Mechanizm molekularny hydroksylowego żółtego A w chorobie zwyrodnieniowej stawów kolana poprzez modulację autofagii poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3

Jako powszechna przewlekła choroba ortopedyczna, choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) dotyka osoby w średnim i starszym wieku, znacząco wpływając na ich jakość życia ^1,2. Pomimo powszechnego występowania, dokładna etiologia i mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw KOA pozostają niew w pełni poznane. Ponadto zarówno profilaktyka, jak i leczenie lecznicze podkreśla pilność rozwikłania złożonych patologicznych podstaw tego schorzenia. Jednym z obszarów rosnącego zainteresowania jest rola autofagii w homeostazie chrząstki, a coraz więcej dowodów sugeruje, że zmniejszona autofagia w tkance chrząstki przyczynia się do jej degeneracji w KOA ^3,4.

Autofagia, proces degradacji komórkowej niezbędny do utrzymania homeostazy komórkowej, ma ogromne znaczenie w utrzymaniu i naprawie chrząstki. W mikrośrodowisku hipoksyjnym dominującym w chrząstce stawowej, szlak sygnalizacyjny czynnika 1α (HIF-1α)/adenowirusa E1B 19 kDa (BNIP3) oddziałującego na białko 3 (BNIP3) pojawia się jako kluczowy regulator autofagii. Zaobserwowano podwyższoną ekspresję HIF-1α u pacjentów z KOA, co sugeruje, że zaburzenia regulacji tego szlaku mogą przyczyniać się do zaburzeń autofagii i późniejszej degeneracji chrząstki ^5,6,7.

Akupunktura, moksybustia, zioła i masaż to cztery klasyczne metody tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu zapalenia stawów kolan. Obecne leczenie, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, zastrzyki z kwasem hialuronowym oraz artroplastyka, okazały się skuteczne, ale również wiązały się z pewnymi skutkami ubocznymi⁸. Ponadto nie zaleca się rutynowego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów kolan. Z biegiem czasu, jako powszechna terapia uzupełniająca KOA, Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) opracowała liczne ziołowe środki, które wykazują obiecujące szanse w leczeniu^{KOA 9}. Wśród nich Hydroxyl safflower Yellow A zyskał znaczną uwagę ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne i modulujące autofagię^10,11. Jednak dokładne mechanizmy, dzięki którym HSYA wywiera swój terapeutyczny wpływ na chorobę zwyrodnieniową stawów kolana (KOA), szczególnie w zakresie regulacji autofagii poprzez szlak HIF-1α/BNIP3, pozostają niejasne. Dlatego badamy mechanizm terapeutycznych efektów HSYA w KOA, koncentrując się na jego wpływie na autofagię chondrocytów oraz interakcji z szlakiem HIF-1α/BNIP3. Hipotezujemy, że HSYA łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez wzmacnianie autofagii i proliferacji chondrocytów, jednocześnie hamując apoptozę i stan zapalny poprzez hamowanie szlaków HIF-1α/BNIP3.

Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Centralnego Szpitala Ludowego w Zhanjiang (Z. Zatwierdzenia nr KY-YS-2021-09). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pacjenci i projekt badań

Zrekrutowano trzydziestu pacjentów z diagnozą zwyrodnieniowego stawów kolana (KOA) i poddawanych całkowitej artroplastyce kolana. W grupie było 14 mężczyzn i 16 kobiet w wieku 52-75 lat (średnia ± SD: 64,3 ± 12,6 lat), wszyscy spełniający kryteria KOA American College of Rheumatology¹². Pacjenci byli wykluczeni, jeśli otrzymali niesteroidowe leki przeciwzapalne lub sterydy w ciągu 2 tygodni przed operacją lub w ciągu miesiąca iniekcji śródstawowych.

2. Pierwotna hodowla chondrocytów

Chrząstka stawowa była pobierana w warunkach sterylnych bezpośrednio po operacji i umieszczana w zimnym PBS. Za pomocą sterylnych skalpeli chrząstkę pocięto na fragmenty o grubości ~1 mm³ na lodowato zimnej szklanej płycie i przenoszono do 50 mL rurki wirówki zawierającej 10 mL 0,25% trypsyny-EDTA. Rurka była inkubowana w wodnej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C z częstotliwością 80 obr./min przez 30 minut, a następnie delikatnie odwracana co 5 minut, aby ułatwić trawienie. Supernatant był zasysany, a granulka tkankowa była myta raz PBS i wirowana w 200 × g przez 5 minut. Następnie pellet był ponownie zawieszany w 10 mL kolagenazy typu II o stężeniu 0,02% i trawiony w 37 °C przez 4 godziny przy wstrząsaniu. Zawieszenie było podsuwane i opuszczane co 30 minut, aby wspomóc dysocjację, przechodziło przez sitko o średnicy 70 μm, a następnie ponownie wirowało w 200 × g przez 5 minut. Powstały pellet został ponownie zawieszony w DMEM uzupełnionym o 10% FBS, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny i zasiewany do koleb T25. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C z 5%_CO2, podłoże wymieniano co 2-3 dni, a komórki z przepustek 1-2 wykorzystywano do eksperymentów. Grupy eksperymentalne obejmowały kontrolę w formie normalnej, model pusty, HSYA (100 μmol/L), inhibitor HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), rapamycynę (10 nmol/L), HSYA + YC-1 oraz HSYA + rapamycynę.

3. Stuknięcie HIF-lα, BNIP3 pośredniczone przez siRNA

Pierwotne chondrocyty były zasiewane na płytkach 6-dołków w dawce 2-5 ×^{10 5 komórek} /dołek i hodowane w temperaturze 37 °C, aż osiągnęły łączność 30%-50%. Dla każdej dołki rozcieńczono 5 μL siRNA 20 μM w 250 μL Opti-MEM, a 5 μL odczynnika transfekcyjnego opartego na lipidach rozcieńczono osobno w 250 μL Opti-MEM. Oba roztwory były delikatnie mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut, tworząc kompleksy. Pożywka hodowlana została zastąpiona 1,5 mL świeżego DMEM z 10% FBS, a kompleks siRNA-lipidowy (500 μL) został dodany kropelo wzdłuż ściany studni z delikatnym wirowaniem. Komórki inkubowano przez 6 godzin, podłoże zastąpiono kompletnym podłożem, a hodowla kontynuowano przez 48-72 godziny. Skuteczność skalibracji została zweryfikowana za pomocą qRT-PCR oraz Western blot przed dalszymi zabiegami.

4. ELISA

Pobrano supernatanty hodowli komórkowych, wirowano w dawce 200 × g przez 5 minut i rozcieńczono w 1:2 w buforze testowym, gdy było to konieczne. Zestawy ELISA dla IL-1β, TNF-α i IL-6 były stosowane zgodnie z protokołem producenta. Standardy, puste egzemplarze i próbki były testowane w trzech egzemplarzach. Po reakcji substratowej absorbancję zmierzono na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt w ciągu 15 minut.

5. Test MTT

Chondrocyty były zasiewane na płytkach 96-dołkowatych o objętości 5 000 komórek/dołek w 100 μL kompletnego nośnika i inkubowane przez 0 godzin, 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny. W każdym momencie czasowym bezpośrednio do każdego odwiertu dodawano 20 μL roztworu MTT (5 mg/mL w PBS), a płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż na dnie otworów pojawiły się fioletowe kryształy formazonu. Supernatant był ostrożnie wsysany, nie naruszając kryształów, do każdego dołku dodawano 150 μL DMSO, a płytki umieszczano na wstrząsance przy 100 obr./min na 10 minut, aby całkowicie rozpuścić kryształy. Absorpcję zmierzono na poziomie 490 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Krótki czas inkubacji został wybrany, aby uniknąć nasycenia sygnałem w komórkach o wysokiej aktywności metabolicznej.

6. Cytometria przepływowa

Komórki były pobierane trypsynizacją, wirowane w stężeniu 200 × g przez 5 minut i dwukrotnie myte zimnym PBS. Zostały one ponownie zawieszone w 500 μL buforu wiążącego przy ~1 × 10^{6 komórek} /mL, a następnie dodano 5 μL Annexin V-FITC i 5 μL PI. Po delikatnym mieszaniu komórki były inkubowane przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Próbki zostały przeanalizowane na cytometrze przepływowym, z co najmniej 10 000 zdarzeń zebranych na próbkę (wzbudzenie 488 nm, emisja FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Komórki apoptotyczne były ilościowe za pomocą standardowego oprogramowania.

7. Western blotting

Komórki były dwukrotnie płukane zimnym PBS i lizowane w buforze 200 μL RIPA zawierającym inhibitory proteazy na lodzie przez 30 minut. Komórki były skrobane plastikowym skrobakiem, podsuwane i opuszczane pipetą w celu zmniejszenia lepkości oraz wirowane w dawce 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbierano supernatanty, a stężenia białek mierzono za pomocą testu BCA. Równe ilości białka (30 μg) były mieszane z buforem obciążającym 5×, podgrzewane w 95 °C przez 5 minut i rozdzielane na żelach SDS-PAGE o stężeniu 10%-12%. Elektroforeza była wykonywana przy napięciu 80 V przy układaniu i 120 V przy separacji, a białka były przenoszone na membrany PVDF przy napięciu 300 mA przez 90 minut. Błony były blokowane w mleku o stężeniu 5% bez tłuszczu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z użyciem przeciwciał podstawowych (1:1 000). Po trzech płukaniach TBST błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (1:5 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą substratu ECL i obrazowane za pomocą systemu detekcji chemiluminescencji przy ekspozycji 30-120 sekund. Intensywności pasmowe były kwantyfikowane za pomocą ImageJ, a GAPDH używano jako kontroli obciążenia.

8. Barwienie monodansylkadaweryną (MDC)

Bezpośrednio przed użyciem przygotowywano roztwór roboczy MDC o pojemności 50 μM, z roztworu zapasowego. Komórki były utrwalane 1 mL 4% paradehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, dwukrotnie myto PBS i inkubowano w roztworze roboczego MDC o stężeniu 500 μL przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Po dwóch płukaniach PBS, pokrywki zostały zamontowane z medium antyfade i obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie 355 nm, emisja 512 nm).

9. Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Komórki były pobierane i granulowane przez wirowanie w stężeniu 200 × g przez 5 minut, a następnie utrwalano w 2% glutaraldehydu w temperaturze 4 °C na noc. Próbki były myte trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy, a następnie utrwalane w 1% czterotlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w okapie spalającego. Odwodnienie przeprowadzano poprzez stopniową serię acetonów obejmującą 30%, 50%, 70%, 90% i 100% przez 10 minut każda. Próbki były infiltrowane żywicą acetonową/epoksydową 1:1 przez godzinę, a następnie przez noc czystą żywicą. Osadzenie przeprowadzono w świeżej żywicy i polimeryzowano w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Ultracienkie przekroje o średnicy 50-70 nm były cięte ultramikrotomem, montowane na miedzianych kratkach o średnicy 200 siatek, barwione 2% octanem uranilu przez 30 minut, następnie cytrynianem ołowiu przez 15 minut, myte wodą destylowaną, suszone na powietrzu i badane pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV. Dla bezpieczeństwa, glutaraldehyd i czterotlenek osmu są toksyczne i lotne i należy je obchodzić wyłącznie w okapie oparowym, rękawiczkach i okularach ochronnych. Odpady powinny być utylizowane w wyznaczonych pojemnikach niebezpiecznych zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.

10. Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Dane wyrażane są jako średnia ± SD. Istotność statystyczna oceniono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu LSD post hoc, przy czym P < 0,05 uznano za istotne.

Wpływ HSYA na ekspresję prozapalnych cytokin chondrocytów (IL-1β, TNF-α, IL-6)
W porównaniu z grupą kontrolną w normie, wszystkie pozostałe grupy wykazały istotnie podwyższone poziomy cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α i IL-6) (P < 0,05, Tabela 1, rysunek 1A-G). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α, induktorem autofagii, inhibitorem HSYA + HIF-1α lub induktorem HSYA + autofagii istotnie obniżyło poziom cytokin w porównaniu do grupy modelowej pustej (P < 0,05). Wśród nich połączone terapie (HSYA + inhibitor HIF-1α lub HSYA + induktor autofagii) dodatkowo zmniejszały ekspresję cytokin, z obniżeniem o około 35%-40% w porównaniu z grupą modelową (P < 0,05). W eksperymentach z interferencją genów (Rysunek 1H-J) wyniszczenie siRNA HIF-1α lub BNIP3 doprowadziło do obniżenia poziomu cytokin o ~25%-30% w porównaniu z grupą model+pustą. Leczenie HSYA dodatkowo wzmocniło te efekty. Konkretnie, poziomy cytokin w grupie siHIF-1α + HSYA były ~20% niższe niż w grupie siHIF-1α+ puste, a poziomy w grupie siBNIP3 + HSYA były ~22% niższe niż w grupie siBNIP3 + puste (P < 0,05).

Wpływ HSYA na proliferację chondrocytów
Grupa kontrolna wykazała aktywność proliferacji na poziomie wyjściowym, podczas gdy grupa z modelem pustym wykazała istotne zmniejszenie (P < 0,05, rysunek 2A). Proliferacja została częściowo przywrócona po leczeniu HSYA, inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii i znacznie wzmocniona przez połączenie inhibitorów HSYA + HIF-1α lub HSYA + induktorów autofagii (P < 0,05). W eksperymentach siRNA (Rysunek 2B) obniżenie poziomu HIF-1α lub BNIP3 sprzyjało proliferacji o ~25% w porównaniu z grupą kontrolną modelu. Leczenie HSYA dodatkowo zwiększyło proliferację, co skutkowało ~40% wyższą proliferacją w porównaniu z grupą modelową (P < 0,05).

Wpływ HSYA na apoptozę i ekspresję białek związanych z autofagią w chondrocytach
Analiza Western blot wykazała istotne różnice w ekspresji białek między grupami (Tabela 2). Grupa z modelem pustym wykazała wyraźne podwyższenie HIF-1α oraz zmniejszoną ekspresję LC3, P62, Beclin1 i BNIP3 w porównaniu z grupą kontrolną (P < 0,05). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii zwiększyło ekspresję LC3, P62, Beclin1 i BNIP3 oraz obniżyło poziomy HIF-1α (P < 0,05). Połączone terapie z inhibitorem HSYA + HIF-1α lub HSYA + induktorem autofagii przyniosły największe zmiany, przy czym poziomy LC3 i Beclin1 były niemal dwukrotnie wzrószone w porównaniu z grupą modelową z pustymi testami. Chociaż P62 zazwyczaj jest obniżona po aktywacji autofagii, tutaj jego poziom wzrastał po leczeniu HSYA. Może to wskazywać na zwiększone nagromadzenie autofagosomów lub niepełny przepływ, zjawisko również opisane w wcześniejszych badaniach autofagii chondrocytów.

Wpływ HSYA na tempo apoptozy w chondrocytach
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że grupa modelu pustego wykazywała istotnie wyższy wskaźnik apoptozy niż grupa kontrolna z normą (P < 0,05, rysunek 3A,B). HSYA, inhibitor HIF-1α oraz induktor autofagii zmniejszały apoptozę, podczas gdy terapie połączone (HSYA + inhibitor HIF-1α lub HSYA + induktor autofagii) dały najniższe wskaźniki apoptozy, z redukcją o ~45%-50% w porównaniu z grupą modelową z pustymi testami (P < 0,05). W eksperymentach siRNA apoptoza była również zmniejszana przez obniżenie poziomu HIF-1α lub BNIP3, a dodatkowo redukowana przez leczenie HSYA.

Wpływ HSYA na tempo apoptozy i tworzenie pęcherzyków autofagicznych w chondrocytach
Barwienie MDC i obrazowanie TEM wykazały wyraźne różnice w formowaniu pęcherzyków autofagicznych między grupami (Rysunek 4A-D). Grupa z modelem pustym wykazywała rzadki rozkład pęcherzyków, podczas gdy HSYA, inhibitor HIF-1α lub induktory autofagii zwiększały liczbę pęcherzyków. Terapie połączone (HSYA + inhibitor HIF-1α lub HSYA + induktor autofagii) przyniosły najbardziej wyraźne wzmocnienie, z około dwukrotnie większą liczbą pęcherzyków zaobserwowanych przez TEM w porównaniu z grupą modelową. Zgodnie z tymi wynikami, wskaźniki apoptozy mierzone cytometrią przepływową (Rysunek 5A-E) były najniższe w grupach poddanych łącznemu leczeniu.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Wszystkie dane uzyskane w tym badaniu są zawarte w Pliku Uzupełniającym 1.

Rysunek 1: Ekspresja prozapalnych cytokin chondrocytów (IL-1β, TNF-α, IL-6) w każdej grupie (n = 3). (A-G) Poziomy ekspresji białek IL-1β, TNF-α i IL-6 zostały wykryte metodą Western blotting (WB). (H-J) Zawartość IL-1β, TNF-α i IL-6 została zmierzona za pomocą enzymatycznego immunosorbentnego testu (ELISA) (P < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Porównanie aktywności proliferacji chondrocytów w każdej grupie (n = 3). (A) Grupy leczone, oraz (B) grupy z wykluczeniem HIF-1α i BNIP3, P< 0,05. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Porównanie tempa apoptozy każdej grupy (n = 3). (A) 1, Grupa normalna; 2, Grupa Modelowa; 3, grupa HSYA; 4, grupa inhibitorowa HIF-1α; 5, Grupa autofagii; 6, grupa inhibitorów HSYA + HIF-1α; 7, grupa induktorowa HSYA + autofagia. (B) Grupy niszczące geny HIF-1α i BNIP3. W porównaniu do normalnej grupy kontrolnej, *P < 0,05. W porównaniu do grupy modelu pustego #P< 0,05. W porównaniu do grupy inhibitorów HSYA + HIF-1α, i P< 0,05. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Obrazowanie TEM formowania pęcherzyków autofagicznych w mitochondriach. (A) Pusty model. (B) Grupa HSYA. (C) Grupa inhibitorów HIF-1α. (D) Grupa induktorowa autofagii. Pasek skali = 1 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 5: Wpływ HSYA na wskaźniki apoptozy komórek w każdej grupie (n = 3). (A) Pusty model. (B) Grupa HSYA. (C) Grupa inhibitorów HIF-1α. (D) Grupa induktorowa autofagii. (E) Całkowita analiza każdej grupy w porównaniu do normalnej grupy kontrolnej, **P< 0,01. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie poziomów cytokiny prozapalnej w każdej grupie. W porównaniu do normalnej grupy kontrolnej, *P < 0,05. W porównaniu do grupy modelu pustego #P< 0,05. W porównaniu z grupami leczonymi HASY, inhibitorem HIF-1α oraz induktorem autofagii, & P< 0,05.

Tabela 2: Porównanie białek w różnych grupach. W porównaniu do normalnej grupy kontrolnej, *P< 0,05. W porównaniu z grupami leczonymi HSYA, inhibitorem HIF-1α oraz induktorem autofagii, #P< 0,05.

Plik uzupełniający 1: Surowe dane wygenerowane podczas badania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.