Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie to ma na celu ocenę poziomów ekspresji i znaczenia klinicznego metaloproteinazy macierzy-1 (MMP-1) i metaloproteinazy macierzy-7 (MMP-7) u pacjentów z rozpoznaniem zapalenia płuc, zwłóknienia płuc i raka płuc. Celem jest zbadanie ich potencjalnej wartości diagnostycznej i ocena ich przydatności jako nieinwazyjnych biomarkerów do różnicowania tych chorób płuc.
Badanie to miało na celu zbadanie poziomów ekspresji i znaczenia klinicznego metaloproteinazy macierzy-1 (MMP-1) i metaloproteinazy macierzy-7 (MMP-7) u pacjentów z zapaleniem płuc, zwłóknieniem płuc (PF) i rakiem płuc (LC). W okresie od października 2023 r. do kwietnia 2024 r. retrospektywnie włączono 136 przypadków zapalenia płuc, 15 przypadków PF, 64 przypadki LC i 47 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Stężenia MMP-1 i MMP-7 w surowicy oznaczono ilościowo za pomocą testu immunologicznego chemiluminescencji. Wskaźniki pozytywności porównano w różnych grupach, a korelacja Spearmana została wykorzystana do zbadania związku między wiekiem a ekspresją MMP. Przeprowadzono analizę charakterystyki pracy odbiornika (ROC) w celu określenia optymalnych wartości odcięcia i oceny skuteczności diagnostycznej. Mediana stężeń MMP-1 w surowicy była wyższa w grupie LC (22,9 ng/ml; IQR: 11,65-30,0) i grupa PF (26,5 ng/ml; IQR: 14,4-30,0) w porównaniu z grupą z zapaleniem płuc (15,4 ng/ml; IQR: 9,34-28,75) (p < 0,05). Podobnie poziomy MMP-7 były podwyższone w LC (4,52 ng / ml; IQR: 3,55-6,20) i PF (5,05 ng/ml; IQR: 4,00-7,44) w porównaniu z zapaleniem płuc (2,35 ng/ml; IQR: 1,87-3,36) i zdrowa kontrola (2,27 ng/ml; IQR: 1,88-2,81) (p < 0,05). Zaobserwowano istotne różnice międzygrupowe we wskaźnikach dodatniości (p < 0,05). Wiek był dodatnio skorelowany zarówno z MMP-1 (rs = 0,215, p < 0,001), jak i MMP-7 (rs = 0,531, p < 0,001), przy czym korelacja była silniejsza dla MMP-7. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między płciami dla MMP-1 (z = -1,033, p = 0,301) lub MMP-7 (z = -1,326, p = 0,185). MMP-7 wykazał wysoką dokładność diagnostyczną dla LC (punkt odcięcia = 3,325 ng/ml; czułość = 84,4%; swoistość = 97,9%) i PF (punkt odcięcia = 3,66 ng/ml; czułość = 80,0%; swoistość = 97,9%). Natomiast skuteczność diagnostyczna MMP-1 i MMP-7 w zapaleniu płuc była stosunkowo ograniczona. Odkrycia te sugerują, że MMP-7 może służyć jako użyteczny nieinwazyjny biomarker do różnicowania PF i LC, podczas gdy użyteczność kliniczna MMP-1 pozostaje ograniczona ze względu na niską swoistość.
Mycoplasma pneumoniae jest głównym patogenem pozaszpitalnego zapalenia płuc, a ostatnie trendy epidemiologiczne wskazują na wzrost zarówno sporadycznych zakażeń, jak i cyklicznych globalnych epidemii występujących co 2 do 6 lat 1,2. Podczas gdy większość przypadków ustępuje samoistnie, ciężkie zapalenie płuc jest uznawane za potencjalny czynnik wyzwalający zwłóknienie płuc (PF), postępującą śródmiąższową chorobę płuc charakteryzującą się uszkodzeniem nabłonka pęcherzyków płucnych, nieprawidłową naprawą tkanek, proliferacją fibroblastów i odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej, które kończy się nieodwracalnym bliznowaceniem3. Retrospektywne badanie kohortowe z 2019 r. wykazało, że pozapalne PF, charakteryzujące się ogniskowymi zmianami zwłóknieniowymi, występowało w około 20,2% przypadków4.
Zwłóknienie płuc jest najczęstszym podtypem śródmiąższowego zapalenia płuc i wiąże się ze złym rokowaniem i znacznym obciążeniem społeczno-ekonomicznym. Co więcej, jego progresja znacznie zwiększa ryzyko raka płuc (LC), przy czym wcześniejsze badania wykazały częstość występowania od 2,7% do 48% wśród pacjentów z PF, znacznie wyższą niż w zdrowych populacjach 5,6. LC pozostaje najczęstszym nowotworem złośliwym i główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem. Niepokojące jest to, że tylko 25% przypadków jest wykrywanych we wczesnym stadium, co poważnie utrudnia postępowanie kliniczne i wyniki przeżycia 7,8. Z klinicznego punktu widzenia współwystępowanie PF i LC stanowi złożone wyzwanie diagnostyczne i terapeutyczne, podczas gdy przejście od zapalenia płuc do PF jest często subtelne i nierozpoznane. Pomimo ich ciężkości, w tych chorobach płuc brakuje obecnie skutecznych, nieinwazyjnych biomarkerów do wczesnego wykrywania i oceny rokowania.
Ostatnie badania wykazały, że metaloproteinazy macierzy (MMP) są potencjalnymi biomarkerami związanymi ze zwłóknieniowymi chorobami płuc9. Te zależne od endopeptydazy biorą udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej i regulacji różnych szlaków sygnałowych. W warunkach patologicznych MMP przyczyniają się do przebudowy tkanek, stanu zapalnego i progresji guza. W szczególności ich rola w promowaniu inwazji i przerzutów w LC jest coraz bardziej udokumentowana10,11. Wśród nich MMP-1 i MMP-7 okazały się kandydatami do zainteresowania zarówno w zwłóknieniowych, jak i złośliwych procesach płucnych.
W porównaniu z metodami obrazowania i tradycyjnymi markerami nowotworowymi, takimi jak antygen rakowo-embrionalny (CEA) lub fragment cytokeratyny (CYFRA21-1), MMP-1 i MMP-7 oferują bardziej dynamiczne odzwierciedlenie przebudowy zewnątrzkomórkowej i uszkodzenia nabłonka. Warto zauważyć, że MMP-7 wykazał lepszą swoistość w odróżnianiu zwłóknienia płuc od stanu zapalnego i nowotworu złośliwego we wczesnym stadium choroby. Co więcej, wykrywanie MMP w surowicy jest minimalnie inwazyjne, szybkie i kompatybilne z automatycznymi platformami chemiluminescencyjnymi, co pozwala na skalowalne zastosowanie kliniczne. Ta prostota metodologiczna zwiększa wykonalność zarówno w warunkach opieki doraźnej, jak i przewlekłej, szczególnie tam, gdzie narzędzia radiologiczne są ograniczone lub gdy biopsja jest przeciwwskazana.
W badaniu tym zbadano poziomy ekspresji MMP-1 i MMP-7 w surowicy u pacjentów z zapaleniem płuc, zwłóknieniem płuc i rakiem płuc, w celu oceny ich potencjalnej użyteczności diagnostycznej i znaczenia klinicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala 215 Prowincjonalnego Przemysłu Jądrowego Shaanxi (nr zatwierdzenia 2023-LC-011) i zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Przed zapisaniem się uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników lub ich opiekunów prawnych.
1. Dane pacjenta
W okresie od października 2023 r. do kwietnia 2024 r. do badania włączono łącznie 64 pacjentów (45 mężczyzn, 19 kobiet), u których zdiagnozowano raka płuc (LC). Diagnoza i leczenie zgodne z wytycznymi dotyczącymi diagnozy klinicznej i leczenia raka płuc (Chińskie Stowarzyszenie Medyczne, wydanie 2023). Kryteriami włączenia były: postępująca duszność trwająca dłużej niż 3 miesiące, suchy kaszel, restrykcyjne upośledzenie czynności płuc ze zmniejszoną zdolnością dyfuzyjną tlenku węgla (DLCO), wysiłkowa hipoksemia tętnicza oraz obecność trzasków wdechowych po osłuchiwaniu. Kryteria wykluczenia obejmowały wcześniejszą radioterapię lub chemioterapię, współistniejące choroby ogólnoustrojowe (np. choroby hematologiczne, endokrynologiczne, wątrobowe lub nerkowe), ciążę lub laktację oraz niekompletną dokumentację kliniczną.
Piętnastu pacjentów (11 mężczyzn, 4 kobiety) z idiopatycznym zwłóknieniem płuc (PF) zostało włączonych w tym samym okresie. Pacjenci z możliwymi do zidentyfikowania przyczynami śródmiąższowej choroby płuc - takimi jak zwłóknienie wywołane lekami, narażenie zawodowe/środowiskowe lub choroby autoimmunologiczne/tkanki łącznej, zostali wykluczeni. Chociaż wielkość próby dla tej grupy była ograniczona ze względu na mniejsze rozpowszechnienie PF w praktyce klinicznej, wszystkie kwalifikujące się przypadki w okresie badania zostały uwzględnione, aby zmaksymalizować reprezentatywność.
Łącznie zrekrutowano 136 pacjentów (76 mężczyzn, 60 kobiet) z zapaleniem płuc. Wśród nich u 98 zdiagnozowano pozaszpitalne bakteryjne zapalenie płuc, u 28 zapalenie płuc wywołane przez Mycoplasma pneumoniae, a u 10 wirusowe zapalenie płuc, potwierdzone wynikami badań mikrobiologicznych i radiologicznych. Większość przypadków miała łagodny lub umiarkowany przebieg; Pacjenci wymagający intensywnej terapii zostali wykluczeni. Wykluczono również osoby ze współistniejącymi zaburzeniami układu oddechowego, infekcjami ogólnoustrojowymi, dysfunkcją krążeniowo-oddechową lub innymi poważnymi schorzeniami ogólnoustrojowymi.
2. Gromadzenie danych
Przygotowanie próbek i pomiar MMP-1 i MMP-7
Próbki krwi żylnej (5 ml) pobrano do probówek pokrytych litem z heparyną w sterylnych warunkach. W ciągu 30 minut od pobrania, osocze oddzielono przez odwirowanie w temperaturze 3000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant przeniesiono do czystych probówek polipropylenowych i przechowywano w temperaturze -20 °C, przy czym na próbkę dozwolone były nie więcej niż dwa cykle zamrażania i rozmrażania.
Przed analizą próbki rozmrażano w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszano za pomocą wiru o niskiej prędkości przez 10 sekund. Jeśli obecne były widoczne warstwy, wykonywano dodatkowe wirowanie, aż plazma wydawała się jednorodna. Aby zapewnić przejrzystość, próbki ponownie odwirowywano przy 3000 × g przez 5 minut, a otrzymany supernatant użyto do pomiaru.
Oznaczanie ilościowe MMP-1 i MMP-7 przeprowadzono przy użyciu w pełni zautomatyzowanego analizatora immunologicznego chemiluminescencji (MAGLUMI X8, Snibe, Shenzhen, Chiny). Przyrząd był eksploatowany w dwuetapowym trybie testu kanapkowego z sześciopunktową krzywą kalibracyjną (dopasowanie logit-log). Każda seria obejmowała zduplikowane próbki, automatyczne 3-cyklowe mycie oraz objętość odczynnika/próbki odpowiednio 100 μl i 50 μl. Kalibracja była wykonywana co 72 godziny, a wyniki uznano za ważne tylko wtedy, gdy wewnętrzne kontrole jakości (niskie, średnie, wysokie) mieściły się w zakresie ±2 SD od docelowych zakresów producenta. Wszystkie pomiary zostały przeprowadzone w dwóch egzemplarzach, aby zapewnić powtarzalność.
Współczynniki zmienności (CV) w teście wewnętrznym i międzytestowym wynosiły odpowiednio 5,2% i 7,8% dla MMP-1 oraz 4,6% i 6,5% dla MMP-7, w oparciu o powtórzone pomiary QC.
Chociaż osocze jest preferowaną matrycą w standardowych protokołach, surowica została użyta w tym badaniu ze względu na praktyczne ograniczenia w obchodzeniu się z próbką. Substytucja ta była konsekwentnie stosowana we wszystkich grupach i uwzględniana w interpretacji. Wszelkie widocznie zhemolizowane lub lipemiczne próbki zostały wykluczone z analizy.
Progi dodatniości wynoszące 1,79 ng/ml dla MMP-1 i 4,51 ng/ml dla MMP-7 nie zostały wstępnie zdefiniowane przez zestawy testowe, ale zostały empirycznie określone w tym badaniu przy użyciu analizy krzywej ROC i maksymalnego wskaźnika Youdena. Wartości te powinny być zatem interpretowane jako specyficzne dla kohorty i wymagają walidacji w niezależnych populacjach.
3. Metody statystyczne
Normalność danych oceniano za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, a jednorodność wariancji oceniano za pomocą testu Levene'a. W przypadku zmiennych ciągłych wyniki wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe lub medianę (rozstęp międzykwartylowy), w zależności od rozkładu danych. Porównania dwugrupowe przeprowadzono za pomocą testu U Manna-Whitneya, a porównania wielogrupowe za pomocą testu Kruskala-Wallisa H.
4. Dane kategoryczne analizowano za pomocą testu chi-kwadrat
Korelację między wiekiem a ekspresją MMP oceniono za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Porównania między grupami skorygowane o wiek przeprowadzono dodatkowo przy użyciu analizy kowariancji (ANCOVA) w celu kontroli zakłóceń.
Skuteczność diagnostyczną oceniano za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), z optymalnymi wartościami odcięcia określonymi przy użyciu maksymalnego wskaźnika Youdena.
Dwustronna wartość p wynosząca < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Porównanie ogólnych informacji między grupami LC, PF, zapaleniem płuc i badaniami zdrowotnymi
Zaobserwowano istotną statystycznie różnicę wieku w czterech grupach: rak płuc (LC), zwłóknienie płuc (PF), zapalenie płuc i kontrola stanu zdrowia (p < 0,05). Analiza post-hoc potwierdziła ponadto, że każde porównanie parami wykazało istotną różnicę, wskazującą na niejednorodność wiekową między wszystkimi grupami uc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Choroby układu oddechowego, takie jak zapalenie płuc, zwłóknienie płuc (PF) i rak płuc (LC), wykazały w ostatnich latach rosnącą częstość występowania, często objawiając się jako nakładające się lub sekwencyjne jednostki kliniczne12. Szczególnie niepokojące są przypadki ciężkiego zapalenia płuc przechodzącego w PF lub PF współistniejącego z LC, które stanowią poważne wyzwanie diagnostyczne i terapeutyczne. Stany te mają wspólne zapalne i zwłóknieniowe szlaki sygnałowe, a interwencje terapeutyczne ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| – 20 &stopni; C Zamrażarka | Haier Biomedical, Chińska Republika Ludowa | DW-20L262 | Przechowywanie próbek surowicy |
| Automatyczny analizator immunologiczny chemiluminescencji (CLIA) | Snibe Diagnostics, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa | MAGLUMI-X8 powiedział: | W pełni zautomatyzowana platforma CLIA |
| Wirówka (schłodzona, zdolna do 3000 i razy; g, 4 &stopnie; C) | Eppendorf 5810R, Niemcy | 022628167 | Do separacji osocza/surowicy |
| MMP-1 Zestaw do chemiluminescencji immunologicznej | Snibe Diagnostics, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa | 130205001M | Kanapka 2-stopniowa CLIA |
| MMP-7 Zestaw do chemiluminescencji immunologicznej | Snibe Diagnostics, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa | Numer katalogowy: 130205007M | Kanapka 2-stopniowa CLIA |
| Probówki do przechowywania z polipropylenu (1,5 ml / 2 ml) | Corning, Stany Zjednoczone Ameryki | 430659 | Przykładowe podwielokrotności, – 20 &stopni; Przechowywanie C |
| Surowice kontroli jakości (niskie, średnie, wysokie) | Snibe Diagnostics, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa | Dostarczany z zestawem | Do oznaczania kontroli jakości, ± 2 Akceptacja kart SD |
| Oprogramowanie SPSS Statistics w wersji 22.0 | IBM Corp., Armonk, Nowy Jork, Stany Zjednoczone | N/A | Analiza statystyczna |
| Sterylna jednorazowa strzykawka i igła (5 ml) | Jiangsu Jichun Medical Devices, Chiny | Zaopatrzenie lokalnych szpitali | Do pobrania krwi z wkłucia żyły |
| Probówka do pobierania krwi żylnej (pokryta heparyną litową, 5 ml) | BD Vacutainer / Becton Dickinson, Stany Zjednoczone | 367884 | Służy do separacji osocza/surowicy |
| Mieszalnik wirowy | Przemysł naukowy, Stany Zjednoczone | SI-0236 powiedział: | Do homogenizacji przed oznaczeniem |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.