Zintegrowany system molekularnej detekcji oparty na PCR do jednoczesnego wykrywania czterech zoonotycznych pasożytów jelitowych z różnych źródeł

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół wykrywania czterech zoonotycznych pasożytów jelitowych z wielu źródeł jednocześnie, oparty na połączeniu zintegrowanego systemu wykrywania molekularnego opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Abstract

Choroby zakaźne są kluczowymi czynnikami wpływającymi na zdrowie ludzi, rozwój gospodarczy oraz stabilność społeczną. Wśród nich odtoczne choroby pasożytnicze jelitowe coraz częściej stają się przedmiotem globalnego zainteresowania jako pojawiające się, ponownie pojawiające się choroby zakaźne, szczególnie Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis i Giardia. Opublikowano tylko kilka badań dotyczących epidemiologii powyższych pasożytów, towarzyszące problemom takim jak pojedyncze cele wykrywania, niskie wskaźniki wykrywania i wysokie wskaźniki zaginięć. Celem niniejszego badania jest stworzenie zintegrowanego systemu detekcji molekularnej opartego na kombinacji testów PCR do jednoczesnego wykrywania powyższych czterech zoonotycznych pasożytów jelitowych w próbkach pobranych od dzikich myszy, zwierząt domowych oraz zwierząt gospodarskich (bydła i owiec), aby zapewnić efektywne wsparcie techniczne dla rutynowego wykrywania pasożytów w wielu scenariuszach, w tym na interfejsach zwierzę-środowisko, zwłaszcza w lokalnych obiektach monitoringu.

W tym badaniu, biorąc za podstawowy test wykrycie Enterocytozoon bieneusi w kałach 95 dzikich myszy oraz 30 kotów i psów (25 kotów i 5 psów), gdy użyto dwóch zestawów starterów do amplifikacji genu ITS, wyniki pozytywne każdego PCR były dokładnie takie same (5,26%), ale połączenie dwóch zestawów testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dało wyższy wskaźnik pozytywnych (6,32%) dla Enterocytozoon bieneusi. W przypadku Giardii wykryto 9 próbek pozytywnych za pomocą genu beta-giardyny (BG), natomiast nie wykryto żadnych pozytywnych w genach dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) i izomerazy triozy-fosforanowej (TPI). Powyższe wyniki wykazały, że kombinacja testów PCR dla wielu docelowych segmentów genetycznych zwiększyła zdolność wykrywania wyznaczonych patogenów w porównaniu do pojedynczego testu PCR. Sekwencje docelowe zostały potwierdzone sekwencjonowaniem Sangera. System ten został zaprojektowany, aby usprawnić i ułatwić monitorowanie statusu infekcji, rozprzestrzeniania się oraz ewolucji filogenetycznej pasożytów jelitowych odzwierzęcych pochodzących z wielu źródeł, zapewniając podstawę do dokładnych i wrażliwych ostrzeżeń na wczesnym etapie. Celem tego jest zbudowanie technicznego mostu do osiągnięcia celu One Health na pograniczu człowieka, zwierzęcia i środowiska.

Introduction

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis i Giardia to powszechne i łatwo pomijane patogeny pierwotniaków o globalnej rozpowszechnieniu. W ostatnich latach, ze względu na czynniki takie jak rekultywacja i ingerencja w ekologiczne nisze naturalnych ognisk, popularność hodowli zwierząt towarzyszących oraz rozwój hodowli zwierząt i drobiu, coraz częściej pojawia się rozpowszechnienie wieloźródłowych zoonotycznych chorób pasożytniczych jelitowych u gryzoni, zwierząt towarzyszących (kotów i psów) oraz zwierząt hodowlanych (bydło i owce), oraz ponowne pojawienie się chorób zakaźnych na terenach krajowych i wiejskich, poważnie zagrażające zdrowiu ludzi i globalnemu bezpieczeństwu zdrowia publicznego 1,2,3,4.

Te pasożyty mają złożone, wewnątrzgatunkowe gatunki i szeroką zdolność adaptacji gospodarza. Mogą zarażać nie tylko gryzonie, zwierzęta towarzyszące, przeżuwacze hodowlane, drób i ptaki, ale także gatunki zoonotyczne, które mogą zakażać ludzi, powodując objawy kliniczne, takie jak ból brzucha, biegunka i wymioty. Są szczególnie podatne na alergię wśród dzieci, osób starszych, kobiet w ciąży oraz osób z obniżoną odpornością, a mogą być przenoszone przez wodę, jedzenie i powietrze, co stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego odzwierzęcego ^3,5,6.

Obecnie identyfikacja powyższych czterech pasożytów opiera się głównie na morfologii, która jest podatna na błędne rozpoznanie ze względu na podobieństwa morfologiczne w obrębie rodzajów oraz czynniki subiektywne, szczególnie w rozróżnianiu gatunków i genotypów. Techniki biologii molekularnej były szeroko stosowane do identyfikacji gatunków, rodzajów i genotypów tych pasożytów. W przypadku Blastocystis i Cryptosporidium wykrywanie koncentruje się głównie na małej podjednostce rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (SSU rRNA) genie ^3,7,8; dla Enterocytozoon bieneusi gen wewnętrzny transkrybowany spacer (ITS) ^4,9; a dla Giardii – beta-giardyna (BG), dehydrogenaza glutaminianowa (GDH) oraz izomeraza fosforanowa trioza fosforanowa (TPI)^10,11. Chociaż konwencjonalna reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) znacznie poprawiła możliwości identyfikacji i typowania tych czterech pasożytów, jest ona niewystarczająca do wykrywania pominiętych przypadków oraz identyfikacji nowych gatunków lub quasigatunków o istotnych cechach genetycznych. Często wpływa to na efektywność badań epidemiologicznych, transmisji i kontroli chorób u ludzi, zwierząt i innych gospodarzy, stwarzając poważne wyzwania dla bezpieczeństwa zdrowia publicznego ludzi, zwierząt i środowiska.

Ze względu na podobieństwa w objawach, drogach transmisji i zasięgu gospodarzy tych czterech pasożytów, nie istnieje jeszcze zintegrowany system molekularny umożliwiający efektywne wykrywanie, jednocześnie unikające przeoczenia i dokładne identyfikowanie nowych gatunków lub quasigatunków o istotnych różnicach genetycznych. Badanie to ustanowiło dojrzały zintegrowany system detekcji molekularnej oparty na technologii sekwencjonowania PCR o wysokiej przepustowości poprzez przegląd literatury, umożliwiający jednoczesne wykrywanie czterech zoonotycznych pasożytów jelitowych w próbkach wieloźródłowych (dzikie myszy, zwierzęta towarzyszące, bydło i owce). W połączeniu z analizą bioinformatyczną system ten został zastosowany do identyfikacji wieloźródłowych zoonotycznych pasożytów jelitowych, monitorowania czynników epidemiologicznych, takich jak rozmieszczenie infekcji i ewolucja filogenetyczna, oraz wczesnego ostrzegania przed infekcjami u ludzi i zwierząt oraz skażeniem środowiska.

Protocol

Badanie zostało zatwierdzone i przeprowadzone przez komisję etyki zwierząt Prowincjonalnego Centrum Kontroli i Prewencji Chorób Jiangsu. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wydaniem Wytycznych Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynarii w zakresie eutanazji zwierząt z 2020 roku, zasadami przewodnimi Rozporządzenia dotyczącego Zarządzania Zwierzętami Doświadczalnymi (Zarządzenie nr 2 Państwowej Komisji Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej, 1988) oraz Zasadami Przewodnimi Humanitarnego Traktowania Zwierząt wydanymi przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej Chin.

1. Przygotowywanie świeżych odchodów od dzikich myszy, zwierząt towarzyszących oraz zwierząt gospodarskich (bydła i owiec)

1. Znieczulaj myszy poprzez inhalację dwutlenkiem węgla z puszki sprężonego źródła dwutlenku węgla w przezroczystym, szczelnym plastikowym pudełku, z częstotliwością wymiany 30%-70% objętości pojemnika na minutę. Po całkowitej znieczuleniu i śpiączce wykonaj zwichnięcia szyjki macicy u myszy.
2. Pobieranie świeżych próbek kału: Pobieraj próbki kału od psów, kotów, bydła i owiec w ciągu godziny od wypróżnienia, z jedną rurką na każdy odchod zwierzęcia, unikając zanieczyszczenia krzyżowego.
   1. Chwytaj gryzonie za pomocą klatek przynęt z urządzeniami do wypuszczania w różnych dzikich siedliskach. Umieść złapane myszy w workach na myszy i natychmiast przetransportuj je do laboratorium. Podczas sterylnej operacji w szafie bioasekuracyjnej rozczłonkuj myszy, aby zebrać odbyt zawierający kał, umieścić je w kriotubie o pojemności 2 mL i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykrycia.
   2. Wybieraj psy i koty ze sklepów zoologicznych w różnych regionach jako obiekty badawcze. Natychmiast zbierać świeżo wydalone odchody do kriotub o pojemności 5 mL, oznaczonych pełną informacją o próbce, i niezwłocznie transportować je do laboratorium w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.
   3. Wybieraj bydło i owce z ferm hodowli (intensywnych lub wolnowybiegowych) jako obiekty badawcze. Natychmiast zbierać świeżo wydalone odchody do kriotub o pojemności 50 mL, oznaczonych pełną informacją o próbce, i niezwłocznie transportować je do laboratorium w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja całkowitego DNA ze świeżych odchodów dzikich myszy, zwierząt towarzyszących oraz zwierząt gospodarskich (bydła i owiec)

1. Wstępne oczyszczanie kału:
   UWAGA: Użyto mini zestawu QIAamp Fast DNA Stool.
   1. Podczas sterylnej pracy w szafie biobezpieczeństwa należy dodać około 200 mg kału z różnych źródeł do buforu soli fosforanowej (PBS), dodać stalowe kulki i dokładnie ujednolicić za pomocą młynka do tkanek.
   2. Podgrzewaj go w temperaturze 70 °C przez 5 minut i wiruj w 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (15-25 °C).
   3. Dodaj 600 μL supernatantu do 2 mL rurki wirówki zawierającej 25 μL proteinazy K, dodaj 600 μL buforu AL i zachowuj wir przez 15 sekund.
   4. Inkubuj w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Do lizatu dodaj 600 μL 100% bezwodnego etanolu i wymieszaj wir.
2. Ostrożnie dodaj 600 μL lizatu do kolumny spinowej, wiruj w 14000 × g przez 1 minutę, a kolumnę spinową umieść w nowej probówce 2 mL. Powtórz ten krok jeszcze raz.
3. Ostrożnie otwórz kolumnę spinową, dodaj 500 μL buforu AW1, wiruj na maksymalnej prędkości przez 1 minutę i umieść kolumnę spinową w nowej probówce zbiorczej 2 mL. Ostrożnie otwórz kolumnę wirującą, dodaj 500 μL buforu AW2 i wiruj na maksymalnej prędkości przez 3 minuty.
4. Włóż kolumnę wirową do nowej probówki zbierającej 2 mL (przygotowanej osobno) i wiruj w 14000 × g przez 3 minuty. Umieść kolumnę spinową w nowej, oznaczonej rurce wirówki o pojemności 1,5 mL i dodaj 100 μL Buforu Elution bezpośrednio do membrany kolumny spinowej.
5. Inkubuj w temperaturze pokojowej (15-25 °C) przez 1 minutę, a następnie wiruj w 14000 × g przez 1 minutę, aby wyluczyć DNA.
6. Określ stężenie i czystość DNA za pomocą ultra-mikrospektrofotometru. Wykorzystaj wyodrębnione DNA do późniejszego wykrywania lub przechowuj je w temperaturze -20 °C dla długoterminowego zachowania.
   UWAGA: Stosunek A260/A280 powinien wynosić 1,8-2,0, aby zapewnić integralność i czystość wyodrębnionego DNA.

3. Zagnieżdżone konwencjonalne wykrywanie PCR Cryptosporidium i Blastocystis skierowane do małych podjednostek rybosomalnego RNA (SSU rRNA)

UWAGA: Do tego kroku użyto Dream Taq Green PCR Mix.

1. Przygotuj system reakcji PCR na lodzie przy użyciu mieszanki PCR: 25 μL buforu 2× Taq, 2 μL z każdego zapalnika do przodu i do tyłu, 16 μL ddH,₂O oraz 5 μL szablonu, o łącznej objętości 50 μL.
2. W przypadku Cryptosporidium postępuj zgodnie z krokami 3.2.1-3.2.2.
   1. Używaj F1R1¹ i F-1R1-1 ^8,11 jako zapalników reakcyjnych pierwszej serii. Ustaw program reakcji: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżażanie w 55 °C przez 40 s, przedłużenie w 72 °C przez 90 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   2. Użyj F2R2¹ i F-1R2-1 ^8,11 jako drugich rund spłonów, z następującym programem reakcji: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżażanie w 55 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 1 minutę, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
3. W przypadku Blastocystis postępuj zgodnie z krokami 3.3.1-3.3.4.
   1. Używaj F1R1³ i F1-1R-1 ^3,12 jako zapalników do pierwszej serii. Ustaw program reakcji dla F1R1 następująco: początkowa denaturacja przy 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 60 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 100 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   2. Program reakcji dla F1-1R-1 ustaw następująco: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 55 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 1 minutę, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   3. Używaj F2R2³ i F2-1R-1 ^3,12 jako zapalników do drugiej serii. Ustaw program reakcji dla F2R2 następująco: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 60 °C przez 40 s, przedłużenie w 72 °C przez 1 minutę, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   4. Ustaw program reakcji dla F2-1R-1 następująco: początkowa denaturacja przy 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 55 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 50 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
      UWAGA: Sekwencje pierwsze pokazano w Tabeli 1 1,3,8,11,12.

Patogen	Oczekiwany rozmiar produktu (bp)	Sekwencje pierwsze (5′-3′)			Odwołania
Cryptosporidium	830	F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA			1
		R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
		F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
		R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
	607	F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC			8,11
		R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
		R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis	600	F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC			3
		R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
		F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
		R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
	460	F1-1: TGCTTTCCCACTTGTTCATC			3,12
		F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
		R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tabela 1: Sekwencje primerowe dla rRNA SSU Cryptosporidium i Blastocystis.

4. Zagnieżdżone konwencjonalne wykrywanie PCR genu ITS Enterocytozoon bieneusi oraz genów Giardia BG, GDH i TPI

UWAGA: Do tego kroku użyto Dream Taq Green PCR Mix.

1. Przygotuj system reakcji PCR na lodzie z użyciem mieszanki PCR: 25 μL buforu 2× Taq, 2 μL zapalników do przodu i do tyłu, 16 μL ddH,₂O oraz 5 μL szablonu, o łącznej objętości 50 μL.
2. W przypadku Enterocytozoon bieneusi postępuj zgodnie z krokami 4.2.1-4.2.2.
   1. Używaj F1R1⁹ i F1-1R1-1² jako zapalników reakcyjnych pierwszej serii. Program reakcji ustaw następująco: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 55 °C przez 40 s, przedłużenie w 72 °C przez 50 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   2. Użyj F2R2⁹ i F2-1R2-1² jako spłonników drugiej rundy, a program reakcji jest następujący: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 sekund, wyżażanie w 55 °C przez 40 sekund oraz przedłużenie w 72 °C przez 50 sekund, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
3. W przypadku Giardii postępuj zgodnie z krokami 4.3.1-4.3.3.
   1. Używaj BG-F1R1, GDH-F1R1 oraz TPI-F1R1 ^2,10 jako starterów pierwszej rundy reakcji dla trzech genów docelowych. Ustaw pierwszy cykl reakcyjny dla wszystkich następująco: początkowa denaturacja przy 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 50 °C przez 40 s, przedłużenie w 72 °C przez 1 minutę, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   2. Ustal program reakcji drugiej rundy dla BG-F2R2 ^2,10 i TPI-F2R2 ^2,10 następująco: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżażanie w 55 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 50 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
   3. Ustalić drugi cykl reakcyjny dla GDH-F2R2 ^2,10 następująco: początkowa denaturacja w 94 °C przez 5 minut, 30 cykli denaturacji w 94 °C przez 40 s, wyżarzanie w 60 °C przez 40 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 50 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 7 minut.
      UWAGA: Sekwencje pierwsze pokazano w Tabeli 2 ^2,9,10.

Patogen	Oczekiwany rozmiar produktu (bp)	Sekwencje pierwsze (5′-3′)			Odwołania
Enterocytozoon bieneusi	390	F1: GGTCATAGGGATGAGAGAG			9
		R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
		F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
		R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
	390	F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT			2
		R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
		F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
		R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia	511	BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC			2,10
		BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
		BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
		BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
	530	GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC			2,10
		GDH-R1: ACCTCGTTGRGTGGCGCA
		GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
		GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
	530	TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG			2,10
		TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
		TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
		TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tabela 2: Sekwencje podstawowe dla genu Enterocytozoon bieneusi ITS oraz genów Giardia BG, GDH i TPI.

Results

Myszy Cryptosporidium, gen rRNA Blastocystis SSU, gen ITS Enterocytozoon bieneusi oraz wyniki PCR testów genu Giardia BG
Wszystkie 95 próbek kału odbytniczego od myszy przebadano na obecność genu ITS Enterocytozoon bieneusi przy użyciu dwóch zestawów zapalników, co dało 5 próbek pozytywnych dla każdej metody, co dało łą...

Discussion

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis i Giardia to powszechne zoonotyczne pasożyty jelit; dwa pierwsze zostały sklasyfikowane przez amerykańskie National Institutes of Health (NIH) jako patogeny biologiczne kategorii B, a wszystkie cztery są wymienione przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) jako 24 z najważniejszych pasożytów przenoszonych przez żywność na świecie. Mogą potencjalnie zakażać ludzi, zwierzęta i zanieczyszczać środowisko, co może powodować ogniska choró...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Qingke Tech	TSJ001
Zestaw do ekstrakcji żelem Qiaquick	Qiagen	28704	Zestaw do ekstrakcji żelu DNA
Drabinka DNA powyżej 100 bp	TransGen  Biotechnologicznych	BM311	Drabina DNA
4S Green plus barwnik kwasu nukleinowego	BBI	A616696-0500	Barwienie DNA
10& razy; Bufor TBE	Solarbio	T1051	Bufor elektroforeizy
Qubit 4.0	Thermo	https://www.thermofisher.com/in/en/home /industrial/spektroskopia-elementalna -analiza izotopowa/spektroskopia molekularna/ fluorometers/qubit/models/qubit-4.html? ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515 785702067!!!! 77516061528018!! 380468 453!1240249321530142& cid=bid_pca_ aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid 00000_0se_bng_bt_pur_con	Ilościowy instrument fluorescencyjny
MINI Space 1000	Tanon	http://en.biotanon.com/PRODUCT/ PRODUCTLIST?ID=3040& TYPE=SZCZEGÓŁ	Obrazownik żelowy
Szybki zestaw do ekstrakcji DNA do pobierania DNA	QIAGEN	51604	Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych
Baza ProFlex	Thermo	https://www.thermofisher.com/ in/en/home/life-science/PCR/ termiczne cyclers-realtime- instrumenty/thermal-cyclers /proflex-pcr-system.html	PCR
Dream Taq Green PCR Mix	Thermo	K1082	Amplifikacja PCR & nbsp;