Artykuł metodologiczny

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

DOI:

10.3791/69670

⸱

5 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wykorzystuje specyficzną dla adipocytów linię myszy raportującej CD63-GFP do wizualizacji i ilościowej wydzieliny pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów (EV) oraz wykazania ich przyjmowania przez komórki progenitorowe, ujawniając szlak parakrynowy w tkance tłuszczowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipocyty są coraz częściej uznawane za aktywne komórki endokrynne, które wydzielają znaczne ilości EV wzbogaconych o białka, lipidy i kwasy nukleinowe. Jednak mechanizmy rządzące wydzielaniem EV oraz dynamika uwalniania EV w różnych kontekstach biologicznych nie są w pełni poznane. Aby wypełnić tę lukę, wygenerowaliśmy nową, specyficzną dla adipocytów linię myszy raportujących CD63-GFP, w której ekspresja CD63 oznaczonego GFP jest sterowana przez promotor Adiponektyny, umożliwiając selektywne znakowanie i śledzenie AdEV in vivo. Korzystając z tego modelu reportera, badaliśmy wydzielanie AdEV oraz ich dostarczanie do APC w tkankach tłuszczowych. Obrazowanie konfokalne i cytometria przepływowa wykazały, że AdEV są aktywnie pobierane przez APC, co podkreśla wcześniej niedoceniany mechanizm komunikacji parakrynologicznej w mikrośrodowisku tłuszczowym.

Aby uzupełnić badania in vivo , utworzono system in vitro , umożliwiający bezpośrednie monitorowanie wydzielania EV z zróżnicowanych adipocytów. APC zostały wyizolowane z podskórnych białych tkanek tłuszczowych myszy zgłaszających i indukowane do różnicowania się do dojrzałych adipocytów. W tych komórkach sygnały CD63-GFP obserwowano jako odrębne punkty i wzbogacały się w błonie plazmatycznej, gdy wydzielanie EV było hamowane, co jest zgodne z nagromadzeniem pęcherzyków przy zablokowanym uwalnianiu. W normalnych warunkach wzrostu EV wydzielane do podłoża hodowlanego były koncentrowane i następnie oczyszczane za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów, co umożliwiło dalsze analizy funkcjonalne i biochemiczne.

Platformę tę można stosować do APC pochodzących z innych depow tłuszczowych, takich jak biała i brązowa tkanka tłuszczowa w najądrzu, lub poprzez różnicowanie ich na specyficzne dla depotu adipocyty, co umożliwia porównanie wydzielania EV między różnymi typami adipocytów.

Razem te podejścia wprowadzają solidne narzędzie genetyczne oraz komplementarny system in vitro do analizy dynamiki wydzielania i celowania AdEV. Te postępy rzucają światło na komunikację komórkową wewnątrztłuszczową i tworzą fundamenty do zrozumienia szerszego metabolicznego wpływu AdEV na zdrowie i chorobę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa jest coraz częściej uznawana za dynamiczny narząd hormonalny o kluczowej roli w homeostazie energetycznej całego ciała 1,2,3,4,5. Poza klasyczną funkcją magazynowania lipidów, adipocyty regulują ogólnoustrojową wrażliwość na insulinę, a zaburzenia masy tłuszczowej – czy to nadmiar, czy niedobór – są powiązane z insulinoopornością i chorobami metabolicznymi 6,7,8,9. Jednym z mechanizmów proponowanych do tej zdolności regulacyjnej jest komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem czynników wydzielanych. Chociaż adipokiny są dobrze ugruntowane jako kluczowe sygnały endokrynne z tkanki tłuszczowej 10,11,12,13,14,15,16,17,18, adipocyty uwalniają także znaczną liczbę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), czyli cząstek związanych z błoną zawierających lipidy, białka, kwasy nukleinowe i metabolity. Czy EV wydzielane przez adipocyty (AdEV) również przenoszą glikany, podobnie jak inne typy EV, pozostaje niejasne 19,20,21,22,23,24. Adipocyty zostały udowodnione jako główne źródło EV, ponieważ około 80% krążących mikroRNA egzosomalnych pochodzi z adipocytów w modelach myszy, co wykazano na przykładzie adipocytów specyficznych dla adipocytów myszy knockout Dicera przy warunkach wyjściowych25. Rola AdEV w metabolizmie, stanach zapalnych, wrażliwości na insulinę i adipogenezie została opisana, ale pozostaje niedo zrozumiana 26,27,28,29. Inne potencjalne funkcje, szczególnie w pośredniczeniu przesłuchu z innymi typami komórek i narządami, pozostają w dużej mierze nieznane. Obfitość26 pojazdów elektrycznych sugeruje, że mogą odgrywać ważne role zarówno w sygnalizacji lokalnej, jak i systemowej, jednak biologiczne znaczenie i mechanizmy działania AdEV pozostają w dużej mierze niezbadane. Ta luka w wiedzy podkreśla potrzebę solidnych i wyspecjalizowanych metod badania wydzielania i funkcjonowania AdEV.

Aby wypełnić tę lukę, wygenerowaliśmy adipocytowo-specyficzne myszy CD63-GFP (AdipCD63-GFP) poprzez krzyżowanie myszy Adiponektyn-Cre z myszami Stopfl/fl/CD63-GFP (szczep #:036865, JAX). Wzorce Stopfl/fl/CD63-GFP, które nie wyrażały CD63-GFP w przypadku braku Cre, zostały użyte jako grupy kontrolnej. Szczep raportujący CD63-GFP został skutecznie wykorzystany do śledzenia EV specyficznych dla typu komórek in vivo, w tym EV pochodzących od endotelu i neuronów30,31. Ponieważ adiponektyna jest wyrażana wyłącznie w dojrzałych adipocytach, a nie w komórkach progenitorowych adipocytów (APCs)32,33, a CD63 jest markerem EV34, GFP+ EV wykryte w krążeniu i tkankach można konkretnie zidentyfikować jako AdEV. W związku z tym w tym badaniu GFP+ EV wykryte w APC są interpretowane jako AdEV wchłaniane przez te komórki progenitorowe. Ten system reporterów umożliwia bezpośrednie monitorowanie uwalniania pęcherzyków oraz potencjalnych interakcji docelowych in vivo i in vitro, umożliwiając badanie AdEV w innych typach komórek tkanki tłuszczowej. Co ważne, AdEV są szczególnie bogate w lipidy w porównaniu z EV innych typów komórek, co czyni je bardziej wypornymi, kruchymi i trudniejszą do odzyskania przy użyciu tradycyjnych metod ultrawirowania 35,36,37. Wysokie siły odśrodkowe mogą uszkodzić te pęcherzyki lub prowadzić do znacznej utraty próbki i zanieczyszczenia, co komplikuje dalszą analizę. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zoptymalizowaliśmy workflow łączący wiele niskoobrotowych etapów wirowania z chromatografią wykluczającą rozmiar, co minimalizuje naprężenia ścinające, zachowuje integralność pęcherzyków oraz poprawia czystość i wydajność wydajności, umożliwiając dokładne ilościowe i badania funkcjonalne. Razem system CD63-GFP oraz ten zoptymalizowany proces izolacji zapewniają dostępne i powtarzalne podejście do badania wydzielania AdEV i jego funkcji w przesłuchiwaniu tkanki tłuszczowej oraz systemowej regulacji metabolicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt Albert Einstein College of Medicine, samce myszy były grupowo trzymane w temperaturze 22 °C przy wilgotności względnej 30-70% w cyklu światła i 12 godzin ciemności, zapewniano im bezwarunkowy dostęp do jedzenia i wody oraz utrzymywano na tle C57BL/6J.

1. Wykrywanie in vivo wydzielanych AdEV poprzez wychwyt przez APC

  1. Przygotowanie bufora
    1. Bufor trawienia: Przygotuj DMEM buforowany HEPES, dodając 0,5 mL 1 M HEPES oraz 0,5 g ubogiej kwasów tłuszczowych w surowicę bydłą albuminę (BSA) do 50 mL DMEM. Mieszaj, aż się rozpuści.
    2. Bufor do płukania: Przygotuj PBS z 2,5 mM kwasu etylendiaminetetraoctowego (EDTA) oraz 4% surowicy płodowej bydła (FBS).
    3. Przygotuj Liberazę i DNazę 1 w dawce 5 mg/mL i 5 KU/mL. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrażać tuż przed użyciem.
  2. Zbieranie tkanki tłuszczowej pachwinowej i trawienie
    UWAGA: Czteromiesięczne myszy kontrolne AdipCD63-GFP i CD63-GFP zostały uśpione poprzez inhalację dwutlenkiem węgla. Przed izolacją APC, uśpione myszy umieszczano w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    1. Usuń tkanki tłuszczowe techniką sterylną i umieść 1 g tkanki w 0,5 mL buforu trawiennego, a tkaczkę drobno zmiełknij sterylnymi nożyczkami na kawałki nie większe niż 1 mm.
    2. Zawiesić posiekaną tkankę w 10 mL strawionego buforu zawierającego 0,5 mg/mL liberazy i 50 U/mL DNazy 1.
    3. Inkubuj w temperaturze 37 °C na orbitalnym shakerze (100 obr./min) przez 30-60 minut. Delikatnie mieszaj tkankę, odwracając rurkę kilka razy podczas inkubacji. Gdy roztwór wydaje się mętny i nie pozostaną widoczne fragmenty tkanek, trawienie uważa się za zakończone.
  3. Izolacja transporterów opancerzonych
    1. Rozcieńcz zawiesinę dwoma objętościami bufora trawienia i delikatnie odwróć rurkę 3-4 razy.
    2. Przepuszczenie przez sterylny filtr o średnicy 100 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę.
    3. Wiruj filtrat w 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń część adipocytu supernatantowego i oznacz pellet jako frakcję naczyniową stromalną (SVF).
    5. Przygotuj świeży bufor lizy 1× czerwonych krwinek (RBC) z wodą sterylną. Rozwinij czerwone krwinki w SVF, inkubując je na lodzie przez 5 minut, chronione przed światłem.
    6. Dodaj dwie objętości buforu do prania, następnie filtruj w wirówce o stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Stosuj się do protokołu izolacyjnego zestawu progenitora tkanki tłuszczowej (mysz), ponownie zawiesij SVF w buforze 80 μLof (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) na gram tkanki.
    8. Dodaj 20 μL koktajlu nie-adipocytowego protedenatora na gram tkanki.
    9. Wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C w ciemności.
    10. Przepuścić próbkę przez kolumnę LS i pobrać przepływ.
    11. Wiruj przepływ (ujemny dla CD31, CD45, Ter119) w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać APC do badania.
  4. Wykrywanie wydzielanych AdEV za pomocą APC za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Zasiewaj 250 μL izolowanych APC (1 × 104 komórek /mL) z myszy AdipCD63-GFP lub CD63-GFP na szkiełka z komorą 8 dołków pokrytą kolagenem i pozwól komórkom na przyłączenie się przez około 6 godzin.
    2. Utrwal komórki 4% paradehydem przez 10 minut, aby zachować struktury komórkowe i EV do obrazowania.
      UWAGA: W tych testach sygnały GFP oznaczają AdEV, a ich wykrywanie w APC za pomocą mikroskopii konfokalnej wskazuje na wychwyt AdEV przez te komórki progenitorowe.
    3. Przemyj slajdy trzykrotnie PBS, zamontuj za pomocą medium antyfade i rejestruj sygnały GFP za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy o średnicy 63×. Uzyskuj obrazy jako zestawy serii z krokiem 0,5 μm, używając lasera 488 nm do wzbudzania GFP i wykrywania emisji na 500-550 nm.
  5. Wykrywanie wydzielanych AdEV poprzez wychwyt APC za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Licz APC i rozcieńczaj barwnik żywotności (np. Zombie) 1:1000 w 1X PBS. Zawiesz komórki w stężeniu 1× 106 na 100 μL. Inkubuj przez 20 minut na lodzie, chroniony przed światłem.
    2. Przemyj komórki raz buforem do mycia. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
    3. Zawiesz komórki w buforze barwiącym o stężeniu 1× 106 na 100 μL.
    4. Blokuj niespecyficzne wiązanie odczynnikiem blokującym receptory Fc (np. anty-CD16/CD32) w stosunku 1:100 na lodzie przez 10 minut.
    5. Przeciwciało Sca-1 przed spinowaniem w dawce 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 1 μL przeciwciała Sca-1 do rurki APC i inkubuj przez 20 minut na lodzie, pozostawiając rurkę przykrytą folią.
    6. Myj dwa razy z 1 ml buforu do mycia, wiruj w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
    7. Zawiesz komórki w buforze płukania w temperaturze około 1 × 106 komórek na 500 μL do sortowania cytometrii przepływowej. Pobierz dane dla komórek Sca1+ i GFP+ na cytometrze przepływowym spektralnym wyposażonym w laser fioletowy 405 nm (filtr 450/50 nm dla Pacific Blue) oraz laser 488 nm niebieski (filtr 530/30 nm dla GFP). Przeanalizuj próbki za pomocą działającego oprogramowania instrumentu, z zamkniętymi komórkami Sca1+ oraz analizowanym podzbiorem GFP+ w tej populacji, jak pokazano na Rysunku 2.

2. Wykrywanie i analiza wydzielanych AdEV in vitro

  1. Różnicowanie APC do dojrzałych adipocytów
    UWAGA: Wszystkie hodowle są utrzymywane w temperaturze 37 °C, 8%CO2 , chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Dzień 0: Pokrywać naczynia żelatyną 0,2% przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), aspirować i nasionować świeżo wyizolowane APC w DMEM/F12 + 15% FBS + 1% penicylina/streptomycyna (P/S) + 0,1% Primocyna, aby osiągnąć 100% konfluencję przed różnicowaniem.
    2. Dzień 1-8: Zastąpienie pożywką różniczkową MesenCult adipogeniczną (łącznie 50 mL: 45 mL zasad + 5 mL suplementu + 0,5 mL GlutaMAX + 50 μL Primocin), zmiana na świeżą podłoże różnicujące w dniu 4.
    3. Dzień 9: Dwukrotnie myj adipocyty PBS, następnie zastępuj je dojrzałym podłożem hodowlowym (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocin) i utrzymuj przez 16 godzin.
  2. Izolacja i oczyszczanie AdEV
    1. Przepuścić powyżej hodowlę adipocytów wygenerowaną powyżej 15 mL, najpierw przez filtr 40 μm, a następnie przez filtr 30 μm.
    2. Wiruj filtrat w 500 × g przez 5 minut, a następnie 2 000 × g przez 10 minut, aby usunąć pozostałości komórek i zanieczyszczenia.
    3. Przepuszcz filtrat przez filtr 0,8 μm, a następnie koncentruj medium z 15 mL do 0,5 mL za pomocą jednostki ultrafiltracji odciętej 100 kDa (objętość próbki 15 mL) poprzez wirowanie w 4 000 × g przez 15 minut.
    4. Załaduj próbkę do kolumn chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC) z automatycznym kolektorem frakcji i zbieraj frakcje F1-8.
    5. Skoncentruj zebrane frakcje EV za pomocą jednostki ultrafiltracji odciętej 100 kDa (objętość próbki 4 mL) i przystąpi do weryfikacji zawartości EV w każdej frakcji za pomocą western blota, instrumentu do analizy śledzenia nanocząsteczek oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
  3. Walidacja, ilościowość i ocena rozmiaru/morfologii AdEV
    1. Analiza zachodnich plam markerów EV
      1. Każdą frakcję skoncentruj w zakresie od 400 μL do 25 μL, następnie dodaj 50 μL buforu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy. Denaturuj próbki, dodając bufor ładowający 2× siarczanu dodecylosiarczanu sodu (SDS) i rozpuszczając białka na żelu triglicynowym o stężeniu 4-12%.
    2. Analiza wielkości, koncentracji i jakości EV za pomocą instrumentu do śledzenia nanocząstek.
      1. Przed analizą rozcieńcz próbki EV sterylnym, 0,1 μm filtrowanym PBS w stosunku 1:1000, zapewniając stężenie cząstek w optymalnym zakresie detekcji (około 107-10 9 cząstek/mL). Delikatnie mieszaj rozcieńczone próbki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
      2. Załadować próbkę do instrumentu wyposażonego w wysokoczułą naukową kamerę komplementarno-metalowo-tlenkową (sCMOS), zielony moduł laserowy o średnicy 532 nm oraz próg detekcji 10 nm (do 1 000 nm) / 106 do 109 cząstek/mL.
      3. Wykonaj obrazowanie i ilościowanie za pomocą pakietu oprogramowania NS Xplorer, który stosuje dynamiczny algorytm obserwacji objętościowej oparty na stężeniach.
    3. Badanie morfologii EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
      1. Przekazać 50 μL EV, zebranych przed stężeniem, do centralnego obiektu do negatywnego barwienia EV. Stosuj EV do miedzianych siatek o grubości 400 meet wyłącznie o węglu, które zostały oczyszczone plazmowo środkiem czyszczącym.
      2. Po krótkim adsorbcyjnym przepłukaniu kratki wodą destylowaną, negatywnie zabarw 1% (w/v) octanu uranilu i usuń nadmiar bejcy papierem filtracyjnym przed suszeniem na powietrzu. Następnie obrazuj siatki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego z częstotliwością 120 KV.

3. Informacje o bezpieczeństwie i odpadach

  1. Obchodz się z paraformaldehydem i octanem uranilu w okapu z użyciem środków ochrony osobistej (PPE), ponieważ oba są toksyczne. Zbieraj odpady octanu uranylu w oznaczonych pojemnikach na niebezpieczne środki.
  2. Traktować wszystkie próbki biologiczne jako potencjalnie zakaźne i usuwać materiały zgodnie z instytucjonalnymi politykami i protokołami bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu wykrywania AdEV poprzez absorpcję APC za pomocą mikroskopii konfokalnej, izolowaliśmy APC z tkanek pachwinowych myszy AdipCD63-GFP i Stopfl/fl/CD63-GFP i barwiliśmy je DAPI w celu wizualizacji jąder. Podczas badania mikroskopii konfokalnej APC myszy Stopfl/fl/CD63-GFP nie wykazały wykrywalnych punktów GFP (Rysunek 1A). Dla porównania, APC wyizolowane z myszy AdipCD63-GFP wykazywały liczne odrębne punkty GFP w cytoplazmie (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół wypełnia istotną lukę metodologiczną, zapewniając solidny i powtarzalny system do izolowania i charakteryzowania AdEV oraz ich przyjmowania przez APC. W porównaniu do EV z innych źródeł, AdEV są bardziej bogate w lipidy i wyporności, co sprawia, że klasyczne techniki izolacji oparte na ultrawirowaniu są mniej wydajne35. Jednak większość opublikowanych protokołów oczyszczania AdEV nadal opiera się na ultrawiringu, co może wpływać na morfologię pęcherzyków, prowadzić do powstawania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Einstein Flow Cytometry Core za FACS oraz Analytical Imaging Facility za całą analizę obrazów. Prace te były częściowo wspierane przez granty National Institutes of Health DK128839 oraz grant wsparcia centrów onkologicznych NCI P30CA013330.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260G500x rozcieńczenie
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000x rozcieńczenia wodą
1 M HEPESGibco156300801000x rozcieńczenie
Zestaw izolacyjny tkanki tłuszczowej, myszMiltenyi biotec30-106-639Gotowy do użycia
Filtr odśrodkowy Amicon ultra, 100 kDa MWCOSigmaUFC910015 mL objętości próbki
Filtr odśrodkowy Amicon ultra, 100 kDa MWCOSigmaUFC91004 mL objętości próbki
BSASigmaA6003Gotowy do użycia
Przeciwciało CalnexinCalnexinab225951000x rozcieńczenie
Przeciwciało CD63abcamab217345500x rozcieńczenie
CD81Technologia sygnalizacji komórkowej10037500x rozcieńczenie
Corning   BioCoat  Preparat z kultury kolagenu ISigmaCLS354630Gotowy do użycia
Corning   sito komórkoweSigmaCLS43175040 μ Rozmiar porów m
Corning   sito komórkoweSigmaCLS431752100 μ Rozmiar porów m
Przeciwciało COX IVTechnologia sygnalizacji komórkowej48441000x rozcieńczenie
DMEMGibco11965092Gotowy do użycia
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXThermofisher10565018Gotowy do użycia
Dnase 1SigmaD4513Magazyn 5 KU/mL przy -20 i stopniach; C
Suplement GlutaMAXGibco35050061100x rozcieńczenie
Halt™ Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)Thermofisher78444Gotowy do użycia
Przeciwciało HSP70abcamab1816061000x rozcieńczenie
Invitrogen eBioscience 10X Bufor Lizy RBC (wielogatunkowy)Fisher Scientific50-112-974310x rozcieńczenie w wodzie
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Gotowy do użycia
Mikroskop konfokalny LEICA STELLARIS 8Mikroskopy LeicaNie ma
Liberase TM Stopień BadawczySigmaLIBTM-ROMagazyn 5 mg/mL przy -20 stopniach i stopień; C
Filtr strzykawkowy Millex MCESigmaSLAA0250,8 μ Rozmiar porów m
NanoSight ProMalvern PanalyticalNie ma
Novex Tris-Glycine Mini Protein Gels, 4– 12%,ThermofisherXP04120BOXGotowy do użycia
Bufor próbek SDS Novex Tris-glycine (2x)ThermofisherLC2676Gotowy do użycia
Przeciwciało Ly-6A/E (Sca-1) przeciwko myszy Pacific BlueBioLegend108119Rozcieńczenie 25x
Roztwór paraformaldehydu (16%)Fisher Scientific50-980-487rozcieńczyć do 4% z PBS
pluriStrainer S / 30 & micro; m (sitko komórkowe)Fisher ScientificNC092245930 μ Rozmiar porów m
Rozwiązanie S PonceauSigmaP7170-1LGotowy do użycia
PrimocinInvivogenNC9141851500x rozcieńczenie
ProLong Gold Antifade Reagent z DAPITechnologia sygnalizacji komórkowej8961SGotowy do użycia
Oczyszczone przeciwciało przeciwmysie CD16/32BioLegend101301100x rozcieńczenie
RIPA buffer Fisher ScientificPI8990010x rozcieńczenie w wodzie
Cytometr przepływu spektralnego (Aurora 3)Cytek BiosciencesNie ma
Przeciwciało Syntaxin 4Systemy synapcyjne1100425000x rozcieńczenie
Tecnai 20 (Transmisyjny Mikroskop Elektronowy)FEINie ma
Tergeo-EMPIE Scientific LLCNie ma
Przeciwciało winkulinoweabcamab185085000x rozcieńczenie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionCD63 GFP ReporterStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

Powiązane artykuły