Procedura ta demonstruje transport poprzeczny kory piszczelowej u szczurów, umożliwiając wizualizację i analizę rewaskularyzacji podczas niedokrwienia kończyny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model szczura transportu poprzecznego kory piszczelowej do leczenia niedokrwienia kończyn dolnych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transport poprzeczny kory piszczeliowej (TTT) to nowa technika chirurgiczna stosowana w celu wspierania rewaskularizacji kończyn dolnych z niedokrwiennym przebiegiem kości. Ten film prezentuje powtarzalny model szczura TTT, szczegółowo opisując chirurgiczne powstanie fragmentu kości korowej, protokół transportu oraz oceny pooperacyjne. Zabieg umożliwia kontrolowany transport fragmentu kości w górę i w dół, stymulując odpowiedzi angiogenne. Reprezentatywne obrazy rentgenowskie wykonane w dniach 1, 7 i 12 po operacji, wraz z obrazowaniem perfuzji mikronaczyniowej wykonanym w 19. dniu po eutanazji, wykazują wyraźny ruch fragmentów kości oraz poprawę perfuzji kończyn po TTT.
Model ten stanowi praktyczną i powtarzalną platformę do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy wywołanej TTT oraz oceny potencjalnych strategii terapeutycznych chorób niedokrwiennych. Aby skonstruować ten model, symulowaliśmy kliniczną procedurę TTT u szczurów Sprague-Dawley, obejmującą trzy główne etapy chirurgiczne: podwiązanie powierzchownej tętnicy udowej, stworzenie i mobilizację fragmentu kości korowej oraz zastosowanie niestandardowego zewnętrznego fiksatora. Przez 12 dni fragment był stopniowo transportowany do przodu, a następnie do tyłu. Obrazowanie perfuzyjne potwierdziło zwiększone unaczynienie kończyny niedokrwiennej po zakończeniu cyklu transportowego. Ogólnie rzecz biorąc, ten standaryzowany model szczura wiernie naśladuje kliniczne procedury TTT i oferuje cenny system eksperymentalny do badania mechanotransdukcji, angiogenezy i regeneracji naczyń w stanach niedokrwiennych kończyn.
Wprowadzenie
Choroby niedokrwienne kończyn dolnych, takie jak miażdżyca obliterans (ASO), zapalenie zakrzepicy (TAO) oraz stopa cukrzycowa (DF), charakteryzują się ograniczonym przepływem krwi tętniczej do kończyn dolnych 1,2. We wczesnych stadiach pacjenci zazwyczaj doświadczają przerywanych klaudykacji i bólu spoczynkowego. W miarę postępu choroby przedłużająca się niedokrwienie może prowadzić do martwicy tkanek, infekcji, a w ciężkich przypadkach do amputacji kończyny1. Obecne standardowe metody leczenia – w tym terapia farmakologiczna, interwencje endowaskularne oraz otwarte zabiegi chirurgiczne – często przynoszą ograniczoną skuteczność, szczególnie w zaawansowanych stadiach choroby3.
Transport poprzeczny kory piszczelowej (TTT) to innowacyjna strategia terapeutyczna w leczeniu różnych chorób niedokrwiennych kończyn dolnych4. Technika ta opiera się na metodzie Ilizarova i "zasadzie napięcia-stresu"5,6, polegająca na stworzeniu ruchomego fragmentu płata kości korowej w kości piszczelowej za pomocą osteotomii. Następnie stosuje się ciągłą, powolną i kontrolowaną siłę rozpraszającą, aby pobudzić regenerację kości, naczyń krwionośnych i otaczających tkanek miękkich. Ten proces regeneracyjny ułatwia przywrócenie mikrocyrkulacji i pomaga przywrócić równowagę tlenu w dotkniętej kończynie. Ostatecznie TTT prowadzi do poprawy perfuzji krwi i funkcjonalnej regeneracji tkanek niedokrwiennych7.
Konwencjonalne techniki rekonstrukcji naczyniowej w przypadku niedokrwienia kończyn dolnych mogą przywrócić przepływ krwi w dużych tętnicach łydki, ale często nie są skuteczne w rewaskularyzacji mniejszych tętnic w stopie ani w sprzyjaniu naprawie i regeneracji uszkodzonych mikronaczyń, ograniczając ich zdolność do pełnego rozwiązania niedokrwienia8. TTT nieustannie wywiera przyczepność na kość i otaczające tkanki miękkie, wywołując tym samym silne uwalnianie czynników chemotaktycznych i cytokin9. Te czynniki chemotaktyczne regulują różne funkcje komórek macierzystych i w warunkach niedokrwiennych są obficie wydzielane do krążenia. Aktywnie rekrutują endogenne komórki macierzyste do miejsc urazu, ułatwiając tym samym naprawę i regenerację naczyń bez konieczności bezpośredniego przeszczepiania komórek macierzystych. Dzięki tym zaletom TTT stało się obiecującą strategią terapeutyczną w leczeniu niedokrwienia kończyn dolnych i jest coraz częściej stosowane w leczeniu różnych schorzeń niedokrwiennych dotykających kończyny dolne 7,9,10.
Chociaż króliki i psy są powszechnie wykorzystywane w podstawowych badaniach TTT, brak odpowiednich narzędzi analitycznych dla tych gatunków ogranicza badania mechanistyczne. Dla porównania, model TTT szczura oferuje większą kompatybilność z dostępnymi technikami molekularnymi i obrazowymi, zachowując praktyczność i niższe koszty, co czyni go bardziej dostępną i powtarzalną platformą do badań mechanistycznych. Jednak do tej pory żadne badanie systematycznie nie opisywało ani nie oceniało skuteczności TTT w modelu szczura z niedokrwieniem kończyn dolnych.
Model TTT szczura wymaga zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych ze względu na mały rozmiar kości piszczeli i cienką korę, a zakres rozproszenia jest ograniczony grubością kory. Te praktyczne ograniczenia powinny być brane pod uwagę przy ocenie przydatności modelu do konkretnych środowisk badawczych.
W tym badaniu opracowaliśmy specyficzny dla szczurów model TTT, odtwarzając podstawową strukturę i zasady operacyjne klinicznego aparatu transportu piszczeli poprzecznego. Procedura została udoskonalona na podstawie klinicznie zweryfikowanych protokołów, aby zapewnić wykonalność i spójność u małych zwierząt. Naszym celem jest opracowanie i walidacja standaryzowanego i powtarzalnego modelu TTT dla szczurów, odpowiedniego do badania angiogenezy i mechanotransdukcji w niedokrwiennej chorobie kończyn.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego w Guangxi (zatwierdzone nr 2025-E0642). Samce szczurów Sprague-Dawley (300-350g) były trzymane w Centrum Badań Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guangxi w warunkach standaryzowanych. Szczury były zapewniane normalnym jedzeniem i czystą wodą pitną ad libitum oraz utrzymywane w 12-godzinnym sztucznym cyklu światła/ciemności. Obiekt zwierzęcy utrzymywano w kontrolowanej temperaturze 20-26 °C oraz względnej wilgotności 40%-70%. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały dokładnie wysterylizowane przed użyciem. Szczegółowe informacje o wszystkich odczynnikach i materiałach używanych w tym badaniu znajdują się w Tabeli 1.
Eutanazję przeprowadzono przez podanie przedawkowania pentobarbitalu sodu dootrzewnego. Śmierć potwierdzono przez trwałe zatrzymanie bicia serca i oddychania, rozszerzenie źrenic oraz brak reakcji na szkodliwe bodźce. Wszystkie procedury były przeprowadzane przez wykwalifikowany personel, aby zminimalizować stres związany ze zwierzętami, a protokół eutanazji został wcześniej przeanalizowany i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych.
1. Zewnętrzny fiksator TTT
- Użyj pomniejszonej, specjalnie zaprojektowanej wersji klinicznego poprzecznego transportatora zewnętrznego kory piszczelowej (TTT-EF), składającej się z jednostki trakcyjnej fragmentów kości oraz zewnętrznej ramy fiksacyjnej.
- Umożliwić pionową mobilizację obu komponentów, włączając wewnętrzny mechanizm gwintu śrubowego (Rysunek 1).
- Wywierć po dwa otwory przelotowe po każdej stronie przekroju zarówno jednostki trakcyjnej, jak i ramy mocujące, aby umożliwić włożenie przewodów Kirschnera.
- Wkładaj przewody Kirschnera przez wyznaczone otwory i zabezpieczaj je bocznie za pomocą śrub sześciokątnych, aby zapewnić stabilizację.
- Podłącz komponent trakcyjny TTT-EF do fragmentu kości za pomocą przewodów Kirschnera o średnicy 0,8 mm.
- Zakotwiczenie komponentu fiksacyjnego do bliższych i dalszych końców kości piszczelowej za pomocą przewodów Kirschnera o średnicy 1,0 mm.
2. Zabieg chirurgiczny
- Wykonaj zabieg TTT na 8-tygodniowych samcach szczurów Sprague-Dawley (SD). Znieczulaj szczury przez podanie 0,35 mg/kg pentobarbitalu sodu i 0,3 mg/kg hydratu chloralowego.
- Oceń działanie znieczulenia, badając odruch cofania pedałów oraz odruch rogówki. Stale monitoruj parametry życiowe i głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu. Przed operacją nałóż maść okulistyczną na oczy szczura, aby chronić rogówkę, zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt laboratoryjnych.
- Ogol obszar operacyjny i podaj 0,5% lidokainy, aby zminimalizować ból pooperacyjny.
- Wykonaj nacięcie skóry o grubości 10 mm w prawym obszarze pachwinowym skalpelem nr 11.
- Bezpośrednio rozciąć powięź, aby odsłonić powierzchowną tętnicę udową.
- Odizoluj tętnicę pomiędzy nerwem udowym a powierzchowną żyłą udową za pomocą kleszczy okulistycznych. Spójrzcie i przecinajcie oba końce tętnicy.
- Zszyj nacięcie za pomocą szwu 4-0 wchłaniającego się do przezwyciężenia.
- Wykonaj pionowe nacięcie o grubości 15 mm na przyśrodkowej górnej kości piszczelowej skalpelem nr 11.
- Ostrożnie oddziel tkankę podskórną od mięśnia podskórnego, aby uniknąć urazu okostnej. Delikatnie rozczłonkuj tkankę miękką, aby całkowicie odsłonić przyśrodkową powierzchnię piszczeli.
- Wyznacz obszar fragmentów kości (8 mm × 4 mm) na powierzchni piszczelowej przyśrodkowej za pomocą ostrza chirurgicznego. Wierć blisko rozmieszczone perforacje wzdłuż wyznaczonej granicy za pomocą wiertła o średnicy 0,6 mm. Utworzenie fragmentu okna kości (8 mm × 4 mm) na górnej kości piszczelowej przyśrodkowej.
- Wszczepić dwa gwintowane przewody Kirschnera o średnicy 0,8 mm w fragment kości, rozmieszczone w odległości 0,5 mm, aby ułatwić transport. Podłącz przewody Kirschnera do TTT-EF i zabezpiecz je.
- Włóż dwa przewody Kirschnera o średnicy 1,0 mm po obu stronach fragmentu, przenikając tylną korę kości piszczelowej.
- Złóż i zainstaluj TTT-EF.
- Wykonaj osteotomię wzdłuż wyznaczonych linii za pomocą nożyczek okulistycznych.
- Delikatnie unieś fragment kości, aby umożliwić pionową ruchomość i uniknąć urazu szpiku.
- Przepłukaj miejsce operacji 10% povidon-jodem, a następnie sterylną solą fizjologiczną.
- Zszyj nacięcie warstwami, używając szwów 4-0.
- Podawaj buprenorfinę (0,05 mg/kg) podskórnie bezpośrednio po operacji. Kontynuuj dawkowanie co 12 godzin przez maksymalnie 3 dni, aby zapewnić skuteczną anestezję.
3. Monitorowanie pooperacyjne
- Uważnie obserwuj zwierzęta po operacji, aby zapewnić prawidłową rekonwalescencję i wykryć potencjalne powikłania na wczesnym etapie. Badanie zwierząt co 6-8 godzin w ciągu pierwszych 48 godzin po operacji. Oceń ogólną aktywność, postawę, zachowania związane z pielęgnacją, spożycie jedzenia i wody oraz stan nacięcia chirurgicznego.
- Monitoruj co najmniej raz dziennie od trzeciego dnia po operacji aż do fazy rozproszenia i konsolidacji. Potwierdź odpowiednią regenerację, weryfikując prawidłowe chodzenie, stabilną masę ciała, regularne spożycie jedzenia i wody oraz brak wydzieliny z rany, nadmiernego obrzęku lub objawów bólu zachowań.
- Kontynuuj analgezję zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Leczenie infekcji ran (np. rumień, obrzęk, wydzielina ropna) stosuj miejscową pielęgnację ran oraz antybiotyki ogólnoustrojowe, zgodnie z zaleceniami weterynaryjnymi.
- Natychmiast koryguj poluzowanie lub przemieszczenie zewnętrznego fikatora pod krótką anestezją, aby utrzymać ustawienie i umożliwić precyzyjne odwrócenie uwagi.
- Szybko oceniaj i zarządzaj ewentualnymi komplikacjami. Ocena zwierząt z poważnymi powikłaniami wpływającymi na ruchomość, karmienie lub gojenie ran w konsultacji z personelem weterynaryjnym.
- Uśpiać zwierzęta humanitarnie, jeśli spełniają one określone kryteria humanitarnego punktu końcowego.
4. Protokół transportu fragmentów kości
- Do wykonania transportu fragmentów kości pooperacyjnej wykorzystaj poprzeczny transport korei piszczelowej (TTT-EF).
- Oznacz pierwszy dzień po operacji jako okres opóźnienia.
UWAGA: Nie manipuluj fragmentem kości w tym okresie. - Rozpocznij fazę transportu w górę drugiego dnia. Przesuwaj fragment kości z częstotliwością 0,5 mm co 12 godzin przez 5 kolejnych dni (Dzień 2-Dzień 6). Zatrzymaj proces transportu w 7. dniu, aby umożliwić stabilizację.
- Rozpocznij fazę transportu w dół ósmego dnia.
- Cofaj fragment kości w tej samej szybkości 0,5 mm co 12 godzin przez 5 dni (dzień 8–12 dzień). Upewnij się, że fragment kości wróci do pierwotnej pozycji do końca 12. dnia.
- Kontynuuj dwudniową fazę konsolidacji (dni 13-14), bez dalszego transportu.
- Usuń zewnętrzny fikator na końcu fazy konsolidacji.
UWAGA: Zobacz Rysunek 2 , aby zobaczyć wizualną oś czasu procedury transportu TTT oraz harmonogramu oceny.
5. Ocena
UWAGA: Stosuj techniki obrazowe do oceny zarówno położenia fragmentu kości, jak i odbudowy przepływu krwi.
- Wykonaj obrazowanie rentgenowskie kończyn dolnych w dniach 1, 7 i 12, aby monitorować postęp i ostateczne położenie transportowanego fragmentu kości.
- Znieczulaj szczury w wyznaczonych punktach obrazowania, używając 2,0% izofluranu w tlenie.
- Umieść każdego szczura na platformie obrazowania utrzymywanej temperaturą wyposażonej w podkładkę grzewczą, aby zapobiec hipotermii podczas zabiegu.
- Monitoruj głębokość znieczulenia, oceniając częstość oddechu i odruch pedałów, aby zapewnić stabilną unieruchomienie.
- Ustawij kończyny i zewnętrzny fiksator w ustandaryzowanej orientacji we wszystkich zwierzętach, aby zminimalizować zmienność w pozyskiwaniu promieni rentgenowskich.
- Wykonaj zdjęcia rentgenowskie, aby potwierdzić przemieszczenie i przesunięcie fragmentów kości.
- Wykonaj obrazowanie perfuzji naczyniowej 19 dnia po operacji, aby ocenić perfuzję mikronaczyniową kończyny dolnej.
- Uśpij szczury i przeperfuzuj środek kontrastujący przez tętnicę udową, aby zobrazować naczynia.
- Uśpione szczury umieść w ustandaryzowanej pozycji leżącej dla spójnego ustawienia obrazowania.
- Pozwól na pełne wypełnienie naczyniowe, przepuszczając środek kontrastowy przez tętnicę udową w stałej temperaturze pokojowej.
- Wykonaj obrazowanie naczyniowe w celu oceny architektury mikronaczyniowej i perfuzji. Upewnij się, że wszystkie próbki są spójnie wyrównane z identyczną orientacją kończyn i fiksatorem, aby wspierać powtarzalność podczas sesji obrazowania.
- Wykorzystaj uzyskane obrazy do oceny przywrócenia przepływu krwi i struktury naczyniowej w kończynach dolnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 3 ilustruje procedurę tworzenia zwierzęcego modelu zwierzęcego niedokrwienia kończyn dolnych leczonych TTT. W naszych rękach zabieg wykazał skuteczność operacji na poziomie około 90%. Ograniczona liczba awarii wynikała głównie z problemów technicznych, takich jak poluzowanie zewnętrznego fikatora czy złamanie fragmentów kości wewnątrzoperacyjnych, co uniemożliwiało dalsze odwrócenie uwagi. Model został opracowany poprzez odsłonięcie i podwiązanie powi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszystkie procedury związane z anestezjologią i operacją były wykonywane z dużą szczególnością z uwzględnieniem bezpieczeństwa zwierząt oraz wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami w instytucjach. Głębokość znieczulenia została potwierdzona przed nacięciem za pomocą wycofania pedału lub testów odruchu rogówki i była regularnie monitorowana przez cały zabieg. Zapewniono odpowiednie wsparcie termiczne (np. poduszkę grzewczą), aby zapobiec hipotermii, a podczas długotrwałego znieczulenia zastosowano maść okulistyczną ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikro poprzeczny retraktor | Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd | A61B17/66 | Wykonaj trakcję fragmentów kości |
| Małe wiertło ortopedyczne | Yancheng Ruiao Technology Co. LTD | RA-II | Do osteotomii wiercenia kości piszczelowej |
| Wiertło do stali nierdzewnej 0,6 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Do osteotomii wiercenia kości piszczelowej |
| Drut Kirschnera o gwincie typu 0,8 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Do mocowania płatów kostnych i retraktora |
| Drut Kirschnera o gwincie 1,0 mm | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Do unieruchomienia retraktora |
| Pentobarbital sodowy | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | - | Do znieczulenia zwierząt |
| Klucz imbusowy | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Do mocowania śrub |
| Buprenorfina | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | Dla zwierzęcia przeciwbólowego | |
| MICROFIL | Flow Tech, Inc Co., Ltd | Angiografia zwierząt | |
| Izofluran | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Do indukcji i utrzymania znieczulenia inhalacyjnego | |
| Lidokaina chlorowodorek (0,5%) | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Stosowany do miejscowej infiltracji w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego i minimalizacji podrażnień tkanek podczas zabiegów chirurgicznych |
Bibliografia
- Jones, D. W., Farber, A. Review of the global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. JAMA Surg. 155 (2), 161(2020).
- Levin, S. R., Arinze, N., Siracuse, J. J. Lower extremity critical limb ischemia: a review of clinical features and management. Trends Cardiovasc Med. 30 (3), 125-130 (2020).
- Aboyans, V., Chastaingt, L. What LEADs to the under-treatment of patients with lower-extremity artery disease. Eur J Prev Cardiol. 30 (11), 1090-1091 (2023).
- Liu, Z., Xu, C., Yu, Y., Tu, D., Peng, Y., Zhang, B. Twenty years development of tibial cortex transverse transport surgery in PR China. Orthop Surg. 14 (6), 1034-1048 (2022).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin Orthop Relat Res. 239, 263-285 (1989).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin Orthop Relat Res. 238, 249-281 (1989).
- Chen, Y., et al. Proximal tibial cortex transverse distraction facilitating healing and limb salvage in severe and recalcitrant diabetic foot ulcers. Clin Orthop Relat Res. 478 (4), 836-851 (2020).
- Beckman, J. A., Schneider, P. A., Conte, M. S. Advances in revascularization for peripheral artery disease: revascularization in PAD. Circ Res. 128 (12), 1885-1912 (2021).
- Zhu, Y. L., Qu, L., Ye, Z. M. Tibial cortex transverse distraction for primary lymphoedema in the lower limb: a case report. J Orthop Transl. 25, 25-27 (2020).
- Yang, Y., et al. Tibial cortex transverse transport accelerates wound healing via enhanced angiogenesis and immunomodulation. Bone Joint Res. 11 (4), 189-199 (2022).
- Hasanpour, M., Mitricheva, E., Logothetis, N., Noori, H. R. Intensive longitudinal characterization of multidimensional biobehavioral dynamics in laboratory rats. Cell Rep. 35 (2), 108987(2021).
- Modlinska, K., Pisula, W. The Norway rat, from an obnoxious pest to a laboratory pet. eLife. 9, e50651(2020).
- Su, H., et al. Finite element analysis safety of tibial cortex transverse transport. Bone Joint Res. 14 (4), 281-291 (2025).
- Zhen, P., et al. Finite element analysis of biomechanical effects in rat tibia during tibial cortex transverse transport. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1670040(2025).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
