Method Article

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje posttranslacyjne histonów (hPTM) są centralnymi regulatorami organizacji chromatyny i ekspresji genów. Ich zaburzenia regulacji są związane z rozwojem, rakiem i starzeniem się. Chociaż spektrometria mas jest metodą wyboru do badania hPTM, większość protokołów jest przeznaczona dla próbek masowych i nie jest w stanie rozwiązywać zmienności między komórkami. Rozszerzenie analizy PTM histonów do poziomu pojedynczych komórek jest więc niezbędne, ale technicznie wymagające, ponieważ histony są niską ilością, bogate w lizynę i silnie modyfikowane.

Tutaj opisujemy zautomatyzowany workflow proteomiki jednokomórkowej do analizy PTM histonów z wykorzystaniem nano-cieczy obsługiwającej cieczy. System umożliwia przetwarzanie pojedynczych komórek na skalę nanolitrową przy minimalnym obsłudze i wysokiej powtarzalności. Workflow obejmuje trawienie za pomocą proteazy ArgC Ultra, która rozszczepia reszty argininy i eliminuje konieczność wykonywania etapów derytacji blokujących lizynę, typowych dla proteomiki histonów. Aby umożliwić ilościowe porównanie między stanami, stosujemy strategię znakowania dwu-plexowego z bezwodkiem propionowym i jego deuterowanym odpowiednikiem, anhydrydem propionowym-d10. To połączenie automatycznego przygotowania próbki, izotopowego multipleksowania oraz trawienia ArgC Ultra skutkuje uprościonym i czułym protokołem analizy PTM histonów pojedynczych komórek.

Metoda pozwala badać heterogeniczność chromatyny oraz wpływ perturbacji epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby zademonstrować ten proces, wygenerowaliśmy sferoidy z komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2/C3A i potraktowaliśmy je mięczanianem sodu, inhibitorem deacetylazy histonowej indukującym hiperacetylację.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histony są białkowymi składnikami nukleosomów, powtarzalnymi jednostkami chromatyny. Ich ogony N-końcowe są bogate w reszty lizyny i argininy i są silnie regulowane przez modyfikacje posttranslacyjne (PTM), takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja. Te modyfikacje wpływają na dostępność DNA, a tym samym kontrolują procesy takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa. Zmienione wzorce histonowych PTM są silnie powiązane ze stanami chorobowymi, od nowotworów po neurodegenerację i starzeniesię 1,2. Z tego powodu analiza histonowych PTM stała się bardzo interesująca w badaniach epigenetycznych i proteomicznyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. i odczynniki

  1. Medium wzrostu komórek HepG2/C3A: Przygotuj zmodyfikowane medium Dulbecco Eagle's Medium (DMEM, 4,5g/L glukozy) zawierające 10% surowicy bydła płodowego (FBS), aminokwasy nieistotne (1% v/v), L-glutaminę (1% v/v) oraz penicylinę/streptomycynę (0,5% v/v). Podłoże do wzrostu przechowywane jest w temperaturze 4 °C.
  2. Mieszanka główna: Przygotuj ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecyl-β-D-maltozyd (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM w wodzie o jakości LC-MS.
  3. Roztwór HA: Przygotuj 1% (v/v) hydroksylaminy w wodzie klasy LC-MS.
  4. Roztwór płukany: Przygotuj 10 ml mieszaniny 50:50 acetonitrylu/wody z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zastosowanie naszego workflow proteomiki pojedynczej komórki histonowej w naszym systemie, przeanalizowaliśmy sferoidy komórek HepG2/C3A traktowanych 5 mM butyrianinem sodu przez 24 godziny. Po pozyskaniu LC-MS/MS surowe dane były przetwarzane za pomocą EpiProfile zarówno dla znakowania lekkiego (bezwodnik propionowy), jak i ciężkiego (bezwodnik propionowy-d10), uzyskując znormalizowane dane reprezentujące obfitość peptydów i znaków histonowych. Pakiet QuantQC R został następnie użyty do odwzorowania m.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość pomiaru modyfikacji histonów po translacji na poziomie pojedynczych komórek stanowi kluczowy krok w kierunku zrozumienia prawdziwej heterogeniczności regulacji chromatyny. Tradycyjne metody masowe dostarczyły bezcennych informacji na temat średniego rozkładu hPTM w tkankach, a jednocześnie maskują zmienność między komórkami, która jest coraz częściej uznawana za biologicznie istotną5. Podejścia proteomiczne jednokomórkowe pozwalają nam teraz rozwinąć tę ukrytą warstwę złożoności, ujawnia.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C. jest pracownikiem SCIENION US Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Bernice Morrow i dr Jidong Shanowi z Molecular Cytogenetics Core w Albert Einstein College of Medicine za utrzymanie instrumentu cellenONE.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mLBio-Rad2239480
1000 &mikro; Końcówki pipetu o średnicy LFisher Scientific14222703
200 & mikro; Końcówki pipetu o średnicy LFisher Scientific14222730
384-dołkowa płytka PCR Lo Bind Eppendorf30129547
Kolektor próżniowy z 96 dołkamiMilliporeMAVM0960R
Acetonitryl, klasa Optima LC-MS/MSFisher ScientificA955-1
Folie płytek PCR z klejuThermo FisherAB0626
Bezwodny acetonitrylFisher ScientificAA42311AKEtykiety, roztwór zapasowy do produkcji luzem
Arg-C Ultra, klasa spektrometrii masowejPromegaVA1831
Woda do hodowli komórkowychCorning25-055-CV
CellenVIALsSCIENION/Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
DMSO, bezwodnyThermo FisherD12345Etykiety roztwór zapasowy
DTTSigmaD0632-5G
Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) DulbeccoFisher ScientificMT17205CV
Serum bydlęce płodoweFisher ScientificMT35010CV
Kwas mrówkowyThermo28905
Kwas mrówkowy 98%– 100% dla LC-MS LiChropurSigma5330020050
Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
HEPES (Ultra Pure)Thermo Fisher11344041
Acetonitryl klasy HPLCFisher ScientificA955-4
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-4
Roztwór hydroksylaminy 50 wt. % w H2OSigma438227-50ML
L-glutaminaFisher ScientificMT25015CI
detergent n-Dodecyl-beta-maltozyd (DDM)Fisher ScientificBN2005
Aminokwasy nieistotneFisher ScientificMT25025CI
Spektrometr mas Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Paraformaldehyd 16% roztwór wodny EM klasyNauki o mikroskopii elektronowej15710-S
PDC-CM (powłoka typu 2)SCIENION/Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
Penicylina-StreptomycynaFisher ScientificMT3002CI
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 10x, pH 7,4, wolna od RNazyThermo FisherAM9625
Piruśliwy dimetylosulfoksyd (DMSO), klasa LC-MSThermo Fisher85190
Pistolet pipetowyEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
Bezwodnik propionowy ≥ 99%Sigma240311-50G
Bezwodnik propionowy-d10 ≥ 98% atomów D i ge; 99% (CP)Sigma615692-1G
Wirówka chłodzonaThermo75-217-420
Szkiełka SciCHIP H1 pokryte powłoką szklanąSCIENION/Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
Koncentrator próżniowy SpeedVac (płyty 96-odwiertowe)Thermo15308325Savant SPD1010
Sterylny kapturThermo1375
Sterylne pipety serologiczneFisher Scientific1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, do cytometrii przepływowejThermo FisherS34860
Enzym TrypLE Express (1X), bez fenolu czerwonegoThermo Fisher12604013
WirSigmaZ258415
Kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  3. Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell ProteomicsHistone ModificationsAutomated Sample PreparationMultiplex LabelingChromatin HeterogeneityMass SpectrometryArgC Ultra DigestionSpheroid AnalysisHigh Throughput WorkflowEpigenetic Perturbations

Related Articles