Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model szczura czuwającego udaru niedokrwiennego z powikłaniami neuropsychiatrycznymi podczas siedmiodniowej obserwacji

315 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69194

⸱

19 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 2Pushchino Branch of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education, Russian Biotechnological University (BIOTECH University), 3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Proponowany jest nowy model ogniskowego udaru niedokrwiennego u szczurów czujących. Osiągnięto to poprzez wstrzyknięcie zatorowości powietrznej do tętnicy szyjnej szczurów wewnętrznych. Rozwój ogniskowego udaru niedokrwiennego potwierdzono barwieniem mózgu chlorkiem trifenyltetrazoliu, testami funkcjonalnymi oraz oceną parametrów fizjologicznych.

Streszczenie

Opracowano translacyjny model eksperymentalnego udaru u szczurów wywołanego przez zator gazowy, aby wyjaśnić cechy rozwoju udaru oraz ocenić działanie neuroprotekcyjne nowych środków i sprawdzonych leków. Umiarkowanie czasochłonny i pracochłonny protokół pozwala obserwować dynamikę szybkiej śmierci neuronów u ośpionych zwierząt, dając wyjątkową możliwość oceny ostrej fazy udaru, w tym majaczenia, a także monitorowania zaburzeń autonomicznych, takich jak zmiany ciśnienia krwi, temperatury ciała i minutowej objętości oddechu. Powietrze atmosferyczne (100 μL) było podawane przez wlew przez cewnik naczyniowy, umieszczony wstecz do tętnicy szyjnej wspólnej przez tętnicę szyjną zewnętrzną, za pomocą pompy infuzyjnej. Dwadzieścia cztery godziny po embolizacji zwierzęta wykazują stereotypowe zaburzenia behawioralne, ruchowe oraz różnice histopatologiczne. Do siódmego dnia eksperymentu zaobserwowano istotną poprawę stanu neurologicznego i wyniki testów behawioralnych zbliżyły się do wartości kontrolnych. Jednocześnie obserwuje się przejście od infiltracji neutrofilowej do makrofagowej w zmianie niedokrwiennej. Proponowany model może być wykorzystywany w badaniach przedklinicznych, ponieważ odtwarza powikłania neuropsychiatryczne okresu po udarze, wraz z odpowiadającymi mu zmianami fizjologicznymi, funkcjonalnymi i histopatologicznymi.

Wprowadzenie

Celem tych badań było opracowanie modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego mózgu u szczurów czujnych oraz uzyskanie najbliższego przybliżenia tego modelu do klinicznych aspektów udaru niedokrwiennego u ludzi. Jak wykazały badania Söylanda i in., 62,6% pacjentów wykazywało istotne objawy udaru niedokrwiennego w stanie czuwania, podczas gdy tylko 19% doświadczyło udaru po przebudzeniu1. W związku z tym występowanie stanu czuwania podczas embolizacji tętnic mózgowych u zwierząt budzi największe zainteresowanie. Klasyczne modele stosowane do badania ogniskowego udaru niedokrwiennego mózgu obejmują: zgład przezczaszkowy, okluzję śródnaczyniowych włókna środkowej tętnicy mózgowej, zator zatorowy, okluzję endotelin-1 oraz model fotozakrzepki2. Klasyczne metody modelowania narażają zwierzęta na działanie znieczuleń, które mogą prowadzić do zniekształcenia punktów końcowych w modelu udaru niedokrwiennego. Izofluran jest szeroko stosowany w chirurgii okluzji jako najszybsza metoda znieczulenia gazowego 3,4,5. Jednak stopień upośledzenia mózgu po zgryzowaniu środkowej arterii mózgowej (MCAO) po 24 godzinach był odwrotnie proporcjonalny do czasu trwania znieczulenia izofluranowego u zwierząt. Wykazano, że izofluran wywiera wpływ na ponad 1000 ekspresji genów6 różnicowo ekspresyjnych związanych z niedokrwienością, co może skutkować modelem udaru niedokrwiennego, który nie jest całkowicie wiarygodny.

Jedną z metod modelowania udaru niedokrwiennego u szczurów jest wstrzyknięcie skrzepu krwi do tętnicy szyjnej wewnętrznej7. Niemniej jednak, indukcja udaru niedokrwiennego w tym modelu została przeprowadzona 1 godzinę po cewnikowaniu izofluranem. Możliwe, że to prewarunkowanie mogło zakłócić rozwój neurologicznych i fizjologicznych konsekwencji podawania zakrzepu.

Proponowana jest alternatywna metoda modelowania udaru niedokrwiennego poprzez embolizację tętnicy szyjnej wewnętrznej u szczurów czujących, a następnie ogniskowe uszkodzenie mózgu w środkowej części rdzenia mózgowego. Cewnikowanie przeprowadzono 24 godziny przed modelowaniem udaru niedokrwiennego. Zapewniło to, że działanie znieczulenia nie było wpływane na działanie znieczulenia.

Proponowany model nie wykorzystuje endoteliny-18, filamentu9 ani koagulowalnego pigmentu10 w przypadku niedokrwienia. Wybór środka do podania szczurom za pomocą cewnika opierał się na założeniu, że ta metoda będzie wykonalna, co eliminowało konieczność umieszczenia zwierzęcia w ramie stereotaksyjnej i znieczulenia 8,10.

Ponadto model umożliwia obserwację parametrów fizjologicznych i neurologicznych u zwierząt bezpośrednio po embolizacji; alternatywne metody modelowania udaru niedokrwiennego wydają się być z tym niezgodne. W literaturze punkty końcowe uszkodzenia mózgu i zaburzeń neurologicznych po modelowaniu udaru niedokrwiennego są najczęściej oceniane 24 godziny po zakryciu 11,12,13,14.

Wykorzystanie oczonych szczurów w modelowaniu udaru niedokrwiennego może stanowić dodatk lub alternatywę dla dominującego klasycznego modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego. Takie podejście ułatwia bardziej szczegółowe badania potencjału neuroprotekcyjnego zarejestrowanych lub rozwijających się środków farmaceutycznych do leczenia udaru niedokrwiennego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi laboratorium i zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnego Oddziału Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Immiakina-Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk (Protokół nr 1016/25, z dnia 17 stycznia 2025). W tym badaniu wykorzystano 28 samców szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 10-12 tygodni, o średniej masie ciała 301 g i mikrobiologicznym statusie Specyficznie Wolnym od Patogenów (SPF). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Użyj 28 samców szczurów asystentowych, 10-12 tygodni, ze statusem SPF. Wykorzystaj 12 zwierząt dla grupy pozorowanej oraz 16 do modelowania udaru niedokrwiennego z zatorowością gazową mózgu tętniczego (CAE).
  2. Wszystkie instrumenty sterylizować przez 24 godziny w roztworze dezynfekującym (0,5% chlorheksydyny biglukonian w 70% etanolu).
  3. Znieczulać szczury poprzez wstrzyknięcie domięśniowe mieszanką tiletaminy 15 mg/kg i zolazepamu 15 mg/kg + chlorku ksylazyny 10 mg/kg (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  4. Upewnij się, że etap znieczulenia chirurgicznego został osiągnięty: dotknij kącika oka zwierzęcia, uszczypnij czubek ogona.
    UWAGA: Zwierzę uznaje się za znieczulone, jeśli po tych manipulacjach nie zaobserwowano żadnych odruchów.
  5. Szarpnij pole operacyjne w okolicy szyi brzusznej.
  6. Unieruchom zwierzę na stole chirurgicznym, mocując kończyny i górne siekacze miękkimi opaski uciskowymi.
  7. Rurki polietylenowe o średnicy 0,8 mm położ na rurki o długości 10 cm, a następnie skręć stabilizującą spiralę o szerokości około 5 mm na końcówce, przekręcając końcówkę rurki polietylenowej na metalową rurkę i zanurzając ją w gorącej wodzie (90 °C). Napełnij tubkę heparyną (50 ME). Zabezpiecz przeciwległy koniec spirali korkiem wykonanym z kawałka żyłki wędkarskiej.
    UWAGA: Cewnik wykonany jest z medycznych rurek polietylenowych. Unikaj zginania lub zaciskania cewnika podczas dotyku.

2. Cewnikowanie tętnicy szyjnej

  1. Zrób nacięcie o długości około 5 mm po brzusznej stronie szyi zwierzęcia.
  2. Rozciąj mięsień szyi za pomocą kleszczy. Otwórz obszar, w którym tętnica szyjna rozgałęzia się na tętnicę zewnętrzną i wewnętrzną.
  3. Znajdź tętnicę biegnącą wzdłuż tchawicy. Ostrożnie uwolnij go za pomocą kleszczy z osłonki tkanki łącznej, nie dotykając nerwu błędnego biegnący wzdłuż tętnice.
  4. Użyj kleszczy, aby odizolować fragment tętnicy szyjnej zewnętrznej.
  5. Umieść tymczasową więzę 3-5 mm ogonową od rozgałęzienia tętnicy szyjnej wspólnej.
  6. Na tętnicy szyjnej zewnętrznej umieść dwie ligatury, jedną bezpośrednio po rozgałęzieniu, a drugą 4 mm od rozgałęzienia.
    UWAGA: Wprowadzenie cewnika zostanie wykonane pomiędzy tymi dwoma ligaturami. Ligatura założona bezpośrednio po rozgałęzieniu unieruchomi cewnik w naczyniu.
  7. Na tętnicy szyjnej wewnętrznej umieść tymczasową więzę czaszkową przy rozgałęzieniu tętnicy szyjnej wspólnej.
  8. Po rozgałęzieniu załóż ligaturę na tętnicę pterigopalatina.
    UWAGA: Podczas stosowania ligatur w etapach 2.7 i 2.8 może wystąpić krwawienie z powodu obecności ukrytych kości ukrytych za głównym pniem tętnicy szyjnej. W takim przypadku powinny być podwiązane.
  9. Wykonaj nacięcie na zewnętrznej tętnicy szyjnej między więzami nożyczkami. Wprowadź przygotowany cewnik (krok 1.7) do otworu utworzonego w naczyniu, kierując go w stronę tętnicy szyjnej wspólnej.
  10. Zwolnij dystalne więzowanie i przepchnij cewnik dalej w żyłce, aż wejdzie do tętnicy szyjnej wspólnej. Ostrożnie zawiąż dwie ligatury na odcinku tętnicy szyjnej zewnętrznej z cewnikem w środku. Umieść trzecią ligaturę przed cewnikem i również ją zawiąż.
    1. Mocuj cewnik za pomocą ligatur do pierścienia amortyzującego. Usuń więzy z tętnic szyjnych i zewnętrznych.
      UWAGA: Podczas naciskania cewnika może wyciekać krew z naczynia.
  11. W przypadku wycieku krwi z naczynia należy umieścić podwójne ligatury między otworem w naczyniu a trzecią ligaturą.
  12. Prowadź cewnik stały do kłębu za pomocą rowkowanego dyrektora igieł.
  13. Zszyj ranę brzuszną materiałem szwicznym 4.0. Użyj szwu ciągłego.
  14. Zszyj grzbietową stronę skóry materiałem 4.0 szczelnie wokół cewnika. Użyj szwu ciągłego. Przyklej kawałek tynku klejącego na zewnątrz cewnika i przywiąż go do szwu dla lepszej mocności.
  15. Podawaj antybiotyk cyprofloksacyny w dawce 5 mg/kg domięśniowo.

3. Modelowanie ogniskowego niedokrwienia mózgu u zwierząt z grupy CAE

  1. Dwadzieścia cztery godziny po cewnikowaniu szczura umieść zwierzęta w stanie czuwania w paralizatorze laboratoryjnym, aby umożliwić dostęp do cewnika założonego na kłębie.
  2. Włóż do pompy strzykawkę napełnioną roztworem soli fizjologicznej 0,5 ml (0,9% NaCl) z igłą 30 G.
  3. Podłącz igłę strzykawki do pustego cewnika polietylenowego (pojemność 100 μL). Podłącz drugi koniec cewnika polietylenowego do wszczepionego cewnika za pomocą adaptera.
    UWAGA: Prawidłowe wszczepienie cewnika oraz brak zakrzepu są dowodzone, gdy heparyna z wszczepionego cewnika jest przekazywana do cewnika zawierającego powietrze, powodując lekkie sprężenie powietrza. Powodem tego jest to, że ciśnienie krwi szczura przekracza ciśnienie powietrza w podłączonym cewniku.
  4. Ustaw szybkość wtrysku pompy infuzyjnej na 10 μL/min. Ustaw objętość wtrysku pompy infuzyjnej na 120 μL.
  5. Uruchom pompę infuzyjną. Wstrzyknąć 100 μL powietrza z cewnika polietylenowego oraz 20 μL roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
    UWAGA: Wstrzykiwanie trwa 10 minut. W tym momencie obserwuj zwierzę. Podczas wstrzyknięcia zwierzę może wydawać dźwięki, gryźć lub drapać paralizator.
  6. Wyjmij zwierzę z paralizatora.
  7. Natychmiast ocenić stan neurologiczny zwierzęcia na skali 0-5 punktowej: 0 = brak deficytu neurologicznego, 1 = niemożność pełnego wyprostowania kończyny, 2 = rotacja, 3 = utrata wsparcia kończyn, 4 = brak spontanicznego chodzenia przy obniżonym poziomie świadomości oraz 5 = śmierć.
    UWAGA: Szczegółowy opis można znaleźć w źródle15. Możliwe, że zwierzę nie wykazuje zaburzeń neurologicznych zaraz po podaniu powietrza. Wskazuje to, że nie doszło do zatkania z powodu cech anatomicznych zwierzęcia ani podwyższonego ciśnienia krwi.
  8. Wyklucz zwierzę z eksperymentu w przypadku braku objawów neurologicznych.
    UWAGA: Szczury z CAE wykazują 1-4 punkty na skali deficytu neurologicznego (CAE). Najczęściej jest to utrata wsparcia kończyn lub brak spontanicznego chodzenia przy obniżonym poziomie świadomości.
  9. Podawaj antybiotyk cyprofloksacyny w dawce 5 mg/kg domięśniowo.

4. Ocena parametrów fizjologicznych

  1. Godzinę po CAE oceni stan neurologiczny zwierzęcia na skali 0-5 punktowej: 0 = brak deficytu neurologicznego, 1 = niemożność pełnego wyprostowania kończyny, 2 = rotacja, 3 = utrata wsparcia kończyny, 4 = brak spontanicznego chodzenia przy obniżonym poziomie świadomości, oraz 5 = śmierć15.
    UWAGA: Po 1 godzinie zwierzę może nie wykazywać żadnych objawów, ponieważ pęcherzyk powietrza jest szybko wchłaniany, co wskazuje, że embolizacja tętnicza była niewystarczająca.
  2. Wykluczyć zwierzę z eksperymentu w przypadku braku objawów neurologicznych 1 godzinę po CAE (szczury z 0 punktami na skali deficytu neurologicznego15).
  3. Podawaj antybiotyk ciprofloksacyny w dawce 5 mg/kg domięśniowo, 24 godziny i 48 godzin po CAE.
  4. Losowo dostosuj zwierzęta z grupy pozorowanej i grupy CAE w celu oceny parametrów fizjologicznych.
  5. Waż zwierzęta bezpośrednio przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE na wadze Sartorius z dokładnością gramów.
  6. Zmierz temperaturę ciała odbytu szczurów tuż przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE za pomocą cyfrowego termometru o zakresie pracy od 32 °C do 42 °C.
  7. Nieinwazyjnie mierz ciśnienie skurczowe i tętno tuż przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE, używając mankietu ogonowego w komputerowym systemie do pomiaru ciśnienia krwi i parametrów oddechowych.
    1. Włącz termofor i podgrzej go do temperatury 40 °C.
    2. Włóż zwierzę do paralizatora i umieść je na termoforze. Pozwól zwierzęciu się uspokoić przez 3-5 minut.
    3. Następnie załóż mankiet z czujnikiem do pomiaru parametrów sercowo-naczyniowych na ogon zwierzęcia, 2-3 cm od nasady ogona.
    4. Ustawij przetwornik bezpośrednio pod tętnicą ogonową brzuszną.
    5. Upewnij się, że sygnał jest stabilny, a w programie wyświetlane tętno. Zacznij nagrywać sygnał.
    6. Włącz ciśnienie w mankietach.
    7. Rejestruj tętno i ciśnienie skurczowe, aż ciśnienie w mankietach zostanie całkowicie uwolnione.
    8. Upewnij się, że sygnał przywrócenia tętna zwierzęcia jest wyraźnie widoczny.
    9. Powtórz kroki 4.4.3-4.4.5. Jeszcze dwa razy i uwolnić zwierzę z paralizatora.
    10. Oblicz średni puls i ciśnienie skurczowe na podstawie trzech pomiarów.
  8. Mierz szybkość oddechu i objętość oddechu tuż przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 i 7 dni po CAE, używając komputerowego systemu do pomiaru ciśnienia krwi i parametrów oddechowych.
    1. Zabezpiecz zwierzę w jednej ręce w naturalnej pozycji.
    2. Załóż maskę z rurką podłączoną do nosa zwierzęcia.
      UWAGA: Zwierzę potrzebuje czasu, aby przyzwyczaić się do oddychania przez maskę.
    3. Upewnij się, że zwierzę jest uspokojone.
    4. Rejestruj objętość oddechu i częstość oddechu przez 10 sekund.
    5. Upewnij się, że zwierzę nie westchnęło ani nie przełknęło podczas nagrywania.
    6. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.3 jeszcze dwa razy.
    7. Oblicz średnią objętość oddechową i częstość oddechu na podstawie trzech pomiarów.
    8. Oblicz objętość minutową oddechu oddechowego według wzoru:
      Minimalna objętość oddechowa = Szybkość oddechu × Objętość oddechu.

5. Ocena parametrów funkcjonalnych i behawioralnych

  1. Oceń stan neurologiczny zwierzęcia za pomocą skali 0-5 punktowej: 0 = brak deficytu neurologicznego, 1 = niemożność pełnego wyprostowania kończyny, 2 = rotacja, 3 = utrata wsparcia kończyn, 4 = brak spontanicznego chodzenia z obniżonym poziomem świadomości oraz 5 = śmierć15.
  2. Oceniaj funkcje motoryczne i koordynację na prętach rota-rod tuż przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE.
    1. Szkol zwierzęta do testów na urządzeniu Rota Rod.
      1. Umieść zwierzę na nieruchomym prętie na 5-30 sekund.
      2. Zwierzęta zdolne utrzymać nieruchomą pręt przez co najmniej 10 sekund mają bieg na prętze obracającym się z minimalnym przyspieszeniem przez około 30 sekund.
      3. Kontynuuj trening zwierząt, aż będą mogły swobodnie stać na wędce obracającej się z odpowiednim przyspieszeniem.
    2. Umieść zwierzęta na obracającym się poziomym prętze o średnicy 7 cm z minimalną prędkością 1 obr./min.
    3. Przyspieszenie 1 obr./min co 10 s do maksymalnej prędkości 60 obr./min.
    4. Zarejestruj czas, jaki szczur przebywał na obracającym się prętze.
  3. Oceniaj aktywność lokomotoryczną szczurów tuż przed CAE oraz 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE, korzystając z komputerowego systemu.
    1. Umieść zwierzę na środku otwartego pola i przez 5 minut zapisuj przebyty dystans oraz czas aktywności szczura.
  4. Oceń siłę chwytu kończyn przednich na 3 godziny, 24 godziny, 4 dni i 7 dni po CAE na mierniku siły chwytu.
    1. Trzymaj zwierzęta za ogon i pozwól mu chwycić pręty przednimi kończynami.
    2. Przeciągnij zwierzę równolegle do kraty, aż szczur zwolni kratę.
    3. Wykonaj trzy próby i wybierz najlepszy wynik.

6. Ocena poziomu białka B (S100b) wiążącego wapń w S100

  1. Zmierz poziom S100b w surowicy u szczurów przed modelowaniem CAE, 24 godziny i 7 dni po CAE.
    1. Włóż zwierzę do paralizatora laboratoryjnego.
    2. Włącz termofor i podgrzej go do temperatury 40 °C.
    3. Umieść zwierzę w paralizerze laboratoryjnym na termoforze. Poczekaj 5 minut, aby zwierzę się uspokoiło.
    4. Połóż zwierzę na boku.
      UWAGA: Żyła ogonowa powinna być widoczna na ogonie.
    5. Wprowadź dożylny cewnik do żyły ogonowej.
    6. Pobierz 1 ml krwi do probówki o pojemności 1,5 mL.
    7. Pozwól krwi stać w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
    8. Próbkę krwi wiruj w 4 °C przez 15 minut w dawce 1500 x g.
    9. Pobierz surowicę za pomocą automatycznej pipety do osobnej probówki 1,5 mL.
      UWAGA: Surowica musi być przezroczysta i przezroczysta, bez czerwonego domieszenia erytrocytów.
    10. Przeanalizuj surowicę za pomocą enzymatycznego immunosorbentu (ELISA) przy użyciu odpowiedniego zestawu ELISA.

7. Usunięcie cewnika

  1. Procedurę usunięcia cewnika wykonaj 24 godziny po CAE, po badaniach w kroku 5.
    1. Umieść zwierzęta w komorze wdechowej z podłączonym systemem znieczulenia gazowego i koncentratorem tlenu na 1-2 minuty z dopływem izofluranu w komorze o objętości 2,5%-3,5% i przepływie tlenu 3 L/min.
    2. Przenieś zwierzę na poduszkę grzewczą (37,5 °C) z gazem maskowym w trybie dozowania izofluranu 2%-3% i przepływem tlenu 1,0-2,0 L/min.
    3. Przetnij flagę, nie przecinając szwu rany ani nie uszkadzając cewnika.
    4. Oczyść zewnętrzny koniec cewnika, poddaj roztwor dezynfekujący (0,5% chlorheksydyny biglukonian w 70% etanolu).
    5. Usuń szew z poprzedniej operacji po stronie brzusznej szyi. Przez nacięcie użyj kleszczy, aby delikatnie odizolować helisę cewnika.
    6. Wyciągnij długi koniec cewnika przez nacięcie brzuszne.
    7. Załóż ligaturę z węzłem, bez zaciskania, na tętnicy szyjnej zewnętrznej między rozgałęzieniem a miejscem wszczepienia cewnika.
    8. Ostrożnie przetnij węzły wiążące cewnik, wyciągnij cewnik kleszczemi, zaciśnij węzeł na naczyniu i ponownie zawiązuj.
    9. Przytnij końce więz i zszyj ranę. Użyj szwu ciągłego.

8. Ocena barwienia chlorkiem trójbiegottetrazolu

  1. Udzielenie znieczulenia terminalnego 6 zwierzętom z grupy pozorowanej i 6 osobom z grupy CAE 24 godziny po okluzji, a 6 zwierzętom z grupy pozorowanej i 10 zwierzętom z grupy CAE 7. dnia po CAE, stosując intramięśniowy zastrzyk tyletaminy 15 mg/kg oraz zolazepam 15 mg/kg + chlorek ksylazyny 10 mg/kg.
  2. Sprawdź, czy etap operacji znieczulenia został osiągnięty zgodnie z krokiem 1.3.
  3. Wykonaj całkowite pobieranie krwi z żyły ogonowej strzykawką 2 mL i igłą 24 G.
  4. Otwórz grzbietową sklepienie czaszki, nie uszkadzając tkanki mózgowej.
  5. Zbadaj oponę twardą mater.
  6. Przetnij mózg mikrotomowym ostrzem na 2 mm grube przekroje czołowe, zaczynając od płata czołowego.
  7. Umieść te przekroje na szkiełku mikroskopowym.
  8. Umieść plasterki w roztworze 1% trójhenetytetrazolu (TTC) i umieść je w termostacie w temperaturze 37 °C na 10-12 minut.
  9. Zbadaj wszystkie przekrzepje mózgu. Obserwuj zmianę koloru barwienia TTC.
    UWAGA: Nieuszkodzona tkanka zabarwi się na jaskrawo różowo, natomiast tkanka z uszkodzeniami na jasnoróżowo.
  10. Fotografuj kawałki z obu stron.
  11. Utrwal plasterki w 10% neutralnym roztworze formaliny buforowanej.
  12. Oszacuj obszar ogniskowej zmiany w oprogramowaniu do naukowej analizy obrazów.

9. Ocena barwienia hematoksyliny i eozyny

  1. Odwodnienie utrwala cięcia mózgu w rosnącej baterii etanolu (70%, 80%, 100%).
  2. Mocz wysuszone plastry w parafinie i rób kawałki o grubości 7 mm.
  3. Pokoloruj fragmenty hematoksyliną i eozyną.
  4. Przeprowadzenie mikroskopowej analizy przekrojów za pomocą mikroskopu przepuszczonego światła.

10. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadz analizę statystyczną w programie statystycznym.
  2. Zastosuj statystyki opisowe (oblicz średnią ± błąd standardowy średniej) i twórz wykresy do wizualizacji wyników.
  3. Po sprawdzeniu normalności każdej grupy wykonaj wiele porównań według kryterium rangi Duncana.
  4. Określ różnice na poziomie istotności 5%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeżycie i ogólny stan
Bezpośrednio po podaniu pęcherzyka wszystkie szczury wykazywały stan zaburzeń i wyraźny drżenie trwające kilka sekund, po czym nastąpiło zaprzestanie aktywności motorycznej i utrata przytomności na 1-2 minuty. Niektóre zwierzęta straciły wsparcie na łapach na 10-15 minut po odzyskaniu przytomności.

Wskaźnik przeżywalności zwierząt 3 godziny po CAE wynosił 100%, ale po 24 godzinach wskaźnik spadł do 80%, a trzeciegodnia wyniósł 60%. Podcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MCAO jest powszechną metodą modelowania ogniskowego udaru niedokrwiennego u szczurów, osiąganą przez powstawanie zakrzepa, miejscowy skurcz środkowej tętnicy mózgowej oraz tymczasową okluzję przez filament2. Celem takich modeli jest (1) osiągnięcie ogniskowej apoptozy tkanki nerwowejmózgu 16 ze standaryzowaną objętością zmian i powierzchnią17, (2) monitorowanie deficytu neurologicznego zwierząt przez 2-7 dni18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie to zostało wsparte przez Rosyjską Fundację Nauki, projekt nr 25-15-00037.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 3-składnikowa z igłą 2 mL  LEIKO52322223G
Aladyn, pojedyncza pompa infuzja.Światowe Precyzyjne InstrumentyAL-1000
CyprofloksacynaPharmavet38977445% roztwór cyprofloksacyny
Komputerowy system PowerLab 8/35 ADInstrumenty3508-1090
DezinApteka.ru0,5% chlorheksydyny biglukonian w 70% etanolu
Termometr cyfrowyB.Well, Swiss AGLOT 0413
Miernik wytrzymałości chwytu w dynamometrzeBioMed Easy Technologies007231024415MC01
Zestaw ELISA dla białka B wiążącego wapń S100 (S100B)CLOUD-CLONE CORP. (CCC)SEA567Ra48T
Żyłka wędkarskaŚrednica 0,9 mm
System znieczulenia gazowegoUGO BASILE 21100
Oprogramowanie statystyczne GraphPadPryzmatv.10
Dyrektor z rowkowanym igłąFisher ScientificNr katalogowy 11-0012,7 cm
HeparynaEndopharm. Moskiewski zakład hormonalny30122
ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia oraz Laboratorium Optycznej i Obliczeniowej Instrumentacji
Strzykawka insulinowaProdukty szpitalne SFM1603030,5 mL, U-100, 30G
Cewnik dożylnyKD MedicalG24
Izofluran (Izoflurin)Vetpharma100 mL, 1000 mg/kg
Paralizator zwierząt laboratoryjnych dla zwierząt laboratoryjnychOtwarta naukaAE1001-R1
Mikroskop świetlnyZEISSAxio Scope.A1
Preparaty mikroskopii świetlnejThermo Scientific15442933
Mikrorurki medycznej jakości polietylenuScientific Commodities Inc.BB31695-PE/4Średnica wewnętrzna 0,76 mm
Medyczne sterylne chusteczki gazoweNowe życie 45x29 CM
MikrorurkaSARSEDT AG & Kompania KGS0443781,5 mL
Micropipette Eppendorf Research PlusEppendorf200 & mikro; L
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific11562203
Mikrochirurgiczne kleszcze (zakrzywione)Zakład Instrumentów Medycznych w KazaniuF0106
Mikrochirurgiczne kleszcze (proste)Nauki o życiu z napędem na tylne kołaF11029-11
Łopatki mikrotomoweThermo Scientific3052835MX35 Premier+
System wielokondycjonowaniaSystemy TSE131202-10
Neutralna formalina buforowanaHem1072024pH 6,8-7,2 
Niewchłaniający Lawsan chirurgicznyLintex2022-01
Nożyczki okulistyczne do irektomiiCM InstrumenteAJ-410-05
Koncentrator tlenuUzbrojonyYYT327009607F-3L
Bufor fosforanowyAMRESCO2120C462
Końcówki PiptteServicebio200 & mikro; L
Szczuryuzyskane z Laboratorium Zwierząt Żółkowych" Pushchino" (www.spf-animals.ru), Instytut Chemii Bioorganicznej im. Immiakina-Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk.
Wielofunkcyjna wirówka w laboratorium chłodnymEppendorf5804 R
Rota-Rod Rotamex-5 COLUMBUS INSTRUMENTS210426
Nożyczki METZENBAUM  Medstandart-InstrumentMT-H-256
Materiał do szycia chirurgicznegoUPROPONOWANY114/0042011124Kaproag 4/0
Stół chirurgicznyVetKormTorgVETBOT STL-1, TD00472
TelazolZoetis67291350 mg/mL tiletaminy i 50 mg/mL zolazepam w 5 mL
Trifenylottetazol chlorekDia-MTTC1809
KsylazynaNITA-FARM1512% chlorowodorku ksylazyny w 50 mL

Bibliografia

  1. Søyland, M. H., Tveiten, A., Eltoft, A., Øygarden, H., Varmdal, T., Indredavik, B., et al. Wake-up stroke and unknown-onset stroke: Occurrence and characteristics from the nationwide Norwegian Stroke Register. Eur Stroke J. 7 (2), 143-150 (2022).
  2. Li, Y., Zhang, J. Animal models of stroke. Animal Model Exp Med. 4 (3), 204-219 (2021).
  3. Brunner, C., Korostelev, M., Raja, S., Montaldo, G., Urban, A., Baron, J. C. Evidence from functional ultrasound imaging of enhanced contralesional microvascular response to somatosensory stimulation in acute middle cerebral artery occlusion/reperfusion in rats: A marker of ultra-early network reorganization. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1690-1700 (2018).
  4. Buetefisch, C. M., Wei, L., Gu, X., Epstein, C. M., Yu, S. P. Neuroprotection of low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation after ischemic stroke in rats. Ann Neurol. 93 (2), 336-347 (2023).
  5. Jin, R., Zhu, X., Li, G. Embolic middle cerebral artery occlusion (MCAO) for ischemic stroke with homologous blood clots in rats. J Vis Exp. (91), e51956(2014).
  6. Shpetko, Y. Y., Filippenkov, I. B., Denisova, A. E., Stavchansky, V. V., Gubsky, L. V., Limborska, S. A., et al. Isoflurane anesthesia's impact on gene expression patterns of rat brains in an ischemic stroke model. Genes. 14 (7), 1448(2023).
  7. Toung, T. J. K., Mehr, N., Mirski, M., Koehler, R. C. Embolic occlusion of internal carotid artery in conscious rats: Immediate effects of cerebral ischemia. Physiol Rep. 11 (4), e15613(2023).
  8. Yan, J., Liu, Y., Zheng, F., Lv, D., Jin, D. Environmental enrichment enhanced neurogenesis and behavioral recovery after stroke in aged rats. Aging-US. 15 (18), 9453-9463 (2023).
  9. Jin, X., Morais, A., Imai, T., Lamb, J., Nagarkatti, K., Boisserand, L. Determinants of outcome after endovascular middle cerebral artery occlusion in rats in the SPAN trial. Stroke. 56 (9), 2734-2747 (2025).
  10. Feng, Y., et al. Activation of testosterone-androgen receptor mediates cerebrovascular protection by photobiomodulation treatment in photothrombosis-induced stroke rats. CNS Neurosci Ther. 30 (2), e14574(2024).
  11. Gubskiy, I. L., et al. MRI guiding of the middle cerebral artery occlusion in rats aimed to improve stroke modeling. Transl Stroke Res. 9 (4), 417-425 (2018).
  12. Gupta, S., Sharma, U., Jagannathan, N. R., Gupta, Y. K. Neuroprotective effect of lercanidipine in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. Exp Neurol. 288, 25-37 (2017).
  13. Gupta, Y. K., Sinha, K., Chaudhary, G. Transient focal ischemia induces motor deficit but does not impair the cognitive function in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. J Neurol Sci. 203-204, 267-271 (2002).
  14. Shukla, P. K., et al. Neuroprotective effect of Acorus calamus against middle cerebral artery occlusion-induced ischaemia in rat. Hum Exp Toxicol. 25 (4), 187-194 (2006).
  15. Schäbitz, W. R., et al. Synergistic effects of a combination of low-dose basic fibroblast growth factor and citicoline after temporary experimental focal ischemia. Stroke. 30 (2), 427-432 (1999).
  16. Tang, H., et al. Delayed recanalization after MCAO ameliorates ischemic stroke by inhibiting apoptosis via HGF/c-Met/STAT3/Bcl-2 pathway in rats. Exp Neurol. 330, 113359(2020).
  17. Lee, K. Y., Bae, O. N., Weinstock, S., Kassab, M., Majid, A. K. Neuroprotective effect of asiatic acid in rat model of focal embolic stroke. Biol Pharm Bull. 37 (8), 1397-1401 (2014).
  18. Li, L., Rong, W., Ke, W., Hu, Z., Yip, S. P., Tong, K. Y. Muscle activation changes during body weight support treadmill training after focal cortical ischemia: A rat hindlimb model. J Electromyogr Kinesiol. 21 (2), 318-326 (2011).
  19. Palikov, V. A., et al. Experimental model of cerebral arterial air embolism in conscious rats. Bull Exp Biol Med. 177 (5), 668-672 (2024).
  20. Kusuda, K., Ibayashi, S., Sadoshima, S., Ishitsuka, T., Fujishima, M. Brain ischemia following bilateral carotid occlusion during development of hypertension in young spontaneously hypertensive rats--importance of morphologic changes of the arteries of the circle of Willis. Angiology. 47 (5), 455-465 (1996).
  21. Webster, J., Osborne, S., Rickard, C. M., Marsh, N. Clinically-indicated replacement versus routine replacement of peripheral venous catheters. Cochrane Database Syst Rev. 1 (1), CD007798(2019).
  22. Okuyama, S., et al. The arterial circle of Willis of the mouse helps to decipher secrets of cerebral vascular accidents in the human. Med Hypotheses. 63 (6), 997-1009 (2004).
  23. Mamo, Y. A. Cerebrovascular effects of vasoactive drugs: in vitro, in vivo and clinical investigations. Medicine. , 73874537(2015).
  24. Stangeland, H., Orgeta, V., Bell, V. Poststroke psychosis: A systematic review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 89 (8), 879-885 (2018).
  25. Mercier, E., et al. Predictive value of S-100β protein for prognosis in patients with moderate and severe traumatic brain injury: Systematic review and meta-analysis. Br Med J (Clin Res Ed). 346, f1757(2013).
  26. Baig, M. U., Bodle, J. Thrombolytic Therapy. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  27. Murphy, R. P., Donnellan, J. A High-pressure solution for a high-pressure situation: Management of cerebral air embolism with hyperbaric oxygen therapy. Cureus. 11 (9), e5559(2019).
  28. Heinrichs, S. C., Koob, G. F. Application of experimental stressors in laboratory rodents. Curr Proto. Neurosci. Chapter 8 (Unit 8.4), (2006).
  29. Emms, H., Lewis, G. P. Sex and hormonal influences on platelet sensitivity and coagulation in the rat. Br J Pharmacol. 86 (3), 557-563 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zator gazowymodel udarumier neuron wdeficyty behawioralnezaburzenia autonomicznezmiany histopatologicznebadania przedkliniczne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.