Hydroksylowy Safflower Yellow A (HSYA) łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez wspomaganie autofagii i proliferacji chondrocytów, jednocześnie hamując apoptozę i stan zapalny poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Hydroksylowy Safflower Yellow A (HSYA) łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez wspomaganie autofagii i proliferacji chondrocytów, jednocześnie hamując apoptozę i stan zapalny poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3.
Redukcja autofagii w tkance chrząstki jest ściśle powiązana z rozwojem choroby zwyrodnieniowej stawów kolana (KOA), jednak mechanizmy, dzięki którym hydroksylowy żółty A (HSYA) wywiera działanie ochronne, pozostają niedo do końca poznane. W tym badaniu wyizolowano ludzkie chondrocyty KOA i przypisano do różnych grup leczenia, w tym do kontroli normalnej, modelu pustego, HSYA, inhibitora czynnika hipoksyjnego-1α (HIF-1α), induktora autofagii, HSYA w połączeniu z inhibitorem HIF-1α oraz HSYA w połączeniu z induktorem autofagii. Prozapalne cytokiny (IL-1β, TNF-α, IL-6) zostały zmierzone za pomocą ELISA, ekspresja białek HIF-1α, BNIP3 oraz markerów związanych z autofagią została zbadana metodą Western blotting, a autofagiczne pęcherzyki w mitochondriach oceniono za pomocą barwienia monodansylkadawerynowego i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W porównaniu z kontrolą kontrolną w formie normalnej, grupa z modelem bez danych wykazała istotnie podwyższone poziomy IL-1β, TNF-α, IL-6 i HIF-1α, wraz z wyższymi wskaźnikami apoptozy, zmniejszoną proliferacją oraz obniżeniem poziomu białek związanych z autofagią (P < 0,05). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii znacząco zwiększyło ekspresję białek związanych z autofagią oraz obniżyło poziom cytokiny zapalnej. Ponadto HSYA w połączeniu z inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii wywołała najbardziej wyraźne efekty, z wyraźnym zmniejszeniem uwalniania cytokin i apoptozy, a także zwiększoną proliferacją chondrocytów i formowaniem mitochondrialnych pęcherzyków autofagicznych (P < 0,05). Wyniki te pokazują, że HSYA wywiera działanie chondrogprotekcyjne u KOA, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3, co sprzyja autofagii i łagodzi uszkodzenia zapalne w chondrocytach.
Jako powszechna przewlekła choroba ortopedyczna, choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) dotyka osoby w średnim i starszym wieku, znacząco wpływając na ich jakość życia 1,2. Pomimo powszechnego występowania, dokładna etiologia i mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw KOA pozostają niew w pełni poznane. Ponadto zarówno profilaktyka, jak i leczenie lecznicze podkreśla pilność rozwikłania złożonych patologicznych podstaw tego schorzenia. Jednym z obszarów rosnącego zainteresowania jest rola autofagii w homeostazie chrząstki, a coraz więcej dowodów sugeruje, że zmniejszona autofagia w tkance chrząstki pr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Centralnego Szpitala Ludowego w Zhanjiang (Z. Zatwierdzenia nr KY-YS-2021-09). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Pacjenci i projekt badań
Zrekrutowano trzydziestu pacjentów z diagnozą zwyrodnieniowego stawów kolana (KOA) i poddawanych całkowitej artroplastyce kolana. W grupie było 14 mężczyzn i 16 kobiet w wieku 52-75 lat (średnia ± SD: 64,3 ± 12,6 lat), wszyscy spełniający kryteria KOA....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wpływ HSYA na ekspresję prozapalnych cytokin chondrocytów (IL-1β, TNF-α, IL-6)
W porównaniu z grupą kontrolną w normie, wszystkie pozostałe grupy wykazały istotnie podwyższone poziomy cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α i IL-6) (P < 0,05, Tabela 1, rysunek 1A-G). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α, induktorem autofagii, inhibitorem HSYA + HIF-1α lub induktorem HSYA + autofagii istotnie obniżyło poziom cytokin w porównani.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), powszechna choroba przewlekła, znacząco pogarsza jakość życia pacjentów. Spośród różnych podtypów OA, KOA jest najczęstszy, przyczyniając się do globalnego obciążenia chorobami. Pomimo wysokiej częstości występowania, dokładna etiologia i podstawowe mechanizmy patofizjologiczne KOA pozostają nieuchwytne. Złożona interakcja między procesami mechanicznymi i biochemicznymi w chrząstce stawowej, szczególnie regulacja funkcji chondrocytów, jest kluczowa w patogenezie KOA. Warto zauważyć, że.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.
Prace te były wspierane przez Biuro Medycyny Chińskiej prowincji Guangdong
(Grant nr 20221446).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% czterotlenku osmu | Nauki o mikroskopii elektronowej | 19150 | Dalsze poprawki i barwienia próbek do analizy TEM |
| 2% glutaraldehydu | Sigma-Aldrich | G5882 | Fiksuje komórki do przygotowania próbek TEM |
| 4% paradehydu | Servicebio | G1101 | Utrwala komórki do barwienia MDC i przygotowania próbek TEM |
| AG1478 | Selleck Corporation | S1005 | 20 mg/kg dożylnie, inhibitor kinazy receptora ErbB w modelu szczura |
| Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI | Biobagno | BS3030 | Barwi komórki apoptotyczne do wykrywania cytometrii przepływowej |
| Induktor autofagii (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Rapamycyna, induktor autofagii, stosowana przy 10 nmol/L w eksperymentach z chondrocytami |
| Przeciwciało Beclin1 | Santa Cruz Biotechnology | SC-48341 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka Beclin1 związanego z autofagią |
| Przeciwciało BNIP3 | Santa Cruz Biotechnology | SC-517348 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy BNIP3 |
| Inkubator dwutlenku węgla | Yiheng | BPN-150CW | do hodowli komórek |
| Dimetylsulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Rozpuszcza kryształy formazonu w teście MTT |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Podłoże do hodowli komórkowych, uzupełnione 10% FBS do hodowli chondrocytów |
| Czytnik mikropłyt ELISA | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Mierzy wartości OD w testach ELISA i MTT |
| Reagent o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Wizualizuje pasma białek w Western Blot |
| Żywica epoksydowa (EPON812) | Nauki o mikroskopii elektronowej | 14120 | Osadza próbki do sekcjonowania TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Serum krówego płodu, dodane do DMEM dla odżywiania chondrocytów |
| Cytometr przepływowy | Beckman (wspomniany za apoptozę) | CytoFLEX S | Wykrywa tempo apoptozy chondrocytów oraz markery komórkowe |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus | IX73 | Obserwuje pęcherzyki autofagiczne barwione MDC |
| System obrazowania żelowego | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Uchwyca i ilościowo określa pasma białkowe z Western blot |
| HIF-1α Przeciwciało | Santa Cruz Biotechnology | SC-13515 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy HIF-1 i alfa; |
| HIF-1α inhibitor (YC-1) | Selleck Corporation | S1047 | HIF-1α inhibitor szlaku, stosowany w 10 & mu; mol/L w eksperymentach komórkowych |
| Wysokoobrotowa chłodzona wirówka | Eppendorf | 5430R | Używane do rozdzielania składników |
| Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Wiąże pierwotne przeciwciała do wzmacniania sygnału w Western blot |
| IL-1β Zestaw ELISA | Biologia Shenggong | C5236 | Quantifies IL-1β poziomy w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA |
| Zestaw IL-6 ELISA | Biologia Shenggong | C5237 | Ilościowo określa poziomy IL-6 w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA |
| Przeciwciało LC3 | Santa Cruz Biotechnology | SC-398822 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka LC3 związanego z autofagią |
| Lipofektamin 3000 odczynnik | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | Lipidowy odczynnik transfekcyjny do tansfekcji |
| Monodansylkadaweryna (MDC) | Sigma-Aldrich | D4008 | 0,05 mol/L, barwi pęcherzyki autofagiczne do mikroskopii fluorescencyjnej |
| MTT Reagent | Beyotime | C0009 | 0,5 mg/mL, stosowane w testie MTT do oceny proliferacji chondrocytów |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Określ stężenie RNA |
| Zestaw NRG1 ELISA | Abcam (Wielka Brytania) | ab213961 | Mierzy stężenie NRG1 w tkankach serca za pomocą ELISA |
| Przeciwciało P62 | Santa Cruz Biotechnology | SC-28359 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka P62 związanego z autofagią |
| Przeciwciało fosforylowane ErbB4 (p-ErbB4) | Powinowactwo | AF3445 | Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy aktywowanego ErbB4 |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara | RR047A | Odwrotna transkrypcja RNA w celu dostarczenia szablonów do eksperymentu qPCR |
| System PCR w czasie rzeczywistym ilościowy | Bio-Rad | CFX96 | do detekcji RT-PCR |
| Rekombinowany ludzki NRG1 (rh-NRG1) | R& D Systems | 396-HB | Iniekcja dożylna 5 mg/kg w celu aktywacji szlaku NRG1/ErbB4 w modelu szczura |
| Bufor RIPA | Meilunbio | MA0151 | Bufor lizowy z inhibitorami proteazy/fosfatazy do ekstrakcji białek |
| Żółty A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Składnik bioaktywny z Carthamus tinctorius L., stosowany w wieku 100 i mu; mol/l w leczeniu chondrocytów |
| Sprzęt SDS-PAGE | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra | Rozdziela białka według masy cząsteczkowej w Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | dla eksperymentu qPCR |
| TNF-α Zestaw ELISA | Biologia Shenggong | C5238 | Ilościowo określa TNF i alfa; poziomy w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA |
| Całkowite przeciwciało ErbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Główne przeciwciało do wykrywania całkowitego ErbB4 przez Western blot |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) | Hitachi (wspomniane dla pęcherzyków autofagicznych) | H-7650 | Obserwuje pęcherzyki autofagiczne w mitochondriach na poziomie ultrastrukturalnym |
| Odczynnik Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | do ekstrakcji RNA |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | Wykorzystywany do enzymatycznego trawienia chrząstki stawowej w celu izolowania chondrocytów |
| Kolagenaza typu II (0,02%) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Trawi tkankę chrząstki w celu izolacji chondrocytów |
| β-przeciwciało katenowe | Santa Cruz Biotechnology | SC-7963 | Wewnętrzne przeciwciało referencyjne do normalizacji Western blot |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.