielone wyspy wynosiły (0,94 ± 0,04) ng/mL/wyspę/h, z GSI 3,44. Wyniki wskazują, że izolowane wysepki wykazują typową i skuteczną odpowiedź wydzielania insuliny pod wpływem stymulacji roztworami glukozy o różnych stężeniach (Rysunek 4B).

Członkowie naszego zespołu badawczego zaobserwowali, że ilość i jakość izolowanych wysepek i komórek acynarycznych są ściśle powiązane z czasem trawienia, który wymaga ścisłej kontroli podczas pracy i jest mniej zależny od różnych operatorów. Tymczasem wahania wydajności i żywotności są ściśle powiązane z całkowitym rozwarstwieniem trzustki oraz mechanicznym rozdzielaniem tkanki trzustki, co wymaga uwagi podczas operacji.

Rysunek 1: Wyniki wirowania gęstościowego gradientu roztworu Ficoll . Warstwa wysepek znajduje się na styku między bezbarwną, przezroczystą warstwą cieczy a podłożem hodowlarskim. Osad na dnie rurki wirówki to PAC. Skrót: PAC: komórki accynarne trzustki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Cechy morfologiczne i ilościowe wysepek i PACów. (A) Morfologia wysepek wyizolowanych z tkanki trzustki myszy. Pasek skali = 100 μm. (B) Analiza ilościowa liczby wysetek wyizolowanych z tkanki trzustki myszy (n = 3). (C) Morfologia PAC wyizolowanych z tkanki trzustki myszy. Skala = 100 μm. (D) Analiza ilościowa liczby PAC wyizolowanych z tkanki trzustki myszy (n = 3). Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD. Skrót: PAC: komórki acynarne trzustki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Ocena żywotności wysepek i PAC. (A) Barwienie fluorescencyjne kalceiną/propidium jodkiem w celu oceny żywotności wysepek myszy i PAC. Zielona: żywe komórki. Czerwony: martwe komórki. Skala = 100 μm. (B) Analiza ilościowa żywotności wysepek i PACów (n = 3). Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD. Skróty: PAC: komórki acynarne trzustki; PI = jodek propidiu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Ocena aktywności amylazy PAC i zdolności wydzielania insuliny przez wyspy. (A) Aktywność amylazy PACów pod wpływem stymulacji przy różnych stężeniach ceruleiny (Ctrl: grupa kontrolna; C10, C20 i C50: Stężenia ceruleiny wynosiły 10 nM, 20 nM i 50 nM (n = 3). (B) Ilościowa analiza stężeń wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (n = 3). Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD. ***P < 0,001. Skróty: GSI = Indeks insuliny stymulowany glukozą; PAC: komórki acynarne trzustki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

W ostatnich latach cukrzyca po zapaleniu trzustki (PPDM) zyskała szeroką uwagę ^1,9,10. Badanie molekularnych mechanizmów, dzięki którym PAC wpływają na wydzielanie hormonów wysepek w kontekście AP, ma ogromne znaczenie.

Patogeneza AP wiąże się głównie z nadmierną aktywacją enzymów trzustkowych w komórkach acnaurowych, co prowadzi do autotrawienia tkanki trzustkowej^11,12. Chociaż linie komórkowe takie jak AR42J, 266-6 (linie komórkowe acynarne) i MIN6, INS-1 (linie komórkowe β) są obecnie dostępne, te modele komórek in vitro nie są w stanie w pełni oddać złożoności fizjologicznej pierwotnych komórek acynarnych i wysepek ^4,5. Dlatego izolacja pierwotnych komórek i wysepek acynarnych jest kluczowa dla dogłębnych badań interakcji między komorami egzokrinnymi a endokrynnymi trzustki. Obecnie metody izolacji wysepek są dobrze ugruntowane; jednak większość z nich nie spełnia potrzeb badawczych dotyczących interakcji między wysepkami a komórkami acynarnymi trzustki ^6,7,8.

Ten protokół eksperymentalny optymalizuje procedurę perfuzji trzustki, obniżając barierę techniczną, umożliwiając tym samym badaczom bez specjalistycznego wykształcenia w kaniulacji przewodów żółciowych prowadzenie eksperymentów. Jednocześnie zapewnia ilość i jakość izolowanych wysepek i komórek acynarycznych, zapewniając prostą i szybką metodę jednoczesnej izolacji pierwotnych wysepek myszy i pierwotnych komórek acynarnych trzustki.

Chociaż ta metoda upraszcza proces izolacji wysepek, kluczowe kroki nadal wymagają ścisłej kontroli, aby zapewnić wysoką wydajność i skuteczne rozdzielenie wysepek i komórek acynarnych trzustki. Do tych kroków należą odpowiednia perfuzja trzustki, odpowiednie rozbicie tkanek (zapewnienie dokładnego mielenia), trawienie trzustki (precyzyjna kontrola czasu trawienia i ręczne potrząsanie podczas trawienia) oraz pipetowanie mechaniczne (kontrola liczby i intensywności pipetowania). Przed wyborem wysepek, ponownie zawiesowane wysepki powinny być ustabilizowane w inkubatorze komórkowym przez około 10 minut, aby umożliwić bardziej efektywne zbieranie wysepek.

Ważne jest, aby zauważyć, że podczas perfuzji trzustki lepsze rezultaty uzyskuje się przy wstrzykiwaniu pęcherzyków płynów czyrszych płynów; Cała tkanka trzustkowa powinna być w pełni przekrwiona, ale czas perfuzji powinien być kontrolowany w ciągu 1-2 minut. Jeśli wykryje się niską żywotność komórek, dostosuj czas kontaktu między tkanką trzustkową a kolagenazą P (w tym czas perfuzji i czas trawienia w kąpieli wodnej). Dodatkowo zwracaj uwagę na uszkodzenia mechaniczne podczas izolacji – na przykład unikaj nadmiernej siły podczas rozpraszania tkanki trzustkowej. Technika aseptyczna musi być utrzymywana przez całą izolację wysepek i komórek acyklicznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Przygotowane odczynniki powinny być filtrowane przez filtr o średnicy 0,22 μm. Proces izolacji powinien być przeprowadzany w szafie bioasekuracyjnej, a wszystkie narzędzia i materiały eksploatacyjne używane podczas izolacji muszą być sterylne. Oba przygotowane kompletne media zawierają również 1% roztwór penicyliny i streptomycyny.

W przypadku znieczulenia myszy: przymocuj skórę szyi myszy lewym kciukiem i palcem wskazującym oraz podtrzymaj jej odwłok palcem serdecznym i małym (utrzymując postawę głową w dół, brzuch do góry, aby odsłonić jamę brzuszną). Trzymaj strzykawkę prawą ręką, wprowadzaj ją pod kątem 30° w skórę dolnej lewej części brzucha myszy (1 cm od pachwiny i 0,5 cm od linii środkowej), powoli wstrzyknij środek znieczulenia i przez 10 sekund po wycofaniu igły przyciskaj miejsce wkłucia sterylnym patyczkiem kosmetycznym, aby zapobiec wyciekowi leku. Uśpię mysz przez zwichnięcie szyjki szyjnej dopiero po całkowitym znieczuleniu.

Jeśli rana zostanie ukłuta przez skażoną igłę (narażona na krew lub tkankę myszy) lub ugryziona przez mysz, natychmiast ściśnij okolice rany przy najbliższym umywalce (ściśnij od bliższego do dalszego końca, aby wydalić niewielką ilość krwi), spłukuj ranę przez 15 minut przez 15 minut, a następnie zdezynfekuj 75% etanolem lub 0,5% jodem povidonu.

Wyniki testów aktywności amylazy komórek aminowych wykazały, że izolowane komórki acynarne trzustki miały niski poziom aktywacji bazalnej i były wrażliwe na stymulację ceruleiną: aktywność amylazy stopniowo rosła wraz ze wzrostem stężenia ceruleiny, osiągała najwyższy poziom 20 nM ceruleiny i nieznacznie spadała przy stężeniu ceruleiny na poziomie 50 nM. Wyniki testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą wykazały, że izolowane wyspy wykazywały typową i skuteczną odpowiedź wydzielania insuliny pod stymulacją roztworów glukozy o różnych stężeniach. Wyniki te wskazują, że komórki i wysepki acynarne wyekstrahowane przez ten protokół nadają się do kolejnych eksperymentów in vitro .

Procedura izolacji wysepek i komórek acynarowych w tym protokole eksperymentalnym jest łatwa w obsłudze. Wyniki eksperymentów pokazują, że wysepki i komórki acynarne wyizolowane tym protokołem wykazują doskonałą ilością i żywotność. Dodatkowo wielu członków naszego zespołu zweryfikowało ten protokół na wielu myszach; Wyniki walidacji wskazują, że ma dobrą powtarzalność, wiarygodne dane i minimalne wahania wydajności komórek. Jednak ten protokół ma również pewne ograniczenia. Chociaż jest to niewielkie uzależnienie od umiejętności technicznych operatora, nadal wymaga podstawowej znajomości anatomii myszy, aby całkowicie rozdzielić trzustkę myszy – jest to warunek wstępny do całego procesu izolacji. Jeśli izoluje się tkanki trzustkowe od wielu myszy jednocześnie, ilość roztworu kolagenazy P i innych odczynników należy odpowiednio dostosować. Dodatkowo, jednoczesna izolacja od więcej niż dwóch myszy nie jest zalecana: różnica czasu między przetwarzaniem tkanek trzustkowych różnych myszy podczas sekcji, perfuzji i mielenia wpływa na czas kontaktu między tkanką trzustkową a kolagenazą P, co osłabi efektywność i żywotność izolacji komórek. Dlatego jego szerokie zastosowanie może być ograniczone. Ponadto protokół ten nie został zweryfikowany u szczurów. Jeśli izoluje się wyspy i komórki acynarne od szczurów, dawka niektórych odczynników i czas trawienia mogą wymagać dalszej korekty.

Podsumowując, ten eksperymentalny protokół zapewnia prostą i szybką metodę jednoczesnej izolacji pierwotnych wysepek myszy i pierwotnych komórek trzustkowych acynarycznych. Bardziej odpowiednia jest dla niedoświadczonych badaczy do przeprowadzania izolacji wysepek i komórek acinowych, a jednocześnie stanowi praktyczne ramy eksperymentalne do badań in vitro nad interakcjami między trzustką a hormonami egzokrynnymi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 μ Filtr m	Millex	SLGPR33RB	Przefiltruj przygotowany roztwór kolagenazy P
0,25 M chlorku wapnia (bezpłodny)	Beyotime	ST365	Szlak sygnalizacyjny zależny od wapnia do aktywacji wydzielania insuliny
1 ml strzykawki	Jierui	10084692516405	Stosowany do perfuzji kolagenazy P do tkanki trzustkowej.
1,25% roztwór tribrometanolu	Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.	JT0781	Znieczulenie
Rurka wirówki o pojemności 1,5 mL	Eppendorf	30121589	Zbierz supernatant komórki do wirowania i przechowywania.
1x Hank' S zrównoważony roztwór soli	Biosharp	BL561A	Przygotuj roztwór kolagenazy P i przepłucz tkankę trzustki
Płytka hodowla komórek z 12 dołkami	SARSTEDT	83.3921	Trzymaj tkankę trzustkową i wyodrębniony akwar z hodowli
Rurka wirówkowa 15 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A	Roztwory utrzymujące podczas eksperymentu
Płytka hodowla komórek z 24 dołkami	SARSTEDT	83.3922	Uprawa wydobytych wysepek
40-siatkowe  sito	Instrumenty Weidan	Nie ma	Filtruj tkankę trzustki
5 mL pipeta Pasteura	Biosharp	BS-XG-03L	Pipetowanie płynów i fizyczne zakłócanie tkanki trzustki
Rurka wirówkowa 50 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A	Przechowywanie roztworów podczas eksperymentu, zawieranie tkanek i wirowanie
Naczynia hodowlane komórek o średnicy 60 mm	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	12211	Pojemnik do przechowywania podłoża hodowlanego zawierający wysepki dla łatwego zbierania
Roztwór 75% etanolu	HYNAUT	Nie ma	Namocz myszy w celu dezynfekcji.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	Nie ma	Generuj obrazy.
Wirówka Beckman Allegra X-12/X-12R	BECKMAN	Allegra X-12/X-12R	Wirówka
Albumina surowicy bydła (BSA)-V	Solarbio	A8020	Utrzymuj normalną funkcję fizjologiczną wysepek i używaj (tego/tego) do przygotowywania roztworów glukozy o różnym stężeniu.
Myszy C57BL/6J, klasy SPF, 6– 8 tygodni stary, waży 18 i dash; 25 g	Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Marynarki Wojennej
Zestaw do testowania żywotności i cytotoksyczności komórek kalcein/PI	Beyotime	C2015L	Wykrywanie żywotności i cytotoksyczności komórek zwierzęcych na podstawie podwójnej fluorescencji kalcein-AM (kalceina AM) oraz propidium jodku (PI) podwójnego barwienia żywotnych i martwych komórek jednocześnie.
Chlorek wapnia (bezwodni)	Sangon Biotech	10043-52-4	Przygotuj roztwór kolagenazy P
Scenie komórkowe (100 μ m)	Biosharp	BS-100-XBS	Filtrowanie komórek acynarnych
Kolagenaza P	Sigma	11213857001	Trawienie tkanki trzustki
Roztwór D-(+)-glukozy (20%, bezpłodny)	Beyotime	ST491	Stymuluj wydzielanie insuliny z wysepek.
DMEM basic (1x) (Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium)	Gibco	C11995500BT	Hodowla komórek acinowych
Serum bydła płodu (FBS)	Biowest	S140B-500	Przygotuj podłoże hodowlane
Sterylny roztwór Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544203	Medium gradientu gęstości do stratyfikacji gradientu gęstości
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	Nie ma	Generuj obrazy i wykonuj analizy statystyczne.
Roztwór HEPES (1 M)	Biosharp	BL1061A	Przygotuj roztwór kolagenazy P
Wirówka o dużych prędkościach/chłodniczej	Sigma	3K15	Wirówka
ImageJ	Laboratorium Instrumentacji Optycznej i Obliczeniowej Narodowych Instytutów Zdrowia (LOCI)	Nie ma	Analizuj obrazy fluorescencji komórek i obliczaj żywotność komórek.
Odwrócony mikroskop biologiczny	Leica	Nie ma	Obserwuj morfologię komórek i wybieraj wysepki.
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	OLIMP	IX73	Obserwuj sygnały fluorescencyjne komórkowe i rejestruj obrazy fluorescencyjne.
Bufor HEPES z wodorowęglanem Krebs-Ringer	LEAGENE	CZ0103	Utrzymuj normalną funkcję fizjologiczną wysepek i używaj (tego/tego) do przygotowywania roztworów glukozy o różnym stężeniu.
Zestaw ELISA dla myszy INS (insuliny)	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	EM0260	Wykrywaj poziom wydzielania insuliny w wysepkach.
Kleszcze okulistyczne (10 cm, zakrzywione hakiem)	Qingyi Urządzenia Medyczne	Nie ma	Pomoc przy sekcji
Kleszcze okulistyczne (10 cm, proste z zębem)	Qingyi Urządzenia Medyczne	Nie ma	Wspomagać w sekcji i nagłym rozdzielaniu tkanki trzustki oraz ekstrakcji tkanki trzustkowej
Roztwór streptomycyny penicyliny	Gibco	15140-122	Przygotuj podłoże hodowlane, aby zapobiec skażeniu
RPMI-1640 średni,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	Zakończ roztwór trawienny kolagenazy P i hoduj wysepki
Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)	Sigma	T6522	Przygotuj roztwór kolagenazy P
Nożyczki chirurgiczne (10 cm, proste czubki)	Qingyi Urządzenia Medyczne	Nie ma	Pomoc w anatomii i pocięcie tkanki trzustki na małe kawałki
Kąpiel wodna	OAICLAB	OW-HF	Utrzymuj temperaturę trawienia.
&alfa;-amylazowy i &beta-zestaw do analizy aktywności amylazy	Elabscience	E-BC-K006-M	Wykrywanie poziomów amylazy wydzielanej przez komórki acinne w różnych warunkach