1. Materiały eksperymentalne
Liście C. oleifera 'Dabieshan 1' zbierano na trzech kluczowych etapach rozwoju: stadium młodociane, około 2. roku życia; Osoba przechodzi w wczesną fazę owocowania około 6 lat, a szczyt osiąga około 10 lat. Wszystkie rośliny C. oleifera na powyższych trzech etapach rozwojowych zostały posadzone przy użyciu sadzonek hodowanych w pojemnikach o tej samej specyfikacji co C. oleifera 'Dabieshan 1'. Właściwości fizyczne i chemiczne gleby na terenach leśnych C. oleifera przedstawiono w Tabeli 1.
2. Przegląd miejsca kolekcji
Materiały eksperymentalne zebrano w mieście Heping, położonym w sercu prowincji Anhui. Powiat Shucheng leży w centralnym regionie prowincji, należąc do peryferyjnego obszaru Gór Dabie. Współrzędne to 31°11′N, 116°47′E, ze średnią wysokością nad poziomem 90 m. Gleba klasyfikowana jest jako żółto-brązowa. Region charakteryzuje się wilgotnym subtropikalnym klimatem monsunowym, utrzymującym średnią roczną temperaturę 15,6 °C i zazwyczaj około 1 100 mm opadów rocznie, cieszy się około 1 969 godzinami słońca rocznie oraz okresem wolnym od przymrozków trwającym 224 dni.
3. Pobieranie próbek i wstępne przetwarzanie
Próbki zostały wybrane w okresie przedkwitnienia (koniec września). Na każdy etap rozwoju wybrano rośliny C. oleifera o podobnym, spójnym i silnym przyrostzie. Z każdej rośliny usuwano trzeci liść od góry do dołu, który umiarkowanie wyrastał wiosenne pędy ze wschodu, zachodu, południa i północy zewnętrznej części korony C. oleifera . Próbki oznaczono literami seryjnymi i numerami: YAT1, YAS2 i YAT3 dla liści C. oleifera w stadium młodocianym, badany przechodzi odpowiednio do wczesnej fazy owocowania oraz okresu szczytowego owocowania. Były one zbierane i przechowywane w ciekłym azocie. Z każdego etapu wybrano pięć losowych drzew próbek jako jedno biologiczne replikowanie, a trzy biologiczne replikacje zostały utworzone we wszystkich etapach. Wybrane okazy zostały tego samego dnia przywiezione do laboratorium i zachowane w temperaturze -80 °C.
4. Określanie indeksu fizjologicznego
Zawartość rozpuszczalnego cukru była określana metodą kolorymetryczną antronu21. Zawartość węgla organicznego została określona metodą utleniania dichromianu potasu – miarkowania siarczanem żelaza22. Zawartość rozpuszczalnego białka uzyskano metodą Coomassie brilliant blue23. Całkowite stężenie azotu zostało zmierzone metodą Kjeldahla22.
5. Przeprowadzono izolację kompletnego RNA, po czym zbudowano bibliotekę komplementarnego DNA (cDNA) i przeprowadzono sekwencjonowanie
Całkowite RNA było pozyskiwane z liści C. oleifera na różnych etapach za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA roślin. Całkowite stężenie RNA zostało określone za pomocą spektrofotometru widzialnego w pełnym spektrum światła ultrafioletowego. Integralność i klarowność RNA zostały określone przez analizator biologiczny. Po stworzeniu i weryfikacji biblioteki cDNA przeprowadzono sekwencjonowanie transkrypomiczne z wykorzystaniem platformy sekwencjonowania po sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Procedura sekwencjonowania dała pojedyncze odczyty, z których każdy obejmował 100 par zasad24, 25, 26. Wyniki wyrównania procesów sekwencyjnych zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu oprogramowania RSEM27. Geny różnicowej ekspresji (DEG) na różnych etapach rozwoju C. oleifera zostały zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do analizy różniczkowej DESeq28,29.
6. De novo assembly i adnotacje UniGene
Do filtrowania surowych danych używano SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) oraz Sickle (http://github.com/najoshi/sickle), w tym usuwając sekwencje niskiej jakości i skażone adaptery. Następnie czyste odczyty uzyskane z każdej próbki były składane za pomocą oprogramowania Trinity30,31. Wszystkie zebrane transkrypcje zostały poddane wyrównaniu BLASTX względem Swiss-Prot, klastrów grup ortologicznych dla kompletnych genomów eukariotycznych oraz baz danych KEGG w kolejności sekwencyjnej. Typowa wartość E (Cut-off E-value <10−5) była ustawiana do pobierania adnotacji funkcji. KEGG został zastosowany do analizy powiązanych szlaków metabolicznych32.
7. Funkcjonalna adnotacja genów i analiza genów różnicowo ekspresowanych
Statystycznie analizowano obfitość genów i izoform za pomocą oprogramowania RSEM27. Ustalono próg (P < 0,05, FDR < 0,01, |log2FC|>1) w celu identyfikacji genów różnicowo ekspresyjnych (DEGs). Oczekiwana liczba fragmentów na kb transkrypcji na milion zmapowanych fragmentów (FPKM) jest obecnie najczęściej stosowaną metodą szacowania poziomu ekspresji genów28. Obliczono wartości FPKM wszystkich genów z trzech różnych etapów wzrostu i rozwoju (YAT1, YAS2 i YAT3). Przeprowadzono hierarchiczną analizę klasteryzacji w celu zbadania różnic poziomów ekspresji genów. Tymczasem szlak KEGG został przygotowany do identyfikacji DEG istotnie wzbogaconych w szlaki metaboliczne przy P skorygowanym Bonferronim ≤ 0,05 w porównaniu do całego transkryptomu przy użyciu KOBAS29.
8. Metody analityczne
Dane zostały przedstawione w Excelu do obliczenia wartości średnich i odchyleń standardowych. Analiza wariancji (ANOVA) została wykorzystana do analizy statystycznej przez oprogramowanie SPSS, a test wielokrotnego zakresu Duncana został wykorzystany do oceny istotnych różnic w zawartości składników odżywczych między trzema etapami. Następnie istotne różnice między grupami zostały określone za pomocą wielokrotnych porównań post-hoc metodą Najmniej Istotnej Różnicy (LSD). Wykresy i wykresy były generowane za pomocą oprogramowania Origin do wizualizacji wyników eksperymentalnych i analitycznych. Nie oznaczono istotności statystycznej jako 'ns' (P > 0,05). Statystycznie istotne różnice oznaczano odpowiednio jako '*' (P < 0,05), '**' (P < 0,01), '***' (P < 0,001) i '****' (P < 0,0001).