Protokół ten ustanawia zintegrowany wieloomiczny pipeline (transkryptom i proteom) połączony z sieciowym badaniem farmakologicznym, aby zidentyfikować czynniki molekularne i cele terapeutyczne dla dysfunkcji śródbłonka w powikłaniach cukrzycowych.
Research Article
Protokół ten ustanawia zintegrowany wieloomiczny pipeline (transkryptom i proteom) połączony z sieciowym badaniem farmakologicznym, aby zidentyfikować czynniki molekularne i cele terapeutyczne dla dysfunkcji śródbłonka w powikłaniach cukrzycowych.
Dysfunkcja śródbłonka jest kluczowym czynnikiem choroby cukrzycowej nerek (DKD), jednak jej ogólnoustrojowe mechanizmy molekularne pozostają niedo końca odszyfrowane. Wysunęliśmy hipotezę, że zintegrowana analiza multiomiki może mapować uszkodzenia śródbłonka wywołane przez hiperglikemię i identyfikować terapie wielokrotnego użytku. Zastosowano wielokrotnego użytku pipeline obliczeniowy do integracji profili transkryptomicznych/sekretomowych z komórek śródbłonka hiperglikemicznych i nerek cukrzycowych. Zidentyfikowano 534 powszechnie zwykłe geny/białka o podwyższonej częstotliwości. Wzbogacenie funkcjonalne wykazało aktywację remodelowania macierzy zewnątrzkomórkowej, komunikacji międzykomórkowej oraz szlaków zapalnych. Weryfikacja międzybazowa udoskonaliła 278 mediatorów o wysokiej pewności, a analiza sieci interakcji białko-białko wskazała dziesięć genów hub. Korzystając z farmakologii sieci, przeanalizowaliśmy zatwierdzoną bibliotekę leków, identyfikując kilka związków kandydatów (np. bruceantynę, idelalisib), które potencjalnie celują w tę sieć. Ponadto regulacja czynników transkrypcji oraz przykładowe symulacje dokowania molekularnego (np. idelalisib z CTCF/BRD4) dostarczyły mechanistycznych hipotez do eksperymentalnej walidacji. Podsumowując, badanie to ustanawia wielokrotnego użytku ramy multi-omiki, które określają mechanizmy patogenne śródbłonka w DKD oraz nominują kandydatów na leki do ponownego wykorzystania, oferując strategiczne podejście do odkryć mechanistycznych i terapeutycznych.
Cukrzyca jako globalne wyzwanie zdrowotne dotknęła 529 milionów osób na całym świecie w 2021 roku, a prognozy wskazują, że do 2050 roku dotknie 1,31 miliardaosób. Poza kontrolą glikemii, długoterminowe powikłania są głównym źródłem zachorowalności, śmiertelności i obniżonej jakości życia. Należą do nich powikłania mikronaczyniowe (np. cukrzycowa choroba nerek (DKD), retinopatia, neuropatia) oraz powikłania makronaczyniowe (np. przyspieszona miażdżyca). Co istotne, DKD dotyka 30%-40% pacjentów z cukrzycą, co jest główną przyczyną końcowego stadium choroby nerek (ESRD) na świecie2. Głębokie obciążenie tymi powikłaniami podkreśla pilną, niezaspokojoną potrzebę nowatorskich terapii ukierunkowanych na ich podstawowe mechanizmy.
Komórki śródbłonkowe (EC), tworzące wewnętrzną wyściółkę wszystkich naczyń krwionośnych, są kluczowymi strażnikami zdrowia naczyń. Dysfunkcja śródbłonka wywołana przez hiperglikemię jest głównym czynnikiem rozwoju naczyniów cukrzycowych i uszkodzenia narządów 3,4. Wysokie poziomy glukozy wywołują kaskadę nieadaptacyjnych odpowiedzi w EC, obejmującą zaburzenia biodostępności tlenku azotu (NO), zwiększoną wydzielinę endotelu-1 (ET-1), zwiększoną ekspresję cząsteczek adhezji (np. VCAM-1, ICAM-1), zwiększony stres oksydacyjny spowodowany nadmierną generacją reaktywnych form tlenu (ROS) (np. poprzez oksydazy NADPH) oraz utrzymujący się stan zapalny o niskim stopniu 3,4. Łącznie te zmiany powodują upośledzenie rozszerzenia naczyń, zwiększoną przepuszczalność naczyń, adhezję i infiltrację leukocytów, stany prozakrzepowe oraz ostatecznie przebudowę naczyń5. W mikronaczyniach nerkowych uszkodzenia śródbłonka kłębuszkowy zakłócają barierę filtracji, promują albuminurię i bezpośrednio przyczyniają się do nagromadzenia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), kłębuszkowości i włóknienia tubulointersticjalnego 5,6. Następna aktywacja rezydentnych komórek nerkowych, połączona z napływem komórek zapalnych, tworzy błędne koło wzmacniające uszkodzenie nerek 5,7. Co istotne, badania kliniczne wykazują, iż markery ogólnoustrojowej dysfunkcji śródbłonka silnie korelują z początkiem i postępem albuminurii oraz spadkiem szybkości filtracji kłębuszkowej (GFR) u pacjentówz cukrzycą 6,7,8, podkreślając bezpośrednie znaczenie tego zjawiska dla wyników chorób u ludzi. Pomimo uznanej centralnej roli, kompleksowe, systemowe zrozumienie precyzyjnego przeprogramowania transkrypcyjnego i wydzielniczego wywołanego przewlekłą hiperglikemią w EK – zwłaszcza zmian napędzających remodelację ECM, kluczowego dla włóknienia nerek – pozostaje niedokładnie scharakteryzowane, ograniczając identyfikację nowych, mechanistycznych celów terapeutycznych dla DKD i innych powikłań naczyń cukrzycowych 7,8.
Głęboka złożoność molekularna leżąca u podstaw dysfunkcji śródbłonka w cukrzycy stanowi poważne wyzwanie dla tradycyjnych podejść terapeutycznych opartych na pojedynczym celu. Właśnie tutaj biologia obliczeniowa i bioinformatyka stają się niezbędnymi narzędziami, umożliwiającymi integrację i eksplorację różnorodnych, wysokowymiarowych zbiorów danych omicznych w celu priorytetyzacji przyczynowych węzłów w sieciach patologicznych oraz identyfikacji wielocelowych strategii terapeutycznych9. Co istotne, konwencjonalne podejścia jednomodalne (np. badanie przesiewowe tylko transkryptom/proteom lub farmakologiczne) często pomijają kluczową interakcję między warstwami molekularnymi (np. ekspresja genów, dynamika białek, odpowiedź na leki), nie uchwycając czynników synergicznych lub efektów pozacelowych10,11. Zintegrowany pipeline multi-omics przezwycięża te ograniczenia, równocześnie profilując dane transkryptomiczne, sekemologiczne i farmakologiczne w obrębie tego samego systemu, co daje holistyczne spojrzenie na mechanizmy choroby. Farmakologia sieci, algorytmy predykcji ligand/cel oraz molekularne dokowanie in silico umożliwiają systematyczną eksplorację zatwierdzonych bibliotek leków, przyspieszając przemianowywanie lub odkrywanie związków zdolnych przeciwdziałać złożonym sygnaturom chorób3. Ta zmiana paradygmatu daje szczególny potencjał w identyfikacji terapii skierowanych na dysregulację śródbłonka i jej niszczycielskie skutki mikronaczyniowe, takie jak DKD, oferując potencjał poprawy skuteczności i zmniejszenia profili skutków ubocznych. Integracja analiz transkryptomicznych/sektemicznych komórek śródbłonka narażonych na hiperglikemię zidentyfikowała 534 często podwyższone cząsteczki. Funkcjonalne wzbogacenie wskazywało na przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, stres oksydacyjny oraz stan zapalny we wczesnej patogenezie DKD. Analiza baz danych priorytetowo traktowała 278 celów o wysokiej pewności, udoskonalonych za pomocą sieci PPI genów hubów. Przesiewowe badania farmakologiczne sieci zatwierdzonych leków przewidywały obecność 85 związków kandydatów (w tym brefeldin-A, bruceantin, paracetamol i idelalisib) skierowanych do tych hubów. In silico przewidywanie i dokowanie czynników transkrypcyjne badały mechanizmy in silico. Prace te określają napędy śródbłonkowe DKD, ustanawiają proces odkryć obliczeniowych oraz dostarczają terapeutycznych kandydatów do walidacji. Ostatecznie ten program ma promować programy odkrywania terapeutycznego w przypadku powikłań cukrzycowych.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono za zgodą Komitetu ds. Badań Zwierząt i Etyki Instytutu Badań Medycznych Hebei Yiling (numer zatwierdzenia: N2024082). Sprawdź Tabelę Materiałów pod względem materiałów eksperymentalnych i instrumentów używanych w tym badaniu. Personel musi ściśle nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE) podczas obsługi niebezpiecznych odczynników, takich jak TRIzol (drażniący skórę/oczy, zawiera fenol) oraz inhibitory proteaz (potencjalne środki oddechowe/skórne). Segregować odpady biologiczne/ciekłe w workach autoklawowych, a niebezpieczne chemikalia w wyznaczonych pojemnikach do instytucjonalnej utylizacji niebezpiecznych. Dekontaminuj materiały eksploatacyjne przed utylizacją.
Modelowanie myszy z cukrzycową nefropatią
Samce myszy db/db i db/m (12 tygodni) były utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w temperaturach 22 ± 2 °C i wilgotności 56% ± 5%, z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności oraz dostępem do jedzenia/wody ad libitum . Po tygodniowym okresie aklimatyzacji myszy zostały losowo przypisane do grup liczbowych i przydzielone do grup eksperymentalnych. Myszy o wartości db/db były karmione dietą wysokobiałkową przez 6 tygodni, aby ustalić DKD. Skuteczne modelowanie potwierdzono przez istotnie podwyższony stosunek albuminy do kreatyniny w moczu moczu (UACR) w porównaniu z grupami kontrolnymi, przy czym UACR >30 mg/g stanowił główny funkcjonalny biomarker dla wczesnego DKD12.
Modelowanie komórek śródbłonka o wysokiej glukozie
Ludzkie komórki kłębuszkowe nerki (HRGEC) były przygotowywane w warunkach standaryzowanych. HRGEC hodowano w medium o prawidłowej glukozie (NG, 5,5 mM D-glukozy) lub wysokiej glukozy (HG, 30 mM D-glukozy) i przechowywano w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2. Komórki były albo wystawiane na działanie HG bez przerwy, albo hodowane w warunkach kontrolnych przez 24 godziny przed dalszymi analizami. Należy uwzględnić kontrolę osmotyczną (HM, zawierającą 5,5 mM D-glukozy z 24,5 mM mannitolu). Wszystkie schorzenia powinny spełniać rygorystyczne kryteria sprawności komórek: żywotność pozostała ≥85%, poziom apoptozy poniżej 15%, wzrost ROS w HG w porównaniu do HM nie przekroczył 20%, a uwalnianie LDH pozostało poniżej 10%, co potwierdza integralność komórkową przed analizami końcowymi.
Kolekcja mediów warunkowanych
Ośrodki warunkowane (CM) zostały zebrane za pomocą standaryzowanego protokołu analizy sekretomu13 z modyfikacjami. Po 24 godzinach stymulacji wysokiego poziomu glukozy (30 mM D-glukozy), prawidłowej glukozy (5,5 mM D-glukozy) lub kontroli osmotycznej (5,5 mM D-glukozy + 24,5 mM mannitolu), HRGEC były myte sterylną solą fodyjną z buforem fosforanowym (PBS) w celu usunięcia pozostałych białek surowicowych. Komórki były uzupełniane bezsurowicowym, bezfenolowym śródbłonkowym śródbłonkiem bazalnym i inkubowane przez 12 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂, aby gromadzić wydzielane czynniki.
CM pozyskiwano przy użyciu wstępnie schłodzonych rurek wirówkowych. Sekwencyjnie przetwarzano próbki zgodnie z opisaniem poniżej.
Główne wyjaśnienie: CM był przenoszony do stożkowych rurek wolnych od RNazy/DNazy i wirowany w dawce 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zrzucone odłamki zostały wyrzucone.
Hamowanie proteazy: W ciągu 2 minut od pierwotnego klarowania dodano koktajl inhibitorów proteazy wolnej od EDTA do 1x końcowego stężenia (1:50) zawierającego 1x inhibitory fosfatazy.
Koncentracja: Supernatant był natychmiast ładowany do wstępnie płukanych filtrów odśrodkowych PBS (3 kDa MWCO) i wirowany w temperaturze 4 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać stężenie 10x.
Dodatkowe wyjaśnienie: Koncentrat był przelewany do wstępnie schłodzonych rurek mikrowirówek i wirowany w 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zbierano supernatant, unikając kruszyw peletowanych.
Przechowywanie: Alikwoty o objętości 50 μL wytwarzano w sterylnych kriovialach o niskiej zawartości białek. Fiolki zostały zamrożone błyskawicznie w ciekłym azocie w ciągu 30 minut od zakończenia zbiorów. Fiolki przechowywano w temperaturze -80 °C (bez cykli zamarzania i rozmrażania).
Partie CM przeszły badania endotoksyny (<0,25 EU/mL). Protokół inkubacji bezsurowicy nie wykazał indukcji stresu (potwierdzone przez immunobloty HSP70/CHOP). Wydajność białka CM znormalizowana do żywotnej liczby komórek/zawartości DNA w momencie zbioru. Zachowana rygor przetwarzania: technika sterylna przez cały czas; ≤30 minut okno zbiorów do zamrożenia; Równowaga temperatury wirnika potwierdzona.
Badanie CCK-8 komórek rurkowatych nerek poddanych zabiegom
Aby ocenić funkcjonalny wpływ sekrecionu śródbłonkowego na żywotność komórek rurkowkowych nerek, wykonano test CCK-8 na ludzkiej linii komórkowej HK-2 leczonej CM pochodzącym z ludzkich komórek kłębuszkowych nerek (HRGEC), zgodnie z ustalonymi protokołami. Komórki HK-2 zostały wyhodowane w pożywce DMEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła (FBS). Do testu komórki zostały zasiane na płytach 96-dołkowych o gęstości 5 x 10³ komórek na dołek. Surowicowe głodzenie komórek przeprowadzono przez 12 godzin w podłożu zawierającym 0,5% FBS tuż przed leczeniem CM.
CM zastosowano przy równej całkowitej masie znormalizowanej białka. Zamrożone alikwoty CM rozmrażano w 37 °C w suchej kąpieli (<5 min) i klarowano przez wirowanie w 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Komórki HK-2 (100 μL/well) były traktowane HG-CM, NG-CM lub HM-CM, normalizowane do dopasowanej zawartości białka/DNA. Przygotowano łącznie 3 replikacje biologiczne na każde schorzenie (po 3 repliki techniczne każda). Próbki inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 24 godziny. Żywotność komórek oceniano za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8. W tym celu do każdego dołku dodano 10 μL roztworu CCK-8 i inkubowano przez 1-4 godziny w temperaturze 37 °C. Absorpcję zmierzono na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Opłacalność obliczano jako:
Opłacalność (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100
Wykrywanie stresu oksydacyjnego
Poziomy malondialdehydu komórkowego (MDA) zostały zmierzone ilościowo, będące jednym z głównych produktów końcowych peroksydacji lipidów błonowych, za pomocą testu TBA. Lizaty komórkowe (1 x 107 komórek ) były klarowane przez wirowanie w stężeniu 10 000 x g przez 15 minut, a następnie 0,02 mL supernatant został alicytowany do probek wraz z 0,02 mL standardów MDA. Do aliquotu dodano 0,02 mL klarifikatu oraz 0,6 mL odczynnika kwasowego. Próbki/standardy były traktowane 0,2 mL środka chromogenicznego (do probówek kontrolnych: dodano 0,2 mL kwasu octowego o stężeniu 50%). Po zamknięcia, mieszaniu i inkubacji w temperaturze 100 °C przez 40 minut, próbki były chłodzone, a następnie wirowane w 9569 x g przez 10 minut. Supernatant był przenoszony na mikropłytki przy 250 μL do pomiaru OD₅₃₂.
Profilowanie transkryptomiczne
Całkowite RNA zostało wyizolowane za pomocą odczynnika TRIzol zgodnie z protokołem producenta. Ilość i czystość RNA oceniano odpowiednio spektrofotometrem i analizatorem fragmentów. Do budowy sekwencjonowania biblioteki używano wyłącznie wysokiej jakości próbek RNA o liczbie integralności RNA (RIN) > 7,0.
Poliadenylowane (poli(A)+) mRNA zostało wzbogacone przez dwie rundy selekcji magnetycznej opartej na oligo(dT) na podstawie kulek magnetycznych. Oczyszczone mRNA zostało rozfragmentowane do 200-300 nukleotydów przy użyciu zestawu fragmentacyjnego na bazie magnezu w temperaturze 94 °C przez 5-7 minut. Synteza cDNA w pierwszej nici przeprowadzono za pomocą transkryptazy odwrotnej, a następnie syntezę cDNA drugiej nici przy użyciu polimerazy DNA E. coli I i RNazy H w obecności dUTP (w celu umożliwienia specyficzności nici). Kolejne kroki obejmowały naprawę końców, ogoon A, ligację adaptera oraz wybór rozmiaru za pomocą kulek magnetycznych. Przed amplifikacją PCR druga nit inkorporowana do dUTP była trawiona enzymem UDG.
Skonstruowano bibliotekę specyficzną dla pasma o średnim rozmiarze wkładu 400 ± 50 bp przy użyciu PCR przy następujących warunkach: początkowa denaturacja w 98 °C przez 1 minutę; 14 cykli denaturacji w 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w 60 °C przez 30 s i przedłużenie w 72 °C przez 30 s; oraz ostateczne przedłużenie w temperaturze 72 °C na 5 minut. Sekwencjonowanie parowe 150 bp wykonywano na platformie Illumina, z głębokością sekwencjonowania ≥40 milionów odczytów na próbkę (Q30 > 85%).
Bioinformatyczna analiza danych transkryptomicznych
Kontrola jakości surowych odczytów została przeprowadzona za pomocą FastQC (v0.11.8), a dopasowanie do genomu referencyjnego GRCh38.p13 z HISAT2 (v2.2.1). Kwantyfikacja transkrypcji i składanie transkrypcji na próbkę zostały wykonane za pomocą StringTie (v2.1.6) z domyślnymi parametrami. Wszystkie złożone transkryptomy zostały połączone z pojedynczych próbek, aby odtworzyć kompleksowy transkryptom przy użyciu oprogramowania gffcompare (wersja 0.12.6; gffcompare jest samodzielnym narzędziem, nie jest częścią StringTie, a jego wersja jest dostosowana do wspólnego stabilnego wydania). Analizę różniczkową ekspresji przeprowadzono za pomocą DESeq2 (v1.38.3) z wykorzystaniem progów |log2 zmiany foldu (FC)| > 1 i wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) < 0,05. Efekty wsadowe były korygowane za pomocą pakietu variancePartition.
Analiza proteomiczna sekretomów
CM pobrano z HRGEC hodowanych w warunkach kontroli NG, HG lub HM, stosując wcześniej opisaną metodę13 z modyfikacjami do analizy sekretomów. Komórki były myte PBS po stymulacji i inkubowane w medium wolnym od surowicy przez 12 godzin. Zbierano i wirowano w 3 000 x g przez 10 minut (4 °C).
Równe ilości peptydu z każdej próbki były mieszane, a następnie rozcieńczane rozpuszczalnikiem A (5% ACN, pH 9,8) i wstrzykiwane do kolumny. Frakcjonowanie mieszaniny peptydów przeprowadzono przy użyciu kolumny 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 w systemie szybkiego separacji binarnego. Elucja gradientowa została przeprowadzona z przepływem 0,3 mL/min: 5% do 21% rozpuszczalnik B (97% ACN, pH 9,8) w ciągu 38 minut, 21,5% do 40% rozpuszczalnik B w ciągu 20 minut, 40% do 90% rozpuszczalnik B w 2 minuty, 90% rozpuszczalnik B przez 3 minuty oraz 5% rozpuszczalnik B wyrównany przez 10 minut. Szczyty elucii monitorowano na 214 nm, a ułamki zbierano co minutę. Frakcje łączono według chromatogramów szczytów elucii. Zebrano łącznie 10 frakcji, które następnie zostały liofilizowane.
Przygotowano fazy mobilne A (100% woda, 0,1% kwas mrówkowy) oraz B (80% acetonitrylu), a wysuszone próbki peptydów zostały odtworzone z kwasem mrówkowym o stężeniu 0,1% i odwirowane w dawce 20 000 x g przez 10 minut. Separacja odbywała się za pomocą systemu fazy ciekłej UHPLC. Próbki zostały podane na kolumnę ES906 HPLC (150 mm) o 8-minutowym gradientie 2,5 μL/min i rozdzielone z następującym efektywnym gradientem: 0-4 min, 4% ruchoma faza B liniowo zwiększająca do 25%; 4-6,9 min, mobilna faza B liniowo zwiększona z 25% do 35%; 6,9-7,3 min, mobilna faza B liniowo zwiększona z 35% do 99%; 7,3-8,0 min, utrzymując mobilną fazę B na poziomie 99%. Peptydy separowane w fazie ciekłej zostały przeniesione do spektrometru masowego w celu wychwytu trybu DIA. Główne parametry ustalono: znormalizowana energia kolizji 25%, domyślny stan ładunku 2, rozdzielczość 240 000, skanowanie co 0,6 s, zakres skanowania 380-980 m/z, spektrometria mas AGC 500%. Skany jonowe fragmentacyjne były rejestrowane z maksymalnym czasem skanowania 3 ms i wykorzystywały 300 okien 2-tych skanowania, w zakresie od 380 do 980 m/z.
DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, wersja 1.9.1) był używany do analizy danych DIA metodą wolną od bibliotek. Dane MS/MS były wyszukiwane na podstawie sekwencji białek, które pobrano z bazy Uniprot przy następujących ustawieniach: enzym: trypsyna/P; maksymalna liczba nietrafionych rozszczepień: 2; stała modyfikacja: karbamydometylo(C); zmienne modyfikacje: utlenianie (M) i acetyl (białkowy N-składnik); tolerancja masy prekursora: 20 ppm; Tolerancja masy fragmentów: 0,05Da. Wyniki były filtrowane metodą 1% FDR, a w analizie końcowej użyto tylko tych grup białkowych, które spełniły to kryterium filtracyjne.
Analiza funkcjonalnego wzbogacenia omiki (GO, KEGG i GSEA)
Analizy wzbogacenia funkcjonalnego przeprowadzono na filtrowanych zestawach genów różnicowo ekspresyjnych (transkryptomika) i białek (proteomika sekrobomu), podążając za ustalonymi pipeline'ami bioinformatycznymi. Identyfikatory były mapowane za pomocą Org.Hs.eg.db. Wzbogacenie GO (procesy biologiczne, funkcje molekularne, komponenty komórkowe) zostało przeprowadzone za pomocą ClusterProfiler. Benjamini-Hochberg skorygował wartość p < 0,05, a redukcja podobieństwa semantycznego (cutoff=0,7) została zastosowana do wyrazów kondensowanych. Analiza szlaku KEGG została przeprowadzona za pomocą KEGG REST API (HAS, wydanie 2023). Zastosowano testy hipergeometryczne z korekcją Yekutieli FDR. Wizualizacja topologii ścieżek została wykonana za pomocą Pathview. GSEA zastosowano przy użyciu podejścia opartego na rangach z klasyfikacją genów sygnał-szum. Przeprowadzono wzbogacenie testów na zbiorach MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) oraz wyselekcjonowanych sygnaturach śródbłonka cukrzycowego. Istotność oceniono po 1000 permutacjach fenotypowych (FDR < 25%).
Analiza sieci interakcji białko-białko
Aby zidentyfikować kluczowe regulatory molekularne w puli kandydatów patogennych, przeprowadzono konstrukcję sieci PPI oraz analizę topologiczną przy użyciu zintegrowanego przepływu pracy obliczeniowej. 278 genów kandydatów zostało przesłanych do bazy danych STRING (wersja 12.0; Homo sapiens; źródła dowodów obejmowały bazy danych eksperymentalnych, współekspresji i kuratorów; próg ufności interakcji (łączny wynik) >0,7 dla krawędzi o wysokiej pewności; oraz brak dodatkowej inflacji interaktora. Wyniki zostały zaimportowane do Cytoscape (v3.9.1), a analiza topologii sieci wykonana była za pomocą wtyczek MCODE (v1.5.2) i CytoHubba (v0.4.1). Następnie sieć została wizualnie zoptymalizowana pod względem stopnia połączenia węzłów, tak że węzły o wysokiej łączności są ciemniejsze w kolorze, większe i bardziej widoczne pod względem etykiet.
Opracowanie docelowego zestawu genów dla choroby cukrzycowych nerek
Kryteria dla ko-upregulowanych mRNA/białek zostały zdefiniowane następująco: transkryptom (FDR < 0,05 i |log2FC| > 1) oraz sekretom (FDR < 0,01 i |log2FC| > 1,5). Nazwy białek i genów zostały znormalizowane za pomocą UniProt i przekształcone w jednolity format (symbol genu). Zestaw genów docelowych dla choroby nerek cukrzycowych został skonstruowany poprzez integrację genów związanych z chorobą z wielu publicznych baz danych, w tym GeneCards (wersja 5.25, termin zapytania: Diabetic Nephropathies, data dostępu lipiec 2025), Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/, termin zapytania: Diabetic Nephropathies, data dostępu lipiec 2025) oraz Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, wersja 0.13.8, termin zapytania: Diabetic Nephropathies, data dostępu lipiec 2025) 13,14,15. Został on wyznaczony jako kompleksowy zestaw referencyjny dla cukrzycowych nerek. Zidentyfikowano przecięcie między współregulowanymi mRNA/białkami a tym zestawem genów do analiz dalszych.
Detekcja białka CCL2
Aby ilościowo określić CCL2, płytka z 96 dołkami została pokryta przeciwciałem wychwytującym (100 μL/dołek) i inkubowana w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia płyta została myta 2x z buforem i zablokowana rozcieńczalnikiem ELISA (200 μL/dołek) przez 1 godzinę w RT. Przygotowywano 7-punktową krzywą standardową przez dwukrotne rozcieńczenia seryjne standardu S1, następnie dodawano próbki (100 μL/dołek) i inkubowano przez 2 godziny przy 400 obr./min. Po 5-krotnym płukaniu dodano przeciwciało wykrywające (100 μL/dołek) i inkubowano przez 1 godzinę przy 400 obr./min, następnie dodano roztwór enzymatyczny (100 μL/dołek) i inkubowano przez 30 minut przy 400 obr./min. Próbki zostały opracowane z podłożem TMB (15-30 min, RT). Reakcja zatrzymała się na kwasie (100 μL/dołek), a absorpcja była odczytywana na poziomie 450 nm (referencyjne 620 nm opcjonalnie). Kluczowe kroki obejmują rygorystyczne mycie, inkubacje czasowe oraz standaryzowane rozcieńczenia, aby zapewnić powtarzalność.
Repozycjonowanie leków
Związki terapeutyczne przewidywano za pomocą następującej platformy: LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Platforma ta wykorzystuje metodę MODZ oraz analizę kierunków charakterystycznych do identyfikacji małych cząsteczek lub kombinacji związków zdolnych do odwrócenia lub naśladowania sygnatur ekspresji genów wejściowych16. Leki kandydujące zostały zidentyfikowane jako te, które odwracają dysregulację różnicowo ekspresowanych genów nerek przy użyciu tej platformy. Związki zostały ocenione na podstawie ich wyników odwrócenia w liniach komórkowych nerek według wybranych nerek w kolumnie tkankowej, a najwyżej oceniani kandydaci byli poddawani dokowaniu molekularnemu w celu oceny ich powinowactwa wiązań z kluczowymi celami białkowymi.
Przesiew czynnika transkrypcyjnego współregulacyjnego
Baza danych hTFtarget została zapytana pod kątem współregulacyjnego wiązania TFs z zestawem genów. Baza danych hTFtarget została przeanalizowana w celu identyfikacji relacji między ludzkim czynnikiem transkrypcyjnym (TF) a celami genowymi poprzez obliczeniową analizę dużych zbiorów danych ChIP-Seq obejmujących różne komórki, tkanki i warunki. Integracyjny pipeline łączył sygnały szczytowe ChIP-Seq z kontekstem epigenetycznym, aby precyzyjnie określić wiązanie TF w promotorach/wzmacniaczach, wyraźnie uwzględniając dynamikę regulacyjną przestrzenno-czasową. Jak wykazali Zhang i in., służył jako wielowymiarowa platforma umożliwiająca badanie celów TF lub regulatorów genów, wizualizację danych ChIP-Seq, badanie kooperacyjności TF oraz przewidywanie miejsc wiązania17.
Potok obliczeniowy i analiza dokowania małych cząsteczek-białek
AutoDock Vina 1.2.018 został użyty do analizy molekularnej dokowania interakcji wiązań między składnikami aktywnymi a czynnikami transkrypcyjnymi BRD4, CTCF, EP300 i SPI1. Struktury krystaliczne BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) oraz SPI1 (PDB ID: 8E3K) zostały uzyskane z Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Struktury małych cząsteczek w formacie SDF zostały pobrane z bazy danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21, przekonwertowane do formatu MOL2 za pomocą Open Babel 2.4.1 i zminimalizowane energią za pomocą PyRx 0.8. Wstępne przetwarzanie białek polegało na usuwaniu cząsteczek wody, dodawaniu atomów wodoru, obliczaniu ładunków Gasteigera i konwersji ich do formatu PDBQT (wymaganego w AutoDock Vina). Zastosowano półelastyczną strategię dokowania, definiującą pozycję i wymiary siatki dokowania na podstawie miejsc wiązania współkrystalizowanych ligandów w każdym białku. MA9-086 służy jako ligand o dodatniej kontroli dla BRD4, a XDM-CBP dla EP300. Dla CTCF i SPI1 (brak znanych dodatnich ligandów) potencjalne kieszenie wiązające zostały zidentyfikowane poprzez analizę strukturalną za pomocą platformy internetowej Proteins Plus (https://proteins.plus/). Parametry siatki dokowania ustawiono następująco (współrzędne i wymiary w Å wzdłuż osi x, y i z): środek BRD4 w (-11,907, -8,617, -3,973) z rozmiarem pudełka (18,387, 18,387, 18,387); CTCF w centrum (15,165, 4,854, 6,388) oraz rozmiarze pudełka (17,25, 20,25, 9,75); EP300 na środku (39,781, 5,326, 9,998) i rozmiarze pudełka (16,516, 16,516, 16,516); SPI1 w centrum (3,155, -3,853, 0,668) i rozmiarze pudełka (17,25, 25,5, 10,5). Podczas dokowania zakres energii ustawiono na 3, parametr wyczerpania na 8, a odstępy siatki na 0,375 Å. Stabilność wiązania oceniono na podstawie energii wiązania, gdzie niższe wartości wskazują na bardziej stabilne konformacje i wyższe prawdopodobieństwo interakcji, z progiem <-5 kcal/mol definiowanym jako silna aktywność wiązania22,23. Wreszcie, metody interakcji między związkami a receptorami zostały zidentyfikowane za pomocą PyMOL.
Analiza statystyczna
Dane prezentowane są jako średnia ± SEM. Testy statystyczne wybrano na podstawie normalności (Shapiro-Wilk) i wariancji jednorodności (test Levene'a). Do porównań między grupami stosowano niesparowane testy t (dwie grupy) lub jednokierunkowe ANOVA z testami post hoc na LSD (≥3 grupy). P < 0,05 został zdefiniowany jako próg istotności. Wykresy były generowane za pomocą GraphPad Prism 9.0.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Wykazanie patogennego wpływu hiperglikemicznego sekretomu śródbłonka na kanaliki nerkowe
Badanie to rozpoczęto od potwierdzenia patogennego wpływu hiperglikemicznego wydzielnika śródbłonka. Warunkowane medium z hiperglikemicznych komórek śródbłonka ludzkiego kłębusza (HG-CM) znacząco upośledziło żywotność komórek nabłonka kanału bliższego (HK-2) w porównaniu z grupami kontrolnymi.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Niniejsze badanie potwierdza dysfunkcję wydzielnika śródbłonkowego wywołaną przez hiperglikemię jako kluczowy czynnik powodujący uszkodzenia nerek cukrzycowych poprzez zintegrowane podejścia multiomiczne i obliczeniowe. Wykazanie, że cytotoksyczność wywołana seksamomatem wobec kanalików nerkowych pokrywa się ze systematyczną dysregulacją 534 czynników pochodzących z endotelia zbiegających się z remodelowaniem macierza, stresem oksydacyjnym oraz szlakami zapalnymi w patogenezie DKD. Identyfikacja 278 mediatorów o wysokim ...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32200644), Projekt Programu Nauki i Technologii w Hebei (246W2501D, 252W7716D) oraz Złotą Platformę Yanzhao (A20240022).
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Zestaw CCL2 ELISA | Thermo Fisher Scientific | #88-7399-88 | |
| Inhibitor CCR2 | Merck Millipore | #227016 | |
| Zestaw do analizy żywotności komórek | Siedem Biotechnologii | CCK-8, SC119-01 | |
| Sekwencer DNA | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| System wysokowydajnej chromatografii cieczowej | Thermo Fisher Scientific | UltiMate 3000 Binary RSLC | |
| Medium kulturowe HRGECs | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. | 1001 | |
| Ludzkie komórki śródbłonkowe nerek (HRGEC) | Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotechnology | PRI-H-00038 | |
| Ludzkie nabłonkowe komórki rurkowate Ludzkiej Nerki Kompletne Medium | Procell | CM-H193 | |
| Ludzkie komórki nabłonkowe nerk (HK2) | Procell | CP-H193 | |
| Samce myszy db/db i db/m (4 tygodnie) | Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd. | SCXK 20190004 | |
| Spektrometr mas | Thermo Fisher Scientific | Astral | |
| Czytnik absorpcji mikropłyt | Urządzenia molekularne | SpectraMax iD5 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA) | Roche | cOmplete, #5056489001 | |
| Reagent do ekstrakcji RNA | Thermo Fisher Scientific | TRIzol, #15596026 | |
| Analizator jakości RNA | Agilent Technologies | Analizator fragmentów 5300, M5311AA | |
| Instrument do ilościowania RNA | Thermo Fisher Scientific | Qubit 3.0, Q33216 | |
| Zestaw do wykrywania ROS | Thermo Fisher Scientific | #EEA019 | |
| Ultrafiltracyjne urządzenia odśrodkowe (3 kDa MWCO) | Merck Millipore | Amicon Ultra-4 |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission