Artykuł metodologiczny

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces terapii celowanej w niedrobnokomórkowym raku płuc (NSCLC) zależy od precyzyjnej identyfikacji zmian wywołujących czynniki, w tym mutacji, fuzji genów i amplifikacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się kompleksowym narzędziem diagnostycznym molekularnym, zdolnym wykrywać zarówno znane, jak i nowe aberracje genomowe, zapewniając kluczowe wsparcie dla spersonalizowanego leczenia NSCLC. Jednak NGS pozostaje skomplikowaną i technicznie wymagającą metodą. Pomimo szerokiego wdrożenia, NGS nadal napotyka pewne wyzwania, w tym złożoność techniczną i długie czasy realizacji. Tutaj wprowadzono ISO15189-certyfikowany workflow NGS wdrożony w laboratorium klinicznym. Standaryzowany protokół obejmował ocenę komórkowości nowotworów (≥20%), ekstrakcję DNA z tkanek z formaliną zafiksowanymi w parafinę (FFPE) (wejście DNA ≥ 50 ng), automatyczne przygotowanie biblioteki oraz analizę bioinformatyczną. Integrując rygorystyczne metody kontroli jakości (QC) na każdym etapie, workflow zapewnia wysoką niezawodność danych. Ponadto kluczową innowacją w procesie pracy była automatyzacja budowy bibliotek NGS. Zautomatyzowany system budowy bibliotek NGS obejmował naprawę końcową, ogonianie A, ligację adapterów, przechwytywanie hybrydyzacji i oczyszczanie, skutecznie minimalizując błędy ludzkie, poprawiając powtarzalność eksperymentów, skracając czas pracy praktycznej, a tym samym poprawiając efektywność. Razem doświadczenie pokazuje, że rygorystyczna kontrola jakości i automatyczne przygotowanie biblioteki są niezbędne do utrzymania dokładności i skalowalności w klinicznych testach NGS. To zoptymalizowane podejście nie tylko zapewnia zgodność z ISO15189 standardami, ale także wspiera rosnące zapotrzebowanie na onkologię precyzyjną w zarządzaniu NSCLC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC) odpowiada za 75%-85% wszystkich przypadków raka płuc, stanowiąc zarówno priorytet kliniczny, jak i wyzwanie terapeutyczne 1,2,3. W ostatnich latach, dzięki pomyślnemu rozwojowi i klinicznemu zastosowaniu leków ukierunkowanych na molekularne, takich jak inhibitory receptora tyrozyny kinazy naskórnego czynnika wzrostu (EGFR-TKI), leczenie zaawansowanych NSCLC weszło w erę spersonalizowanych terapii precyzyjnych 4,5,6. Terapia celowana zapewnia precyzyjną skuteczność, wysoką swoistość i minimalne skutki uboczne 7,8. Ta zmiana w leczeniu jednocześnie zwiększyła zapotrzebowanie na technologie diagnostyki molekularnej.

Obecnie kompleksowe testy ukierunkowane na nowotwory stały się nieodłącznym elementem praktyki klinicznej, który pomaga wyjaśnić dokładne profile mutacji genetycznych, zapewniając wiarygodną podstawę do późniejszego stosowania leków, monitorowania oporności na leki oraz oceny rokowania u pacjentów. W szczególności testy wielogenowe oparte na NGS, wykorzystujące wysoką przepustowość i dużą czułość techniczne, zostały już zalecone do zastosowańklinicznych 9,10,11,12.

W porównaniu z tradycyjnymi technikami diagnostyki molekularnej, NGS wykazuje przełomowe zalety. Największą zaletą NGS jest jego zdolność do wysokiego przepływu. Umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu genów, w tym zarówno znanych, jak i nieznanych zmian genetycznych13,14. Tymczasem NGS realizuje kompleksowe testy w jednym przebiegu, co stosunkowo zmniejsza koszty, zużycie próbek i czas realizacji testów15,16. Biorąc pod uwagę te zalety, NGS jest coraz częściej stosowany w praktyce klinicznej. Jednak procesy NGS są złożone, w tym ocena komórkowości nowotworów, ekstrakcja kwasów nukleinowych, automatyczne przygotowanie biblioteki oraz analiza bioinformatyczna. Jakość początkowego przetwarzania próbki bezpośrednio wpływa na wyniki kolejnych analiz bioinformatycznych17. Szczególnie przygotowanie biblioteki obejmuje szereg kroków polegających na przekształceniu surowych próbek kwasów nukleinowych w standaryzowane biblioteki kompatybilne z instrumentami sekwencjonującymi. Przygotowanie biblioteki obejmuje fragmentację, naprawę końców, ligację adaptera oraz amplifikację PCR18. Ten złożony proces często wprowadza różne błędy techniczne: na przykład fragmentacja może prowadzić do niedostatecznej reprezentacji regionów heterochromatycznych; preferencja podłoża ligazy podczas ligacji adaptera może skutkować utratą niektórych sekwencji; a amplifikacja PCR zwykle powoduje nierówne pokrycie w regionach o ekstremalnej zawartości GC19. Te systemowe uprzedzenia nie tylko obniżają jakość danych sekwencjonowania, ale mogą także prowadzić do błędnych wniosków w kolejnych analizach bioinformatycznych. Dlatego ustanowienie rygorystycznego systemu kontroli jakości jest niezbędne, aby zapewnić niezawodność i spójność wyników eksperymentalnych.

Aby sprostać tym długoletnim wyzwaniom technicznym, laboratorium przyjęło w pełni zautomatyzowany system NGS. System został zaprojektowany tak, aby skrócić czas ręcznego przetwarzania i skrócić ogólny czas realizacji. Zawiera programowalne protokoły, które zapewniają elastyczność operacyjną i precyzję przetwarzania, jednocześnie wykorzystując zintegrowane moduły i jednostki, aby skutecznie minimalizować potencjalne błędy techniczne na każdym etapie. Co więcej, to zautomatyzowane rozwiązanie nie tylko poprawia powtarzalność i przepustowość przygotowania biblioteki, ale co ważniejsze – zapewnia dokładniejsze odzwierciedlenie składu molekularnego oryginalnych próbek. Laboratorium chciałoby wprowadzić system poprzez wykrywanie zmian w sterownikach za pomocą NGS opartego na DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół otrzymał zwolnienie IRB dla zanonimizowanych próbek archiwalnych.

1. Wstępne testowanie i kontrola jakości

  1. Rejestruj informacje o próbkach w systemie zarządzania informacją laboratoryjną (Tabela 1). Wypełnij formularz świadomej zgody na testy mutacji genów.
  2. Otrzymaj próbkę NSCLC FFPE. Upewnij się, że próbka używana do testów to próbka tkanki parafinowej, przechowywana nie dłużej niż 2 lata. Upewnij się, że próbki są przetwarzane i przechowywane zgodnie ze standardowymi metodami patologicznymi.
    UWAGA: Niniejsze badanie koncentruje się przede wszystkim na metodologicznym przepływie pracy, a nie na przeprowadzeniu szeroko zakrojonej analizy klinicznej. Dlatego nie wyznaczono konkretnego wymogu liczby próbek dla tej fazy badań.
  3. Wytnij fragmenty jednorazowymi tarczami mikrotomowymi. Zmiana ostrzy, kleszczy i mikrorurek 1,5 ml między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i uniknąć wprowadzania zanieczyszczeń pochodzących od operatora (np. włosów, komórek skóry, śliny).
    UWAGA: Duża próbka (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, pięć arkuszy; małe próbki (< 0,5 cm x 0,5 cm) oraz próbki nakłute, 6-10 μL, 10 arkuszy.
  4. Wykonaj rutynowe barwienie hematoksylin-eozyną (HE) w celu oceny zawartości komórek nowotworowych.
  5. Wybierz próbki zawierające ≥20% złośliwych komórek nowotworowych do dalszej analizy. Zawartość guza jest oceniana przez patologów na slajdach witrażowych HE20.
    UWAGA: Jeśli zawartość guza jest mniejsza niż 20%, pod kierunkiem oznaczonych obszarów guza na preparatie HE, zeskrobaj odpowiadającą mu powierzchnię tkanki nowotworowej. Proces ten pozwala na wzbogacenie tkanki nowotworowej poprzez skuteczne usunięcie otaczających nienowotworowych składników, co znacząco zwiększa udział komórek nowotworowych w zebranym materiale.
  6. Ekstracja kwasów nukleinowych wykonuje się za pomocą zautomatyzowanego systemu oczyszczania, jak opisano poniżej.
    1. Przecień blok FFPE za pomocą mikrotomu, aby uzyskać wstęgę. Włóż wstążkę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Przenieś taśmę do wyznaczonego miejsca wejścia próbki na automatycznym przyrządzie ekstrakcyjnym.
    2. Użyj automatycznego narzędzia do ekstrakcji z automatycznym zestawem do ekstrakcji i zamień ręczne pipetowanie na automatyczny magnetyczny system ekstrakcji z kulkami nukleinowymi.
      UWAGA: Automatyzacja tego etapu pomaga zapewnić automatyczną ekstrakcję, zapewniając wysoką precyzję i powtarzalną produkcję DNA dla dalszych zastosowań NGS.
    3. Zapoznaj się z instrukcjami do w pełni automatycznego oczyszczacza kwasów nukleinowych oraz odczynnika do ekstrakcji kwasów nukleinowych, aby wyciągnąć kwas nukleinowy.
    4. Następnie wybierz Program C1102, wybierz czas inkubacji próbki po odwoszczeniu jako 16 h, a objętość elucii jako 100 μL.
      UWAGA: Jeśli ekstraktowany roztwór DNA nie zostanie natychmiast przebadany, musi być przechowywany w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.
  7. Oceń jakość kwasów nukleinowych (Tabela 2) zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Do określenia rozmiaru fragmentu DNA zastosowano elektroforezę żelową agarozową. Do próbek o niskim wejściu używaj Agilent2100 oraz innych mikrofluidycznych systemów analizy kapilarnej elektroforezy.
    2. Rozpuść 1 g agarozy w 100 mL roztworu TAE. Podgrzej mieszankę w kąpieli wodnej aż do przezroczystości. Schłodzić roztwór do około 60 °C.
    3. Podłącz do dodatniej elektrody (czerwonej) w przyrządzie elektroforezy. Wykonaj ujemny biegun () do napięcia 180 V, pracuj przez 15 minut21,22.
    4. Zgodnie z wynikami elektroforezy żelowej agarozy, kategoryzować rozmiary fragmentów na cztery poziomy (A-D; Tabela 3), oraz wybrać kwas nukleinowy na poziomach A-C do kolejnych operacji.
    5. Do weryfikacji czystości użyj spektrofotometrii. Upewnij się, że OD260/OD280 > 1.8; OD260/OD230 > 2,0, aby wskazać dopuszczalne poziomy zanieczyszczeń23,24.
    6. Użyj zestawu detekcyjnego (Tabela materiałów) opartego na fluorescencyjnych barwnikach specyficznych dla sekwencji do testu fluorometrycznego w celu precyzyjnego pomiaru stężenia DNA.
    7. Dodaj 1 μL testowanego DNA do 199 μL roztworu roboczego, następnie wymieszaj, krótko wiruj i mierz stężenie fluorometrem (Tabela materiałów).

2. Przygotowanie biblioteki i kontrola jakości (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie fragmentów DNA genomowego za pomocą ultradźwięków (Tabela materiałów), jak opisano poniżej.
    1. Wymieszaj 200 ng DNA genomowego z 50 μL buforu o niskim poziomie Tris-EDTA (TE). Następnie trzymaj probówkę w schłodzonym (8 °C) stojaku na próbki.
    2. Ustaw parametr instrumentu zgodnie z Tabelą 4. Następnie zainicjuj fragmentację.
    3. Użyj elektroforezy żelowej agarozy, aby zweryfikować efekt fragmentacji. Ten etap generuje fragmenty DNA z uszkodzonymi końcami, które wymagają naprawy końców, aby przekształcić je w końce na kolejne etapy.
  2. Wykonaj naprawę końcową i dodanie A na 3 stopy, jak opisano poniżej.
    1. Napraw uszkodzone końce DNA FFPE za pomocą enzymów, aby utworzyć płaskie końce, zapewniając 3'-OH i 5'-P. Dodaj A do spłaszczonych, dwuniowych końców 3'.
    2. Przygotuj mieszankę ERA, dodając 7 μL buforu naprawczego na końcach i 3 μL enzymu naprawczego na końcach, delikatnie ręcznie przebijaj 3-5 razy i wiruj przez 1-3 sekundy.
    3. Dodaj mieszankę ERA do 50 μL próbki rozbitego DNA, delikatnie wymieszaj i wiruj przez 1-3 sekundy.
    4. Włóż go do instrumentu PCR i wybierz program ERA (20 °C przez 30 minut; 65 °C przez 30 minut; 4 °C Hold; pokrywka 85 °C). Wykonaj kolejną operację w ciągu 2 godzin.
  3. Wykonaj ligację adaptera zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Przygotuj mieszankę LIG systemu reakcji, dodając 30 μL buforu ligacyjnego, 10 μL ligazy DNA oraz 10 μL adaptera DNA. Następnie delikatnie ręcznie przekręć 3x-5x i wiruj przez 1-3 sekundy.
    2. Dodaj 50 μL mieszanki LIG do produktu 60 μL z poprzedniego etapu, delikatnie wymieszaj, a następnie wiruj przez 1-3 sekundy.
    3. Włóż mieszankę do instrumentu PCR, następnie wybierz program LIG (20 °C przez 15 minut bez podgrzewania pokrywy; 70 °C przez 10 minut (pokrywa grzewcza); 4 °C Hold; pokrywka 85 °C).
  4. Wykonaj oczyszczenie kulek magnetycznych.
    1. Weź 1,5 mL rurki wirówki o niskiej adsorpcji i dodaj 88 μL ujednoliconych kulek magnetycznych oraz 110 μL produktu z wiązaniem adapterowym. Dobrze wymieszaj i wysibaj, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Natychmiast odwiruj inkubowaną próbkę przez 1-3 sekundy i umieść rurkę wirówki na magnetycznym stojaku. Poczekaj, aż roztwór się rozjaśni (około 3-5 minut).
    3. Po zabezpieczeniu rurki na magnesie otwórz nakrętkę i ostrożnie zasysaj oczyszczony supernatant pipetą, nie naruszając kulki kulki.
    4. Trzymaj rurkę na magnesie i dodaj 300 μL świeżo przygotowanego etanolu 75% do każdej rurki.
    5. Poczekaj minutę, żeby kulki magnetyczne całkowicie się ułożyły. Powoli obróć rurkę wirówki poziomo raz, aby wchłonąć etanol.
    6. Powtórz kroki 2.4.4 i 2.4.5 raz, co daje łącznie 2 razy.
    7. Wykonaj natychmiastową wirówkę przez 1-3 sekundy, wróć rurkę do magnetycznej stojaki i odczekaj 30 sekund. Użyj pipety, aby usunąć resztki etanolu i trzymaj pokrywę rurki otwartą.
    8. Susz magnetyczne kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aż powierzchnia kulki będzie matowa i nie będzie widocznych pęknięć.
    9. Eluć iloczyn ligacji z 28 μL buforu elucijnego (EB).
      UWAGA: Kulki magnetyczne muszą być wyrównane w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
  5. Wzmacniaj i oczyszczaj przedbibliotekę, jak opisano poniżej.
    1. Przygotuj system reakcji przed mieszanką, dodając 10 μL buforu PCR, 10 μL starterów PCR, 1,5 μL mieszanki dNTP oraz 1 μL enzymu PCR. Delikatnie, ręcznie stuknij 3x-5x i wiruj przez 1-3 sekundy.
    2. Dodaj 22,5 μL mieszanki wstępnej do 27,5 μL produktu oczyszczonego z poprzedniego etapu, delikatnie wymieszaj, a następnie wiruj przez 1-3 sekundy.
    3. Wybierz program PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cykli; 72 °C 2 min; Utrzymanie 4 °C; Pokrywka 105 °C.
    4. Po zakończeniu programu PCR wykonaj magnetyczne oczyszczanie kulek przy użyciu świeżo przygotowanego etanolu 75%. Eluć iloczyn 18 μL EB.
  6. Hybryda chwytania, jak opisano poniżej.
    1. Przygotuj system reakcji A, dodając 15 μL pre-biblioteki i 4 μL mieszanki blokerów.
    2. Podłącz PCR i uruchom program PCR HYB (95 °C przez 5 minut; 65 °C Hold; pokrywka 105 °C).
    3. Przygotuj mieszankę HYB systemu reakcyjnego B, dodając 10 μL buforu hybrydyzacyjnego, 0,5 μL blokera inhibitora RNazy oraz 1 μL sondy. Delikatnie przekręć 3x-5x i wirówkę przez 1-3 sekundy.
      UWAGA: Nazwa sondy to LCOO1, a geny sondy obejmują EGFR, KRAS, BRAF, ALK ITD.
    4. Gdy temperatura instrumentu PCR spadnie do 65 °C, należy dodać 11,5 μL mieszanki HYB do systemu reakcji A, delikatnie wymieszać, następnie przykryć pokrywę instrumentu PCR i kontynuować inkubację przez 16-24 godziny.
    5. Inkubuj bufor płukania 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 mL z metalowym podgrzewaczem w temperaturze 65 °C i dawce 600 μL na próbkę.
    6. Wyciągnij kulki magnetyczne SCB, odwróć i wymieszaj 5 razy, zacznij wirować przez 10 sekund i wyrównuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wiruj przez 10 sekund, przelej 25 μL do rurki wirówki o niskiej adsorpcji 1,5 mL, umieść na magnetycznym stojak na 3 minuty i wyrzuć supernatant.
    7. Dodaj 200 μL Beads Wash Buffer do 25 μL kulek magnetycznych SCB, wymieszaj i wymieszaj przez 3 sekundy, chwilowo wiruj przez 1-3 sekundy, odstaw na stojaku magnetycznym na 3 minuty i wyrzuć supernatant.
    8. Powtórz krok 2.6.7 2 razy, łącznie trzy razy.
    9. Dodaj 200 μL bufora do płukania kulek do kulek magnetycznych, wymieszaj i wymieszaj przez 3 sekundy, a następnie ponownie zawiesij do późniejszego użycia.
    10. Przelej około 30 μL próbki hybrydowej do ponownie zawieszonych kulek magnetycznych SCB, wymieszaj i wymieszaj, umieść na obracającym się mieszaczu, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut i wiruj przez 1-3 sekundy.
    11. Umieść rurkę mieszanki na magnetycznym stojaku na 3 minuty, a następnie zasysaj około 230 μL supernatantu. Dodaj 500 μL buforu Wash 1, zatwórj przez 5 sekund, umieść na mikserze obrotowym, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Natychmiastowa wirówka przez 1-3 sekundy.
    12. Umieść probówkę z mieszanką próbek kulek magnetycznych na magnetycznym stojaku i pozostawij ją na 3 minuty. Następnie wciągaj około 500 μL nadmiaru i cieczy resztkowej.
    13. Podgrzej 150 μL bufora do płukania w temperaturze 2 do 65 °C, zawarj wir przez 10 sekund, podłącz do mieszacza o stałej temperaturze, wstrząśnij i inkubuj w 65 °C przez 10 minut z prędkością 600 obr./min. Wykonaj natychmiastową centrifugację przez 1-3 sekundy, umieść na magnetycznym stojaku na 3 minuty i zasysaj około 150 μL nadmiaru i cieczy pozostałej.
    14. Powtórz krok 2.6.13 3 razy, łącznie cztery razy.
    15. Natychmiast wiruj przez 1-3 sekundy, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu z probówki. Dodaj 20 μL EB, wymieszaj i zmniejsz 8x-10x, dobrze wymieszaj i włóż na lód do późniejszego użycia.
  7. Przygotowanie i oczyszczenie ostatecznej biblioteki.
    1. Przygotuj system reakcji POST mix, dodając 25 μL mieszanki amplifikacyjnej, 5 μL indeksu oraz 20 μL magnetycznej biblioteki kulek. Delikatnie stuknij 3x-5x i wiruj przez 1-3 sekundy. Delikatnie wymieszaj, wiruj przez 1-3 sekundy.
    2. Wybierz program POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cykli; 72 °C 10 min; Utrzymanie 4 °C; Pokrywka 105 °C.
    3. Po zakończeniu programu PCR wykonaj magnetyczne oczyszczanie kulek przy użyciu świeżo przygotowanego etanolu 75%. Elituj ostatnią bibliotekę z 20 μL EB.

3. W pełni zautomatyzowane przygotowanie biblioteki (Tabela 5)

  1. Naciśnij przycisk zasilania, aby aktywować system i czekać na inicjalizację. Przejdź do Ustawienia programu i wybierz Uruchom Protokół, a następnie wybierz Protokół: Burning Rock HS.
  2. Ustaw parametry QC aliquot jako Typ próbki: DNA wysokiej jakości; Ilość wejściowa (ng): 50; Cykle przed PCR: 12; Cykle po PCR: 12. Kliknij RUN.
  3. Włóż gotowy wkład odczynnikowy do wyznaczonego slotu (automatycznie weryfikuje rozmieszczenie i status odczynnika).
  4. Po załadowaniu próbek naciśnij Start , aby system działał autonomicznie. Obserwuj wskaźniki LED, aby monitorować postępy.
  5. Po zakończeniu programu kliknij OK , a program automatycznie przeniesie ostateczną bibliotekę do tube bibliotecznego, kończąc przygotowanie biblioteki.

4. Sekwencjonowanie i kontrola jakości

  1. Wykonaj kwantyfikację bibliotek i kontrolę jakości zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Zmierz stężenie przedbiblioteczne i całkowite stężenie biblioteczne za pomocą fluorometrii.
    2. Wykryj rozmiar fragmentów biblioteki. Użyj zestawu, aby ocenić rozmiar fragmentów biblioteki oraz obecność adapterów (Tabela materiałów).
      UWAGA: Jeśli ostateczna biblioteka zawiera dimery podkładowe, przed wymieszaniem próbek na maszynie należy dodać dodatkowy etap oczyszczania. Kwalifikowany standard do wstawiania fragmentów wynosi ≥ 150 bp, a oczekiwana skuteczność przechwytywania wynosi ≥ 40%.
    3. Rozcieńcz bibliotekę sekwencjonowania do 1,6 pM i 1300 μL do operacji sekwencjonowania.
  2. Przeprowadz monitorowanie środowiska sekwencjonowania zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Kontroluj środowisko sekwencyjne, w tym temperaturę wewnątrz (19-25 °C), wilgotność wewnątrz (20%-80%).
    2. Kompletna kontrola danych wyjściowych instrumentu, w tym baza powyżej Q30, oraz filtr przepuszczający gęstość klastru (PF).

5. Sekwencjonowanie, analiza danych i kontrola jakości

  1. Wykonuj przetwarzanie surowych danych i profilowanie molekularne, jak opisano poniżej.
    1. Użyj Burrows-Wheeler Aligner (wersja 0.7.10), aby wyrównać dane sekwencjonowania do hg19.
    2. Wykonaj lokalne wyrównanie, optymalizację, oznaczanie duplikacji oraz wywoływanie wariantów za pomocą Genome Analysis Tool Kit (wersja 3.2) i Vardict (wersja 1.5.1).
    3. Filtruj warianty korzystając z potoku fpfilter VarScan (wersja 2.4.3) i usuwaj loci o głębokościach mniejszych niż 50. Klasyfikuj i wykluczaj warianty o częstotliwości populacji powyżej 0,1% w bazach ExAC, 1000 Genomes, dbSNP lub ESP6500SI-V2 jako pojedyncze polimorfizmy nukleotydowe (SNP).
    4. Opatrz pozostałe warianty za pomocą SnpEff (wersja 3.6).
    5. Analizuj warianty strukturalne (SV), w tym duże przekształcenia genomowe (LGR), za pomocą narzędzia algorytmu MarkSV (Burning Rock). Analizuj warianty liczby kopii (CNV) na podstawie danych o głębokości pokrycia interwałów przechwytu.
    6. Poprawne dane pokrycia dotyczące uprzedzeń sekwencjonowania wynikających z zawartości guaniny cytozyny i konstrukcji sondy.
  2. Oceń jakość próby, w tym średnią głębokość, medianę głębokości, unikalną głębokość, rozmiar wstawki, złożoność biblioteki, pokrycie, stosunek Q30 oraz współczynnik korelacji próby parowej, jak opisano w25.
  3. Do generowania raportów zweryfikować wersję i parametry pipeline, aby ukończyć przegląd bioinformatyczny. Skorzystaj z odpowiednich wytycznych do oceny patogenności mutacji26,27. Wydać raport końcowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując zautomatyzowany workflow analizy NGS z rygorystyczną kontrolą jakości, laboratorium przeprowadziło kompleksowe profilowanie genomowe próbek NSCLC. Zoptymalizowany proces wykrywania (Rysunek 2) niezawodnie zidentyfikował kilka klinicznie możliwych do działania zmian genomowych w reprezentatywnych próbkach nowotworów (Rysunek 3).

Wyniki sekwencjonowania wykazały mutację błędu EGFR p.L858R o wysokiej częstotliwości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdy kwalifikowany raport NGS opiera się na rygorystycznym procesie, który pozostaje złożony i czasochłonny28. Aby rozwiązać te problemy, laboratorium opracowało w pełni zautomatyzowany system NGS. Ta operacja znacząco ogranicza ręczną interwencję, minimalizuje błędy eksperymentalne i znacznie skraca czas realizacji. Dlatego ten system zapewnił bardziej niezawodną i efektywną strategię dla NGS, ustanawiając nowe podejście do jakości danych w badaniach genomowych.

Zint...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte grantami od Beijing Natural Science Foundation of the People's Republic of China (7252122), Beijing Xisike Clinical Oncology Research Foundation of the People's Republic of China (Y-HS202402-0021), Funduszu Badań Dydaktycznych Szpitala Onkologicznego, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych oraz Pekin-Union Medical College (E2025004), oraz Krajowe Fundusze Badań Klinicznych Szpitali Wysokiego Poziomu (2025-LYZX-R-B03).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Agilent  Zestaw DNA o wysokiej czułości  Agilent5067-4626Do użycia z the  System bioanalizatora Agilent 2100
  Zestaw Agilent DNA 1000 Reagentów  Agilent5067-1504Do użycia z the  System bioanalizatora Agilent 2100
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939AOceń rozmiar fragmentów biblioteki oraz obecność adapterów. 
Concert Całkowicie automatyczny instrument do oczyszczania kwasów nukleinowychKONCERTMC1002Wykorzystywane do ekstrakcji DNA
Equalbit 1&razy; Zestaw do testów dsDNA HSVazymeEQ121-02-AADo użycia z the  Qubit 3.0 Fluorometr
Zestaw do wykrywania mutacji genów EGRR/KRAS/BRAF/ALK u ludzi – łączony zestaw wykrywający mutacje genów EGRR/KRAS/BRAF/ALKPłonąca SkałaBR-LC00102Budowa biblioteki
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AAAutomatyczne przygotowanie biblioteki NGS
ME220 Focused-ultrasonicatorCovaris500396Ultrasoniczność
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-JEDEN-WSpektrofotometryczna detekcja UV na pełnej długości fali
NextSeq 550DxIllumina20005715kolejność
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Do użycia z NextSeq 550Dx
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowychKONCERTRC1102Wykorzystywane do ekstrakcji DNA
Qubit 3.0 FluorometrŻycieQ33216Wykorzystywane do wykrywania stężenia kwasów nukleinowych lub bibliotecznych
Qubit dsDNA HS Zestaw TestowyŻycieQ32851Do użycia z the  Qubit 3.0 Fluorometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Targeted TherapyGenomic AlterationsDNA ExtractionAutomated Library PreparationTumor Cellularity AssessmentFormalin Fixed Paraffin EmbeddedBioinformatics AnalysisPrecision Oncology

Powiązane artykuły