Mechanizm molekularny hydroksylowego żółtego A w chorobie zwyrodnieniowej stawów kolana poprzez modulację autofagii poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3

Podsumowanie

Hydroksylowy Safflower Yellow A (HSYA) łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez wspomaganie autofagii i proliferacji chondrocytów, jednocześnie hamując apoptozę i stan zapalny poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3.

Streszczenie

Redukcja autofagii w tkance chrząstki jest ściśle powiązana z rozwojem choroby zwyrodnieniowej stawów kolana (KOA), jednak mechanizmy, dzięki którym hydroksylowy żółty A (HSYA) wywiera działanie ochronne, pozostają niedo do końca poznane. W tym badaniu wyizolowano ludzkie chondrocyty KOA i przypisano do różnych grup leczenia, w tym do kontroli normalnej, modelu pustego, HSYA, inhibitora czynnika hipoksyjnego-1α (HIF-1α), induktora autofagii, HSYA w połączeniu z inhibitorem HIF-1α oraz HSYA w połączeniu z induktorem autofagii. Prozapalne cytokiny (IL-1β, TNF-α, IL-6) zostały zmierzone za pomocą ELISA, ekspresja białek HIF-1α, BNIP3 oraz markerów związanych z autofagią została zbadana metodą Western blotting, a autofagiczne pęcherzyki w mitochondriach oceniono za pomocą barwienia monodansylkadawerynowego i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W porównaniu z kontrolą kontrolną w formie normalnej, grupa z modelem bez danych wykazała istotnie podwyższone poziomy IL-1β, TNF-α, IL-6 i HIF-1α, wraz z wyższymi wskaźnikami apoptozy, zmniejszoną proliferacją oraz obniżeniem poziomu białek związanych z autofagią (P < 0,05). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii znacząco zwiększyło ekspresję białek związanych z autofagią oraz obniżyło poziom cytokiny zapalnej. Ponadto HSYA w połączeniu z inhibitorem HIF-1α lub induktorem autofagii wywołała najbardziej wyraźne efekty, z wyraźnym zmniejszeniem uwalniania cytokin i apoptozy, a także zwiększoną proliferacją chondrocytów i formowaniem mitochondrialnych pęcherzyków autofagicznych (P < 0,05). Wyniki te pokazują, że HSYA wywiera działanie chondrogprotekcyjne u KOA, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie szlaku HIF-1α/BNIP3, co sprzyja autofagii i łagodzi uszkodzenia zapalne w chondrocytach.

Wprowadzenie

Jako powszechna przewlekła choroba ortopedyczna, choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) dotyka osoby w średnim i starszym wieku, znacząco wpływając na ich jakość życia ^1,2. Pomimo powszechnego występowania, dokładna etiologia i mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw KOA pozostają niew w pełni poznane. Ponadto zarówno profilaktyka, jak i leczenie lecznicze podkreśla pilność rozwikłania złożonych patologicznych podstaw tego schorzenia. Jednym z obszarów rosnącego zainteresowania jest rola autofagii w homeostazie chrząstki, a coraz więcej dowodów sugeruje, że zmniejszona autofagia w tkance chrząstki przyczynia się do jej degeneracji w KOA ^3,4.

Autofagia, proces degradacji komórkowej niezbędny do utrzymania homeostazy komórkowej, ma ogromne znaczenie w utrzymaniu i naprawie chrząstki. W mikrośrodowisku hipoksyjnym dominującym w chrząstce stawowej, szlak sygnalizacyjny czynnika 1α (HIF-1α)/adenowirusa E1B 19 kDa (BNIP3) oddziałującego na białko 3 (BNIP3) pojawia się jako kluczowy regulator autofagii. Zaobserwowano podwyższoną ekspresję HIF-1α u pacjentów z KOA, co sugeruje, że zaburzenia regulacji tego szlaku mogą przyczyniać się do zaburzeń autofagii i późniejszej degeneracji chrząstki ^5,6,7.

Akupunktura, moksybustia, zioła i masaż to cztery klasyczne metody tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu zapalenia stawów kolan. Obecne leczenie, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, zastrzyki z kwasem hialuronowym oraz artroplastyka, okazały się skuteczne, ale również wiązały się z pewnymi skutkami ubocznymi⁸. Ponadto nie zaleca się rutynowego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów kolan. Z biegiem czasu, jako powszechna terapia uzupełniająca KOA, Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) opracowała liczne ziołowe środki, które wykazują obiecujące szanse w leczeniu^{KOA 9}. Wśród nich Hydroxyl safflower Yellow A zyskał znaczną uwagę ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne i modulujące autofagię^10,11. Jednak dokładne mechanizmy, dzięki którym HSYA wywiera swój terapeutyczny wpływ na chorobę zwyrodnieniową stawów kolana (KOA), szczególnie w zakresie regulacji autofagii poprzez szlak HIF-1α/BNIP3, pozostają niejasne. Dlatego badamy mechanizm terapeutycznych efektów HSYA w KOA, koncentrując się na jego wpływie na autofagię chondrocytów oraz interakcji z szlakiem HIF-1α/BNIP3. Hipotezujemy, że HSYA łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez wzmacnianie autofagii i proliferacji chondrocytów, jednocześnie hamując apoptozę i stan zapalny poprzez hamowanie szlaków HIF-1α/BNIP3.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Centralnego Szpitala Ludowego w Zhanjiang (Z. Zatwierdzenia nr KY-YS-2021-09). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pacjenci i projekt badań

Zrekrutowano trzydziestu pacjentów z diagnozą zwyrodnieniowego stawów kolana (KOA) i poddawanych całkowitej artroplastyce kolana. W grupie było 14 mężczyzn i 16 kobiet w wieku 52-75 lat (średnia ± SD: 64,3 ± 12,6 lat), wszyscy spełniający kryteria KOA American College of Rheumatology¹². Pacjenci byli wykluczeni, jeśli otrzymali niesteroidowe leki przeciwzapalne lub sterydy w ciągu 2 tygodni przed operacją lub w ciągu miesiąca iniekcji śródstawowych.

2. Pierwotna hodowla chondrocytów

Chrząstka stawowa była pobierana w warunkach sterylnych bezpośrednio po operacji i umieszczana w zimnym PBS. Za pomocą sterylnych skalpeli chrząstkę pocięto na fragmenty o grubości ~1 mm³ na lodowato zimnej szklanej płycie i przenoszono do 50 mL rurki wirówki zawierającej 10 mL 0,25% trypsyny-EDTA. Rurka była inkubowana w wodnej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C z częstotliwością 80 obr./min przez 30 minut, a następnie delikatnie odwracana co 5 minut, aby ułatwić trawienie. Supernatant był zasysany, a granulka tkankowa była myta raz PBS i wirowana w 200 × g przez 5 minut. Następnie pellet był ponownie zawieszany w 10 mL kolagenazy typu II o stężeniu 0,02% i trawiony w 37 °C przez 4 godziny przy wstrząsaniu. Zawieszenie było podsuwane i opuszczane co 30 minut, aby wspomóc dysocjację, przechodziło przez sitko o średnicy 70 μm, a następnie ponownie wirowało w 200 × g przez 5 minut. Powstały pellet został ponownie zawieszony w DMEM uzupełnionym o 10% FBS, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny i zasiewany do koleb T25. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C z 5%_CO2, podłoże wymieniano co 2-3 dni, a komórki z przepustek 1-2 wykorzystywano do eksperymentów. Grupy eksperymentalne obejmowały kontrolę w formie normalnej, model pusty, HSYA (100 μmol/L), inhibitor HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), rapamycynę (10 nmol/L), HSYA + YC-1 oraz HSYA + rapamycynę.

3. Stuknięcie HIF-lα, BNIP3 pośredniczone przez siRNA

Pierwotne chondrocyty były zasiewane na płytkach 6-dołków w dawce 2-5 ×^{10 5 komórek} /dołek i hodowane w temperaturze 37 °C, aż osiągnęły łączność 30%-50%. Dla każdej dołki rozcieńczono 5 μL siRNA 20 μM w 250 μL Opti-MEM, a 5 μL odczynnika transfekcyjnego opartego na lipidach rozcieńczono osobno w 250 μL Opti-MEM. Oba roztwory były delikatnie mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut, tworząc kompleksy. Pożywka hodowlana została zastąpiona 1,5 mL świeżego DMEM z 10% FBS, a kompleks siRNA-lipidowy (500 μL) został dodany kropelo wzdłuż ściany studni z delikatnym wirowaniem. Komórki inkubowano przez 6 godzin, podłoże zastąpiono kompletnym podłożem, a hodowla kontynuowano przez 48-72 godziny. Skuteczność skalibracji została zweryfikowana za pomocą qRT-PCR oraz Western blot przed dalszymi zabiegami.

4. ELISA

Pobrano supernatanty hodowli komórkowych, wirowano w dawce 200 × g przez 5 minut i rozcieńczono w 1:2 w buforze testowym, gdy było to konieczne. Zestawy ELISA dla IL-1β, TNF-α i IL-6 były stosowane zgodnie z protokołem producenta. Standardy, puste egzemplarze i próbki były testowane w trzech egzemplarzach. Po reakcji substratowej absorbancję zmierzono na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt w ciągu 15 minut.

5. Test MTT

Chondrocyty były zasiewane na płytkach 96-dołkowatych o objętości 5 000 komórek/dołek w 100 μL kompletnego nośnika i inkubowane przez 0 godzin, 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny. W każdym momencie czasowym bezpośrednio do każdego odwiertu dodawano 20 μL roztworu MTT (5 mg/mL w PBS), a płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż na dnie otworów pojawiły się fioletowe kryształy formazonu. Supernatant był ostrożnie wsysany, nie naruszając kryształów, do każdego dołku dodawano 150 μL DMSO, a płytki umieszczano na wstrząsance przy 100 obr./min na 10 minut, aby całkowicie rozpuścić kryształy. Absorpcję zmierzono na poziomie 490 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Krótki czas inkubacji został wybrany, aby uniknąć nasycenia sygnałem w komórkach o wysokiej aktywności metabolicznej.

6. Cytometria przepływowa

Komórki były pobierane trypsynizacją, wirowane w stężeniu 200 × g przez 5 minut i dwukrotnie myte zimnym PBS. Zostały one ponownie zawieszone w 500 μL buforu wiążącego przy ~1 × 10^{6 komórek} /mL, a następnie dodano 5 μL Annexin V-FITC i 5 μL PI. Po delikatnym mieszaniu komórki były inkubowane przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Próbki zostały przeanalizowane na cytometrze przepływowym, z co najmniej 10 000 zdarzeń zebranych na próbkę (wzbudzenie 488 nm, emisja FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Komórki apoptotyczne były ilościowe za pomocą standardowego oprogramowania.

7. Western blotting

Komórki były dwukrotnie płukane zimnym PBS i lizowane w buforze 200 μL RIPA zawierającym inhibitory proteazy na lodzie przez 30 minut. Komórki były skrobane plastikowym skrobakiem, podsuwane i opuszczane pipetą w celu zmniejszenia lepkości oraz wirowane w dawce 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbierano supernatanty, a stężenia białek mierzono za pomocą testu BCA. Równe ilości białka (30 μg) były mieszane z buforem obciążającym 5×, podgrzewane w 95 °C przez 5 minut i rozdzielane na żelach SDS-PAGE o stężeniu 10%-12%. Elektroforeza była wykonywana przy napięciu 80 V przy układaniu i 120 V przy separacji, a białka były przenoszone na membrany PVDF przy napięciu 300 mA przez 90 minut. Błony były blokowane w mleku o stężeniu 5% bez tłuszczu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z użyciem przeciwciał podstawowych (1:1 000). Po trzech płukaniach TBST błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (1:5 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą substratu ECL i obrazowane za pomocą systemu detekcji chemiluminescencji przy ekspozycji 30-120 sekund. Intensywności pasmowe były kwantyfikowane za pomocą ImageJ, a GAPDH używano jako kontroli obciążenia.

8. Barwienie monodansylkadaweryną (MDC)

Bezpośrednio przed użyciem przygotowywano roztwór roboczy MDC o pojemności 50 μM, z roztworu zapasowego. Komórki były utrwalane 1 mL 4% paradehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, dwukrotnie myto PBS i inkubowano w roztworze roboczego MDC o stężeniu 500 μL przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Po dwóch płukaniach PBS, pokrywki zostały zamontowane z medium antyfade i obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie 355 nm, emisja 512 nm).

9. Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Komórki były pobierane i granulowane przez wirowanie w stężeniu 200 × g przez 5 minut, a następnie utrwalano w 2% glutaraldehydu w temperaturze 4 °C na noc. Próbki były myte trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy, a następnie utrwalane w 1% czterotlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w okapie spalającego. Odwodnienie przeprowadzano poprzez stopniową serię acetonów obejmującą 30%, 50%, 70%, 90% i 100% przez 10 minut każda. Próbki były infiltrowane żywicą acetonową/epoksydową 1:1 przez godzinę, a następnie przez noc czystą żywicą. Osadzenie przeprowadzono w świeżej żywicy i polimeryzowano w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Ultracienkie przekroje o średnicy 50-70 nm były cięte ultramikrotomem, montowane na miedzianych kratkach o średnicy 200 siatek, barwione 2% octanem uranilu przez 30 minut, następnie cytrynianem ołowiu przez 15 minut, myte wodą destylowaną, suszone na powietrzu i badane pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV. Dla bezpieczeństwa, glutaraldehyd i czterotlenek osmu są toksyczne i lotne i należy je obchodzić wyłącznie w okapie oparowym, rękawiczkach i okularach ochronnych. Odpady powinny być utylizowane w wyznaczonych pojemnikach niebezpiecznych zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.

10. Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Dane wyrażane są jako średnia ± SD. Istotność statystyczna oceniono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu LSD post hoc, przy czym P < 0,05 uznano za istotne.

Wyniki

Wpływ HSYA na ekspresję prozapalnych cytokin chondrocytów (IL-1β, TNF-α, IL-6)
W porównaniu z grupą kontrolną w normie, wszystkie pozostałe grupy wykazały istotnie podwyższone poziomy cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α i IL-6) (P < 0,05, Tabela 1, rysunek 1A-G). Leczenie HSYA, inhibitorem HIF-1α, induktorem autofagii, inhibitorem HSYA + HIF-1α lub induktorem HSYA + autofagii istotnie obniżyło poziom cytokin w porównani...

Dyskusja

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), powszechna choroba przewlekła, znacząco pogarsza jakość życia pacjentów. Spośród różnych podtypów OA, KOA jest najczęstszy, przyczyniając się do globalnego obciążenia chorobami. Pomimo wysokiej częstości występowania, dokładna etiologia i podstawowe mechanizmy patofizjologiczne KOA pozostają nieuchwytne. Złożona interakcja między procesami mechanicznymi i biochemicznymi w chrząstce stawowej, szczególnie regulacja funkcji chondrocytów, jest kluczowa w patogenezie KOA. Warto zauważyć, że...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% czterotlenku osmu	Nauki o mikroskopii elektronowej	19150	Dalsze poprawki i barwienia próbek do analizy TEM
2% glutaraldehydu	Sigma-Aldrich	G5882	Fiksuje komórki do przygotowania próbek TEM
4% paradehydu	Servicebio	G1101	Utrwala komórki do barwienia MDC i przygotowania próbek TEM
AG1478	Selleck Corporation	S1005	20 mg/kg dożylnie, inhibitor kinazy receptora ErbB w modelu szczura
Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI	Biobagno	BS3030	Barwi komórki apoptotyczne do wykrywania cytometrii przepływowej
Induktor autofagii (RAPA)	Sigma Corporation	R0395	Rapamycyna, induktor autofagii, stosowana przy 10 nmol/L w eksperymentach z chondrocytami
Przeciwciało Beclin1	Santa Cruz Biotechnology	SC-48341	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka Beclin1 związanego z autofagią
Przeciwciało BNIP3	Santa Cruz Biotechnology	SC-517348	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy BNIP3
Inkubator dwutlenku węgla	Yiheng	BPN-150CW	do hodowli komórek
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Rozpuszcza kryształy formazonu w teście MTT
DMEM	Beyotime	C0001	Podłoże do hodowli komórkowych, uzupełnione 10% FBS do hodowli chondrocytów
Czytnik mikropłyt ELISA	Thermo Fisher Scientific	Multiskan FC	Mierzy wartości OD w testach ELISA i MTT
Reagent o zwiększonej chemiluminescencji (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32106	Wizualizuje pasma białek w Western Blot
Żywica epoksydowa (EPON812)	Nauki o mikroskopii elektronowej	14120	Osadza próbki do sekcjonowania TEM
FBS	Beyotime	C0205	Serum krówego płodu, dodane do DMEM dla odżywiania chondrocytów
Cytometr przepływowy	Beckman (wspomniany za apoptozę)	CytoFLEX S	Wykrywa tempo apoptozy chondrocytów oraz markery komórkowe
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX73	Obserwuje pęcherzyki autofagiczne barwione MDC
System obrazowania żelowego	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Uchwyca i ilościowo określa pasma białkowe z Western blot
HIF-1α Przeciwciało	Santa Cruz Biotechnology	SC-13515	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy HIF-1 i alfa;
HIF-1α inhibitor (YC-1)	Selleck Corporation	S1047	HIF-1α inhibitor szlaku, stosowany w 10 & mu; mol/L w eksperymentach komórkowych
Wysokoobrotowa chłodzona wirówka	Eppendorf	5430R	Używane do rozdzielania składników
Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP	Jackson ImmunoResearch	115-035-003	Wiąże pierwotne przeciwciała do wzmacniania sygnału w Western blot
IL-1β Zestaw ELISA	Biologia Shenggong	C5236	Quantifies IL-1β poziomy w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA
Zestaw IL-6 ELISA	Biologia Shenggong	C5237	Ilościowo określa poziomy IL-6 w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA
Przeciwciało LC3	Santa Cruz Biotechnology	SC-398822	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka LC3 związanego z autofagią
Lipofektamin 3000 odczynnik	Thermo Fisher Scientific	L3000001	Lipidowy odczynnik transfekcyjny do tansfekcji
Monodansylkadaweryna (MDC)	Sigma-Aldrich	D4008	0,05 mol/L, barwi pęcherzyki autofagiczne do mikroskopii fluorescencyjnej
MTT Reagent	Beyotime	C0009	0,5 mg/mL, stosowane w testie MTT do oceny proliferacji chondrocytów
NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	Określ stężenie RNA
Zestaw NRG1 ELISA	Abcam (Wielka Brytania)	ab213961	Mierzy stężenie NRG1 w tkankach serca za pomocą ELISA
Przeciwciało P62	Santa Cruz Biotechnology	SC-28359	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniego blotu białka P62 związanego z autofagią
Przeciwciało fosforylowane ErbB4 (p-ErbB4)	Powinowactwo	AF3445	Główne przeciwciało do wykrywania zachodniej plamy aktywowanego ErbB4
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	Odwrotna transkrypcja RNA w celu dostarczenia szablonów do eksperymentu qPCR
System PCR w czasie rzeczywistym ilościowy	Bio-Rad	CFX96	do detekcji RT-PCR
Rekombinowany ludzki NRG1 (rh-NRG1)	R& D Systems	396-HB	Iniekcja dożylna 5 mg/kg w celu aktywacji szlaku NRG1/ErbB4 w modelu szczura
Bufor RIPA	Meilunbio	MA0151	Bufor lizowy z inhibitorami proteazy/fosfatazy do ekstrakcji białek
Żółty A (HSYA)	Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd.	Must-160601	Składnik bioaktywny z Carthamus tinctorius L., stosowany w wieku 100 i mu; mol/l w leczeniu chondrocytów
Sprzęt SDS-PAGE	Bio-Rad	Mini-PROTEAN Tetra	Rozdziela białka według masy cząsteczkowej w Western blot
TB Green Premix Ex Taq II	Takara	RR820A	dla eksperymentu qPCR
TNF-α Zestaw ELISA	Biologia Shenggong	C5238	Ilościowo określa TNF i alfa; poziomy w supernatantach komórkowych za pomocą ELISA
Całkowite przeciwciało ErbB4	Proteintech	19943-1-AP	Główne przeciwciało do wykrywania całkowitego ErbB4 przez Western blot
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)	Hitachi (wspomniane dla pęcherzyków autofagicznych)	H-7650	Obserwuje pęcherzyki autofagiczne w mitochondriach na poziomie ultrastrukturalnym
Odczynnik Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026	do ekstrakcji RNA
Trypsin-EDTA	Gibco (Thermo Fisher)	25200056	Wykorzystywany do enzymatycznego trawienia chrząstki stawowej w celu izolowania chondrocytów
Kolagenaza typu II (0,02%)	Worthington Biochemical	CLS-2	Trawi tkankę chrząstki w celu izolacji chondrocytów
β-przeciwciało katenowe	Santa Cruz Biotechnology	SC-7963	Wewnętrzne przeciwciało referencyjne do normalizacji Western blot