Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Abstract

Modyfikacje posttranslacyjne histonów (hPTM) są centralnymi regulatorami organizacji chromatyny i ekspresji genów. Ich zaburzenia regulacji są związane z rozwojem, rakiem i starzeniem się. Chociaż spektrometria mas jest metodą wyboru do badania hPTM, większość protokołów jest przeznaczona dla próbek masowych i nie jest w stanie rozwiązywać zmienności między komórkami. Rozszerzenie analizy PTM histonów do poziomu pojedynczych komórek jest więc niezbędne, ale technicznie wymagające, ponieważ histony są niską ilością, bogate w lizynę i silnie modyfikowane.

Tutaj opisujemy zautomatyzowany workflow proteomiki jednokomórkowej do analizy PTM histonów z wykorzystaniem nano-cieczy obsługiwającej cieczy. System umożliwia przetwarzanie pojedynczych komórek na skalę nanolitrową przy minimalnym obsłudze i wysokiej powtarzalności. Workflow obejmuje trawienie za pomocą proteazy ArgC Ultra, która rozszczepia reszty argininy i eliminuje konieczność wykonywania etapów derytacji blokujących lizynę, typowych dla proteomiki histonów. Aby umożliwić ilościowe porównanie między stanami, stosujemy strategię znakowania dwu-plexowego z bezwodkiem propionowym i jego deuterowanym odpowiednikiem, anhydrydem propionowym-d10. To połączenie automatycznego przygotowania próbki, izotopowego multipleksowania oraz trawienia ArgC Ultra skutkuje uprościonym i czułym protokołem analizy PTM histonów pojedynczych komórek.

Metoda pozwala badać heterogeniczność chromatyny oraz wpływ perturbacji epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby zademonstrować ten proces, wygenerowaliśmy sferoidy z komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2/C3A i potraktowaliśmy je mięczanianem sodu, inhibitorem deacetylazy histonowej indukującym hiperacetylację.

Introduction

Histony są białkowymi składnikami nukleosomów, powtarzalnymi jednostkami chromatyny. Ich ogony N-końcowe są bogate w reszty lizyny i argininy i są silnie regulowane przez modyfikacje posttranslacyjne (PTM), takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja. Te modyfikacje wpływają na dostępność DNA, a tym samym kontrolują procesy takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa. Zmienione wzorce histonowych PTM są silnie powiązane ze stanami chorobowymi, od nowotworów po neurodegenerację i starzenie^{się 1,2}. Z tego powodu analiza histonowych PTM stała się bardzo interesująca w badaniach epigenetycznych i proteomicznych. Spektrometria mas (MS) zapewnia analizę modyfikacji histonów specyficzną dla miejsca i ilościową, jednak histony stanowią unikalne wyzwania analityczne. Ich skład aminokwasowy, liczne miejsca modyfikacji oraz złożone wzorce kombinatoryczne sprawiają, że są trudniejsze do analizy niż typowe białka. Ustalone protokoły opierają się na chemicznej deriwatyzacji w celu blokowania reszt lizyny przed trawieniem wody, co poprawia odzyskiwanie peptydów i wydajność chromatograficzną³. Chociaż skuteczne w analizach masowych, te wieloetapowe protokoły derytacyjne mogą powodować straty problematyczne dla wejść pojedynczych komórek. Analiza pojedynczych komórek staje się coraz ważniejsza, ponieważ systemy biologiczne są z natury heterogeniczne. Histone objęty analizuje przeciętne sygnały w wielu komórkach i dlatego nie rejestruje tej zmienności. Subpopulacje komórek mogą różnić się stanem chromatyny, a te różnice mogą napędzać rozwój, przeprogramowanie komórek lub odpowiedzi na leki ^4,5.

Przedstawiamy tutaj zautomatyzowaną metodę przygotowania próbki do multipleksowanej analizy histonów pojedynczych komórek PTM (sc-hPTM2). Metoda ta opiera się na systemie CellenONE, który umożliwia precyzyjne podawanie pojedynczych komórek i odczynników na skalę nanolitrową w sposób zautomatyzowany. Metoda ta jest wariacją na temat metody nanoproteomicznej próbki (nPOP), która po raz pierwszy wprowadziła stosowanie preparatu kropli na szkiełku^{szklanym 6}. Platforma nPOP posiada zaawansowaną zautomatyzowaną proteomikę pojedynczych komórek, jednak jej standardowy protokół trawienia tryptycznego jest suboptymalny dla histonów ze względu na ich wysoką zawartość lizyny i rozległą gęstość modyfikacji. W tym miejscu dostosowaliśmy system CellenONE do włączenia złotego standardu derywacji histonów z bezwodkiem propionowym oraz wprowadziliśmy znakowanie izotopowe, umożliwiające dokładną i kompleksową ilościową ilościową identyfikację modyfikacji histonów po translacji z rozdzielczością pojedynczych komórek. Konkretnie upraszczamy protokół, stosując proteazę ArgC Ultra do trawienia białek. W przeciwieństwie do trypsyny, ArgC rozszczepia jedynie reszty argininy i nie wymaga blokowania lizyny. Eliminuje to potrzebę stosowania strategii derywacji dwuetapowej, usprawniając protokół. Ponadto metoda wykorzystuje dwu-pleksowy schemat znakowania izotopowego z użyciem bezwodnika propionowego i bezwodnika d10 propionowego, co pozwala na jednoczesną analizę dwóch komórek ^7,3. Po trawieniu i oznakowaniu próbki pojedynczych komórek są pozyskiwane i analizowane za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS)/MS, korzystając z pozyskiwania niezależnego od danych (DIA). W naszych rękach metoda ta wykazuje wzrost zarówno czułości, jak i powtarzalności w zakresie ilościowania PTM histonów w porównaniu do poprzedniej wersji tej metody⁸.

Aby zademonstrować tę metodę, sprofilowaliśmy dynamikę PTM histonów pojedynczych komórek histonowych w sferoidach pochodzących z komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2/C3A. Lecząc te sferoidy za pomocą miąslanu sodu, dobrze scharakteryzowanego inhibitora deacetylazy histonowej, który zwiększa acetylację histonów i stanowi punkt odniesienia do badania regulacji chromatyny ^9,10. Porównując kontrolne i masaczniane sferoidy z masacznianem sodu w rozdzielczości pojedynczej komórki, wykazujemy dowód zasady reprezentatywnych wyników, podkreślając potencjał szerszych zastosowań w biologii chromatyny i epigenetyce nowotworów. W odniesieniu do protokołu odwołujemy się do wcześniejszej publikacji opisującej wzrost i leczenie 3D sferoidów¹⁰, pozyskiwanie peptydów histonowych w spektrometrii masowej¹¹ oraz analizę danych z użyciem oprogramowania EpiProfile¹².

Protocol

1. i odczynniki

1. Medium wzrostu komórek HepG2/C3A: Przygotuj zmodyfikowane medium Dulbecco Eagle's Medium (DMEM, 4,5g/L glukozy) zawierające 10% surowicy bydła płodowego (FBS), aminokwasy nieistotne (1% v/v), L-glutaminę (1% v/v) oraz penicylinę/streptomycynę (0,5% v/v). Podłoże do wzrostu przechowywane jest w temperaturze 4 °C.
2. Mieszanka główna: Przygotuj ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecyl-β-D-maltozyd (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM w wodzie o jakości LC-MS.
3. Roztwór HA: Przygotuj 1% (v/v) hydroksylaminy w wodzie klasy LC-MS.
4. Roztwór płukany: Przygotuj 10 ml mieszaniny 50:50 acetonitrylu/wody zawierającej 0,1% (w/w) kwasu mrówkowego (wszystkie klasy LC-MS).
5. Faza mobilna A (MPA) - 0,1% kwasu mrówkowego: Dodaj 1 mL skoncentrowanego kwasu mrówkowego do 999 mL wody klasy HPLC i dobrze wymieszaj.
6. Faza mobilna B (MPB) - 80% acetonitrylu HPLC + 0,1% kwasu mrówkowego: Dodaj 800 mL acetonitrylu HPLC do 199 mL wody klasy HPLC. Następnie dodaj 1 ml skoncentrowanego kwasu mrówkowego do tego roztworu i wymieszaj.

2. Przygotowanie do sferoidów

1. Przygotowanie sferoidów można znaleźć w Stransky S i ^in.11.
2. Hodować komórki raka HepG2/C3A w obracającym się trójwymiarowym (3D) bioreaktorze przez 5-7 dni, aby sprzyjać jednolitemu formowaniu się sferoidów aż do osiągnięcia ~400-600 μm średnicy. Stosuj DMEM z dodatkiem 10% FBS, 1% aminokwasów nieistotnych, 1% L-glutaminy oraz 0,5% penicyliny/streptomycyny. Utrzymuj sferoidy na poziomie 37 °C i 5%_CO2 do czasu leczenia.
   UWAGA: Rysunek 1A przedstawia sprzęt używany do przygotowania sferoidów w artykule referencyjnym.

3. Hodowla komórek i leczenie

1. Włóż ~10 sferoidów do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 2 mL podłoża wzrostu.
2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze 5%_CO2 .
3. Traktuj sferoidy przez 24 godziny 5 mM maczusania sodu lub dodaj tę samą objętość wody do kontroli (Rysunek 1B).

4. Izolacja komórek i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

1. Po 24 godzinach leczenia inkubuj komórki z 1 mL trypLE w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
2. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aż sferoid się rozpadnie i uzyska się pojedyncze komórki.
3. Zbierz komórki do probówki 15 mL i przemyj, rozcieńczając do 10 mL lodowatym 1x PBS, wiruj w 500 g przez 5 minut w 4 °C i aspiruj supernatant.
4. Ponownie zawiesij komórki w 1 mL lodowatego 1x PBS i dodaj barwnik Sytox green dead cell z końcowym stężeniem 1 μM.
5. Inkubuj komórkę z sytox green przez 20 minut na lodzie w ciemnym środowisku.
6. Przemyj komorę 10 mL lodowatego 1x PBS, wiruj w 500 g przez 5 minut w 4 °C i aspiruj supernatant.
7. Ponownie zawiesić komórki w 1 mL lodowatego 1x PBS i dodać paraformaldehyd (PFA) o końcowym stężeniu 0,5%.
8. Inkubuj komórkę PFA przez 15 minut na lodzie.
   UWAGA: Chociaż Sytox green zazwyczaj nie jest kompatybilny z wiązaniem z powodu permeabilizacji błony, w przypadku komórek, które testowaliśmy, odsetek zielonych komórek Sytox pozostaje taki sam do 8 godzin po fiksacji, bez oznak wycieku białek histonowych.
9. Przemyj komorę 10 mL lodowatego 1x PBS, wiruj w 500 g przez 5 minut w 4 °C i aspiruj supernatant.
10. Rekonstytuuje komórki przy końcowym stężeniu 200-500 komórek/μL.
    UWAGA: Dla małych komórek, które nie mają tendencji do osadzania się, zaleca się stężenie 500 komórek/μL, natomiast dla dużych komórek, które mają tendencję do osadzania się, zalecane jest stężenie 200 komórek/μL. Jeśli zawiesina komórkowa jest podatna na agregację, przepuść ją przez sitko o średnicy 40 μm przed aspiracją, aby uniknąć zatykania się dyszy. Jeśli interesujące są komórki większe niż 40 μm, które prawdopodobnie są obecne w próbce, można zamiast tego użyć sita o średnicy 70 μm, aby usunąć bardzo duże agregaty.
11. Przechowuj komórki na lodzie, aż zostaną załadowane do instrumentu do sortowania.

5. Połączenie oprogramowania i inicjalizacja systemu

1. Włącz system cellenONE (rysunek 2A), uruchom komputer sterujący, uruchom oprogramowanie i otwórz przestrzeń roboczą użytkownika v2.0-nPOP2 ; wszystkie wymagane pliki polowe i szablony uruchomienia nPOP są tam wstępnie załadowane.
2. Upewnij się, że chłodnica urządzenia jest włączona, a następnie ustaw wartość punktu rosy zgodnie z temperaturą wewnętrzną aktualnie podawaną przez urządzenie.
3. Załóż do systemu dysze dozujące PDC-70, powłokę typu 2 (rysunek 2B) zamontowane w szczelinach 1 i 3, zgodnie z instrukcjami na ekranie.
4. Ustaw szerokość impulsu każdej dyszy i napięcie napędu na wartości określone na opakowaniu producenta.
   UWAGA: Użycie dwóch oddzielnych dysz zachowuje spójność wydawania: jedna dostarcza zawiesinę komórkową, druga odczynniki, dzięki czemu resztki przylegające do dyszy nie zaszkodzą kolejnym kropleniem. Wykorzystanie obu dysz podczas ostatniego etapu pobierania przyspiesza także odzysk próbki.
   1. (KRYTYCZNY KROK) Aby uzyskać maksymalną efektywność odbioru, przesunięcie z między dwoma dyszami powinno różnić się o <50 μm. Określ to, definiując optymalną pozycję styku dla każdej dyszy i porównując odczyty wysokości Z w zakładce Ustawienia dyszy.
5. Napełnij zbiornik nawilżacza wodą dejonizowaną do wskazanej linii napełniania.

6. Konfiguracja wstępna na obsłudze cieczy

1. Wybierz ilość szkiełek szkieletowych (rysunek 2C), które mają być przygotowane. Ten wybór bezpośrednio definiuje całkowitą liczbę komórek planowanych do analizy.
2. Dla schematu multipleksowania 2-plex (rysunek 3A) załaduj pojedynczy slajd z 320 komórkami.

7. Rozdawanie fosy z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) wokół krawędzi zamka

UWAGA: Rysunek 3B przedstawia etapy przygotowania próbek w cellenONE, zaczynając od fosy DMSO. Jako dodatkowa zapobiegawka parowaniu kropelek, DMSO jest wydawane wzdłuż krawędzi szkiełek.

1. W zakładce Główna wybierz przebieg do 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Przejdź do zakładki Target Setup , załaduj plik DMSO_Moat.fld z odpowiedniego folderu schematu i ustaw Nr pól na Y, odpowiadając liczbie planowanych slajdów.
3. Należy zabrać 150 μL DMSO klasy LC-MS do nowej rurki PCR i umieścić ją w pozycji 2 stacji CellenWASH z nasadką rurki skierowaną w stronę drzwi przyrządów.
4. Otwórz zakładkę Bieg i kliknij Start Run. System zasysa 10 μL DMSO i zatrzymuje się na potwierdzenie stabilności kropelki przez użytkownika. Wystrzel trzy testowe krople automatycznego zrzutu (rysunek 4A); jeśli wszystkie trzy są idealnie uformowane, kliknij Kontynuuj bieg.
5. Po wydawaniu dysze automatycznie się płukują, a urządzenie rejestruje obrazy ze wszystkich slajdów dla kontroli jakości. Przejrzyj obrazy, aby zweryfikować jednolitą kroplę DMSO na każdym slajdzie oraz sprawdzić, czy nie brakuje lub nie trafia do celu (rysunek 4B).

8. Wydawanie DMSO

1. W zakładce Main wybierz przebieg do 1_Dispense_DMSO.
2. Otwórz zakładkę Target Setup , zaimportuj plik pola DMSO.fld (Rysunek 4C) z odpowiedniego katalogu schematu i ustaw liczbę pól na Y, odpowiadając liczbie slajdów, które zamierzasz przetworzyć.
3. Należy zabrać 150 μL DMSO klasy LC-MS do nowej rurki PCR i umieścić ją w pozycji 2 stacji CellenWASH z nasadką rurki skierowaną w stronę drzwi przyrządów.
4. Otwórz zakładkę Bieg i kliknij Start Run. System zasysa 10 μL DMSO i zatrzymuje się na potwierdzenie stabilności kropelki przez użytkownika. Wystrzel trzy testowe krople autodrop; jeśli wszystkie trzy są idealnie uformowane, kliknij Kontynuuj bieg.
5. Podczas wykończenia dozowania oprogramowanie automatycznie przepłucza dysze i rejestruje obrazy na każdym slajdzie dla zapewnienia jakości. Przejrzyj obrazy, aby zweryfikować jednolitą kroplę DMSO na każdym slajdzie oraz sprawdzić, czy nie brakuje lub nie jest w miejscu docelowym.

9. Rozdawanie komórek

1. W zakładce Główna wybierz przebieg do 2_Dispense_Cells.
2. W zakładce Target Setup otwórz podfolder Cells Field Files w wybranym katalogu multipleksującego schematu.
3. Ponieważ eksperyment obejmuje dwa warunki, wybierz plik pola, który odpowiada próbce zaraz sortującej – albo CellType_A.fld, albo CellType_B.fld.
4. Po załadowaniu pliku ustaw Liczbę pól na Y, aby odpowiadała całkowitej liczbie slajdów dla tego przebiegu.
5. Odgazuj zawiesinę ogniwa od kroku 4.11 za pomocą pompy próżniowej przez 10 minut na lodzie.
6. Przelej 150 μL przygotowanej zawiesiny ogniwowej do czystej fiolki CellenVIAL, a następnie umieść fiolkę w szczelinie 1 karuzeli CellenWASH z nakrętką skierowaną w stronę drzwi instrumentu.
7. Przejdź do zakładki Ustawienia dyszy > Wykonaj zadanie i wykonaj Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 , aby zasysać próbkę z fiolki.
8. Pozostając w zakładce Ustawienia dyszy , uruchom przeglądarkę wydzielania komórek (rysunek 5A) i uruchom procedurę mapowania, aby zdefiniować strefę wyrzutu i bramki obiektów na podstawie rozmiaru i wydłużenia. Parametry izolacji pojedynczych komórek pokazane na Rysunku 5A odpowiadają dokładnym ustawieniom stosowanym do wydawania komórek HepG2/C3A dysocjowanych od sferoidów.
9. Następnie aktywuj tryb fluorescencji, wybierając T > F. Ustaw tryb wyboru na ujemny. Zwiększ zakres parametrów izolacji dla rozmiaru i intensywności z minimalnych do maksymalnych, aby upewnić się, że nie izolują się martwe komórki.
10. Sprawdź parametry mapowania, otwórz zakładkę Run i kliknij Start Run, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania. Po zakończeniu dozowania instrument automatycznie przepłucza dysze i wykonuje zdjęcia slajdów do przeglądu rozmieszczenia kropel i ich jednolitości.
    UWAGA: Podczas sortowania komórek wykonuje się obrazy każdej pojedynczej komórki izolowanej podczas trwania (Rysunek 5B).
11. Po zakończeniu sortowania komórek zamknij okno wydawania.
12. Resztki zawiesiny komórkowej trzymaj na lodzie do zakończenia sekcji 9; nadwyżkę można później wykorzystać do próbek masowych, budowy biblioteki empirycznej lub dodatkowych badań walidacyjnych.

10. Podawanie mieszanki master do trawienia

1. W zakładce Main wybierz przebieg do 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Otwórz zakładkę Target Setup , załaduj Digest.fld z odpowiedniego folderu multipleksującego schematu i ustaw Liczbę pól na Y , aby odpowiadała liczbie slajdów dla tego przebiegu.
3. Przygotuj świeżą mieszankę główną do fermentacji i odgazuj roztwór za pomocą pompy próżniowej przez 10 minut na lodzie (mieszanka główna (mieszanka główna ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM w wodzie klasy LC-MS).
4. Pipeta 20 μL głównego wymiesza do płytki z 384 dołkami i umieszcza ją wewnątrz systemu X1.
5. W zakładce Bieg kliknij Start Run i postępuj zgodnie z instrukcjami. Po zasysaniu odczynnika przez system potwierdź stabilność kropelki po zapytanie.
6. Po zakończeniu dozowania instrument automatycznie płucze dysze i fotografuje każdy slajd; Przejrzyj zdjęcia, aby upewnić się, że każda kropla otrzymała mieszankę trawienną w sposób równomierny.
7. Inkubuj preparaty przez noc do trawienia, utrzymując określone parametry wilgotności i punktu rosy. Każda kropla zawiera ~13,5 nL mieszanki trawiennej. Trawienie przeprowadzać przez noc przy wilgotności względnej ~75 %, utrzymując punkt rosy o 1-2 °C niższy od temperatury komory, aby zapobiec parowaniu kropel.

11. Inkubacja przez noc

1. W zakładce Główna wybierz trasę, aby 4_Incubation_16h.
2. Przełącz się na zakładkę Bieg, kliknij Start Bieg.
   UWAGA: Instrumenty będą robić zdjęcia preparatów co 30 minut, aby monitorować stan kropelek. Jeśli podczas inkubacji wyschną lub puchną, dostosuj ustawienie punktu rosy w razie potrzeby.
3. Po zakończeniu inkubacji pojawi się komunikat informujący, że inkubacja została zakończona.
   UWAGA: Szybkie trawienie (≤4 godziny) może być możliwe przy wyższych efektywnych warunkach przepływu enzymów do podłoża; Nie oceniono tego tutaj, więc potwierdzony warunek pozostaje 16 godzin.

12. Parowanie

UWAGA: Przed przejściem do etapu etykietowania zaleca się sprawdzenie stanu kropelek, aby upewnić się, że nie są zbyt spuchnięte wodą, ponieważ woda może zakłócać efektywność oznaczania. W tym celu zaleca się fazę parowania.

1. W zakładce Główna wybierz trasę do 5_Evaporation.
2. Przejdź do pliku, Kontrola jednostki chłodzącej i w oznaczeniu Kontrola punktu rosy ustaw Stałą temperaturę sterowania na 23 °C.
3. Przełącz się na zakładkę Bieg, kliknij Start Bieg. Suszenie trwa 5 minut, a instrumenty automatycznie robią zdjęcia slajdów po wyschnięciu.
4. Sprawdź zdjęcia; Jeśli krople są wystarczająco suche, zatrzymaj bieg. Jeśli nie, kliknij "kontynuuj " i susz przez kolejne 5 minut (rysunek 6A).
5. Na końcu biegu wróć do poprzedniego Punktu Kontroli Rosy.

13. Etykiety wydają

1. W zakładce Main wybierz trasę do 6_Dispense_PA_Labels.
2. Przejdź do zakładki Target Setup , załaduj plik Labels.fld z odpowiedniego folderu schematu i ustaw Nr pól na Y, odpowiadając liczbie planowanych slajdów.
3. Umieść 150 μL DMSO klasy LC-MS do szczeliny 2 stacji CellenWASH.
4. Przygotuj roztwór zapasowy dwóch zapasów znakujących do multipleksowanej derytacji histonów: 25% (v/v) bezwodnika propionowego w DMSO oraz 25% (v/v) bezwodnika propionowego-d₁₀ w DMSO.
   UWAGA: Odgazuj oba roztwory przed przelaniem ich na płytę, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków.
5. Dozuj 20 μL każdego odczynnika znakującego do wyznaczonych wgłębień płytki z 384 dołkami i umieść płytkę wewnątrz systemu X1. Każda kropla otrzymuje ~10 nL odczynnika znakującego (25% bezwodnika propionowego lub 25% bezwodnika propionowego-d₁₀ w DMSO).
6. Przełącz się na zakładkę Bieg, kliknij Start Run i postępuj zgodnie z instrukcjami.
7. Pozwól etykietom reagować na zjeżdżalnie przez 1 godzinę.
8. Po wydawaniu instrument automatycznie płucze dysze i fotografuje każdy slajd. Przejrzyj zdjęcia, aby potwierdzić równomierne rozmieszczenie i prawidłowe rozmieszczenie kropelek na wszystkich slajdach.

14. Wydanie HA

1. Przygotuj roztwór HA i odgazuj go przed użyciem.
2. Załaduj fiolkę. Pipeta 150 μL roztworu HA do czystej rurki PCR, umieszczona w szczelinie CellenWASH 2 i skierowana w stronę drzwi instrumentu.
3. Wybierz profil biegu. W zakładce Główna wybierz 7_Dispense_Quench.
4. Skonfiguruj plik pola. Otwórz zakładkę Target Setup , załaduj HA.fld z odpowiedniego folderu multipleksującego schematu i ustaw Liczbę pól na Y , aby odpowiadała całkowitej liczbie slajdów.
5. Zacznij bieg. Przejdź do Run, kliknij Start Run i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie.
6. Inkubuj. Pozwól HA reagować na slajdach przez 30 minut.
7. Sprawdź wydawanie lekcji. Po zakończeniu system przepłukuje dysze i wykonuje zdjęcia każdego slajdu – przeglądając je, aby potwierdzić równomierne rozmieszczenie i objętość kropel.

15. Pobieranie próbek

1. Przygotuj roztwór do mycia w WashTray XL.
2. Ustaw talerz do zbierania. Do każdej studni świeżej płyty z 384 dołkami należy podać 2 μL 0,01% (w/w) DDM w wodzie klasy LC-MS i umieścić ją wewnątrz obsługi płynów.
3. Wybierz trasę odbierającą. W zakładce Główna wybierz profil 8_Pickup_2plex.
4. Załaduj plik terenowy. Otwórz zakładkę Target Setup , zaimportuj Pick-up.fld z właściwego katalogu multipleksing-scheme i ustaw Liczbę pól na Y , aby odpowiadała liczbie slajdów.
5. Wykonaj bieg. Przełącz się na zakładkę Bieg, kliknij Start Run i postępuj zgodnie z instrukcjami. Instrument zbiera każdą kroplę, przepłukuje dysze i robi zdjęcia slajdów do przeglądu, aby potwierdzić, że każda próbka została pobrana.

16. Przetwarzanie po odbiorze

1. Uszczelnij płytę z 384 dołkami folią klejącą i krótko wiruj, aby krople doprowadzić na dno studni.
2. Usuń folię i wysusz próbki w niskim temperaturze w koncentratorze próżniowym.
3. Uszczelnij płytę papierem klejącym i przechowuj wyschniętą w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do analizy LC-MS/MS.

17. Przygotowanie próbek zbiorczych

1. Korzystając z pozostałej zawiesiany z sekcji 9, odkręć komórki i ponownie zawiesić w 1x PBS, aby uzyskać stężenie 2000 komórek/μL. Powinno to być wykonane po zakończeniu artykułu 10.
2. Liza termiczna: zamrażanie pozostałego zawieszenia w -80 °C przez 10 minut, a następnie szok termiczny w 90 °C przez 10 minut.
3. Pozwól rurce schłodzić się do temperatury pokojowej.
4. Przelej 25 μL lizatu do probówki PCR i dodaj 5 μL wcześniej przygotowanej mieszanki trawiennej.
5. Inkubuj przez noc (≈ 16 godzin) w temperaturze 37 °C w cyklerze termicznym.
6. Derivatyzacja z etykietą światła: dodaj 5 μL świeżej 25% (v/v) etykiety świetlnej w acetonitryle i inkubuj przez 1 godzinę.
7. Hartowanie reakcji: dodaj 5 μL roztworu hydroksylaminy (HA) o stężeniu 1% (w/w) i inkubuj przez 30 minut.
8. Susz próbkę w koncentratorze próżniowym ustawionym na niską temperaturę, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowe do LC-MS/MS.

18. Konfiguracja LC/MS i pozyskiwanie danych

UWAGA: Aby zebrać dane do tego manuskryptu, zainstalowano system LC-MS\MS z kolumną analityczną Ion Optics o średnicy 75 μm x 25 cm x 1,7 μm.

1. Przygotuj fazy mobilne do pracy na HPLC:
   Faza mobilna A (MPA): 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie o jakości HPLC
   Faza mobilna B (MPB): 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitryle klasy HPLC
2. Zaprogramuj metodę HPLC dla 30-minutowego aktywnego gradientu: 5-23% MPB w 25,7 min, 23-35% MPB w 2,6 min i 35-45% MPB w 1,7 min, przy przepływie 200 nL/min. Zaprogramuj autosampler tak, aby próbkę zawieszał w 0,1% FA + 0,01% DDM dla "suchego" odbioru.
3. Ustaw metodę akwizycji MS do przeprowadzania niezależnego pozyskiwania danych (DIA):
   UWAGA: Te ustawienia są specyficzne dla Thermo Exploris 480 wyposażonego w FAIMS Pro Duo i mogą się różnić w zależności od Twojego instrumentu. Zaleca się stosowanie tych typowych dla proteomiki jednokomórkowej DIA o podobnych zakresach m/z, jak opisano poniżej.
   1. Ustaw MS na pełne skanowanie od 300 do 1100 m/z z rozdzielczością 120 000, celem AGC na 300%, maksymalnym czasem wtrysku 246 ms oraz CV FAIMS na -50 V.
   2. Ustaw MS/MS jako skan DIA w zakresie 300-1100 m/z z rozdzielczością 60 000, oknem izolacji 50 m/z, energią kolizji HCD 27%, pierwszą masą 120 m/z, celem AGC 1000%, maksymalnym czasem wtrysku 118 ms oraz CV FAIMS -50 V.
4. Usuń uszczelkę foliową z płytki z 384 dołkami zawierającą pojedyncze komórki. Rekonfunduj próbkę objętą w 100 komórkach/μL w 0,1% FA + 0,01% DDM i przelej 10 μL do pustego dołku, takiego jak P24. Następnie uszczelnij płytkę gumową matą do przebijania i załaduj ją do automatycznego próbkowania.
5. Kolejkowe przebiegi: najpierw przeprowadź próbki masowe, a potem zestawy pojedynczych komórek.

19. Analiza danych

1. Przeprowadź surowe dane za pomocą EpiProfile2.1, aby uzyskać wyniki z obfitością peptydoform dla komórek znakowanych bezwodnikiem propionowym.
   UWAGA: Próbki muszą być pobierane na przyrządzie Thermo, aby móc używać EpiProfile 2.1 do przetwarzania danych. To oprogramowanie wyodrębnia około 250 peptydoform w wersji kanonicznej, ale jest edytowalne w zależności od organizmu, dodatkowych modyfikacji, mutacji ^itp.12.
2. Przeanalizuj surowe dane EpiProfile2.1_D5, aby uzyskać wyniki z obfitością peptydoform dla komórek znakowanych propionowym anhydrydem-d10.
3. Wykonaj mapowanie łączące metadane z wyjściami Epiprofile za pomocą programu quantQC.
4. Filtruj próbki nieudane, porównując je z pustymi wzorami.
5. Filtruj peptydoformy, które nie występują w co najmniej 50% próbek.
6. Filtruj peptydoformy, których sygnał intensywności pojedynczej komórki nie jest większy niż sygnał 150% w pustych komórkach.
7. Pobierz tabelę wyników (rysunek 7A) i przetwórz dane dalej w razie potrzeby.

Results

Aby zademonstrować zastosowanie naszego workflow proteomiki pojedynczej komórki histonowej w naszym systemie, przeanalizowaliśmy sferoidy komórek HepG2/C3A traktowanych 5 mM butyrianinem sodu przez 24 godziny. Po pozyskaniu LC-MS/MS surowe dane były przetwarzane za pomocą EpiProfile zarówno dla znakowania lekkiego (bezwodnik propionowy), jak i ciężkiego (bezwodnik propionowy-d10), uzyskując znormalizowane dane reprezentujące obfitość peptydów i znaków histonowych. Pakiet QuantQC R został następnie użyty do odwzorowania m...

Discussion

Możliwość pomiaru modyfikacji histonów po translacji na poziomie pojedynczych komórek stanowi kluczowy krok w kierunku zrozumienia prawdziwej heterogeniczności regulacji chromatyny. Tradycyjne metody masowe dostarczyły bezcennych informacji na temat średniego rozkładu hPTM w tkankach, a jednocześnie maskują zmienność między komórkami, która jest coraz częściej uznawana za biologicznie istotną⁵. Podejścia proteomiczne jednokomórkowe pozwalają nam teraz rozwinąć tę ukrytą warstwę złożoności, ujawnia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 &mikro; Końcówki pipetu o średnicy L	Fisher Scientific	14222703
200 & mikro; Końcówki pipetu o średnicy L	Fisher Scientific	14222730
384-dołkowa płytka PCR Lo Bind	Eppendorf	30129547
Kolektor próżniowy z 96 dołkami	Millipore	MAVM0960R
Acetonitryl, klasa Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Folie płytek PCR z kleju	Thermo Fisher	AB0626
Bezwodny acetonitryl	Fisher Scientific	AA42311AK	Etykiety, roztwór zapasowy do produkcji luzem
Arg-C Ultra, klasa spektrometrii masowej	Promega	VA1831
Woda do hodowli komórkowych	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	SCIENION	/	Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
DMSO, bezwodny	Thermo Fisher	D12345	Etykiety roztwór zapasowy
DTT	Sigma	D0632-5G
Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco	Fisher Scientific	MT17205CV
Serum bydlęce płodowe	Fisher Scientific	MT35010CV
Kwas mrówkowy	Thermo	28905
Kwas mrówkowy 98%– 100% dla LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher	11344041
Acetonitryl klasy HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Woda klasy HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Roztwór hydroksylaminy 50 wt. % w H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamina	Fisher Scientific	MT25015CI
detergent n-Dodecyl-beta-maltozyd (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Aminokwasy nieistotne	Fisher Scientific	MT25025CI
Spektrometr mas Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehyd 16% roztwór wodny EM klasy	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710-S
PDC-CM (powłoka typu 2)	SCIENION	/	Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
Penicylina-Streptomycyna	Fisher Scientific	MT3002CI
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 10x, pH 7,4, wolna od RNazy	Thermo Fisher	AM9625
Piruśliwy dimetylosulfoksyd (DMSO), klasa LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistolet pipetowy	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Bezwodnik propionowy ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Bezwodnik propionowy-d10 ≥ 98% atomów D i ge; 99% (CP)	Sigma	615692-1G
Wirówka chłodzona	Thermo	75-217-420
Szkiełka SciCHIP H1 pokryte powłoką szklaną	SCIENION	/	Numer katalogowy jest dołączony do wyceny
Koncentrator próżniowy SpeedVac (płyty 96-odwiertowe)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterylny kaptur	Thermo	1375
Sterylne pipety serologiczne	Fisher Scientific	1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, do cytometrii przepływowej	Thermo Fisher	S34860
Enzym TrypLE Express (1X), bez fenolu czerwonego	Thermo Fisher	12604013
Wir	Sigma	Z258415
Kąpiel wodna	Fisher Scientific	FSGPD10