Artykuł badawczy

Długie niekodujące RNA IRAIN steruje immunometlicznym przeprogramowaniem glejaka za pomocą osi IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

328 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

12 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wykorzystując zintegrowane uczenie maszynowe w wielu kohortach, zbudowaliśmy solidny prognostyczny sygnaturę IMRG dla glejaka. IRAIN jest wyraźnie obniżony, odwrotnie szaleny od stopnia i przeżycia, i tłumi sygnalizację IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, ograniczając proliferację, migrację i angiogenezę. Wyniki wskazują IRAIN i IMRG jako biomarkery i cele terapeutyczne.

Streszczenie

Glejak to agresywny nowotwor o ograniczonych opcjach leczenia i o słabym rokowaniu. Jego postęp jest ściśle powiązany z przeprogramowaniem metabolicznym i unikiem immunizmu, co podkreśla potrzebę identyfikacji molekularnych regulatorów integrujących te procesy. Tutaj ustaliliśmy solidny prognostyczny sygnaturę genetyczną powiązaną z immunometabolicznym (IMRG) oraz wyjaśniliśmy rolę długiego niekodującego RNA IRAIN w regulacji immunometliany glejaka za pomocą osi IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Analizowano dane transkryptomiczne i kliniczne z kohort TCGA, CGGA (693/325) oraz GEO (GSE43378). Różnicowa ekspresja i analiza sieci współekspresji genów (β = 8) zapewniły topologię wolną od skalowania, a ramy walidacji krzyżowej typu leave-one-out, łączące dziesięć algorytmów uczenia maszynowego, dały 101 modeli prognostycznych. Optymalny 17-genowy podpis IMRG został zweryfikowany we wszystkich kohortach i niezależnie przewidywał całkowite przeżycie. Testy funkcjonalne wykazały, że nadekspresja IRAIN hamowała IGF1R, hamowała fosforylację JAK2/STAT3 oraz obniżała poziom BIRC5, co sprzyjało apoptozie i zmniejszało angiogenezę. Niska ekspresja IRAIN koreluje z immunosupresyjnymi Tregami i makrofagami M2 oraz z podwyższonymi wynikami guza i mikrośrodowiska, co sugeruje fenotyp unikający immunoterapii. Wyniki te potwierdzają IRAIN jako kluczowego regulatora immunometlicznego przeprogramowania glejaka i potwierdzają sygnaturę IMRG jako wiarygodnego narzędzia prognostycznego, podkreślając szlak IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 jako mechanistyczny most łączący zaburzenia odpornościowe i metaboliczne w glejaku oraz oferując potencjalne cele precyzyjnej terapii.

Wprowadzenie

Glejak jest najczęstszym pierwotnym nowotworem ośrodkowego układu nerwowego i pozostaje jednym z najgroźniejszych nowotworów u człowieka, mimo postępów w neurochirurgii, radioterapii i chemioterapii. Glejaki wysokiego stopnia, szczególnie glejak wieloformowy (GBM), charakteryzuje się szybkim rozprzestrzenianiem, rozproszonym przesiewem i nieuchronnym nawrotem 1,2. Ostatnio pojawiło się wiele skutecznych metod terapeutycznych, takich jak interwencje chirurgiczne, immunoterapia oraz chemiachemiczna 3. Mediana przeżycia utrzymuje się około 14-18 miesięcy, nawet przy maksymalnej terapii, co podkreśla potrzebę nowych strategii terapeutycznych i prognostycznych biomarkerów4.

Wzajemne oddziaływanie mikrośrodowiska guza (TME) a komórkami nowotworowymi kluczowe jest dla agresywnego wzrostu i heterogeniczności molekularnej glejaków. Liczne składniki odpornościowe, w tym mikroglej, komórki prekursorowe neuronów, komórki naczyniowe oraz komórki odporności adaptacyjnej, są ściśle zaangażowane w kształtowanie TME 5,6,7. W ostatnich latach nastąpiły niezwykłe postępy w immunoterapii, rozpoczynając przełomową erę onkologii. Niemniej jednak blokada punktów kontrolnych układu odpornościowego (ICB) oraz inne metody immunoterapeutyczne wykazały jedynie ograniczone skutki w leczeniu glejaka8. Niepowodzenie immunoterapii w tym kontekście wynika z kilku wewnętrznych cech mikrośrodowiska glejaka – mianowicie niskiego obciążenia mutacyjnego guza, wyraźnej heterogeniczności wewnątrznowa, słabej przepuszczalności bariery krew-mózg, obniżenia poziomu głównych złożonych cząsteczek zgodności tkankowej oraz rzadkiej infiltracji limfocytów T 9,10,11,12.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że mikrośrodowisko guza (TME), które wykazuje zaburzenia metaboliczne, charakteryzuje się kwasowymi warunkami, niedoborem składników odżywczych oraz nagromadzeniem metabolitów tłumiących odpowiedzi immunologiczne. Stan ten prowadzi następnie do dysfunkcji komórek odpornościowych, które przenikają do guzów, i zmniejsza skuteczność immunoterapii13. Jednocześnie komórki odpornościowe w TME przechodzą kontekstowo zależne zmiany metaboliczne, które decydują o ich różnicowaniu i funkcjach efektorowych. Na przykład aktywowane limfocyty T polegają na glikolizie do szybkiego rozmnażania, podczas gdy limfocyty T regulacyjne (Tregs) i makrofagi związane z nowotworami (TAM), szczególnie podtyp M2, polegają na fosforylacji oksydacyjnej i metabolizmie kwasów tłuszczowych, aby utrzymać swoją aktywność immunosupresyjną14,15.

Dlatego integracja sygnatur immunologicznych i metabolicznych oferuje racjonalne ramy do lepszej klasyfikacji glejaków i przewidywania rokowania pacjenta. Długie niekodujące RNA (lncRNA) niedawno stały się wszechstronnymi regulatorami architektury chromatyny, transkrypcji genów oraz modyfikacji posttranskrypcyjnych. Kilka lncRNA zostało powiązanych z patogenezą glejaka, wpływając na proliferację, inwazję i modulację immunologiczną16. Wśród nich wdrukowany transkrypt antysensowy IRAIN (IGF1R antysensowne wdrukowane niekodujące białka) zyskał uwagę ze względu na swoją rolę w regulacji genu receptora czynnika wzrostu insulinopodobnego 1 (IGF1R) poprzez interakcje chromatyny działającej cis, który wykazuje się obniżoną regulacją i zmniejsza kontrolę konkurencji cis, zwłaszcza w komórkach nowotworowych, takich jak rak piersi, linie komórkowe białaczki. raka krtani, oraz ostrej białaczki szpikowej, która bezpośrednio prowadzi do wzrostu poziomu IGF1R 17,18,19. Ponieważ sygnalizacja IGF1R aktywuje kolejne szlaki JAK-STAT i PI3K-AKT — oba kluczowe dla wzrostu guzu i regulacji odporności20,21 — zmiany w ekspresji IRAIN mogą krytycznie wpłynąć na immunometabolizmę guza. Jednak rola IRAIN w glejaku oraz jego potencjalny wpływ na krajobraz immunometaliczny nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wypełnienie tej luki w wiedzy może dostarczyć mechanistycznego wglądu w to, jak niekodujące RNA koordynują adaptację metaboliczną i unikanie immunologiczne w glejaku.

W tym badaniu połączyliśmy dane transkryptomiczne wielokohtorowe z walidacją eksperymentalną, aby zbadać regulację immunometliczną w glejaku. Korzystając z zintegrowanych ram uczenia maszynowego w kohortach TCGA, CGGA (693/325) i GEO (GSE43378), zidentyfikowaliśmy solidny prognostyczny sygnaturę genu immunometabolicznie powiązanego z 17 genami (IMRG), zdolną do stratyfikacji przeżycia pacjentów na różnych zbiorach danych. Następnie skupiliśmy się na IRAIN jako potencjalnym regulatorze tej sieci, biorąc pod uwagę przewidywaną interakcję z osią sygnalizacji IGF1R-JAK-STAT. Testy funkcjonalne wykazały, że nadmierna ekspresja IRAIN hamuje proliferację glejaka i angiogenezę poprzez hamowanie ekspresji IGF1R oraz dalszej fosforylacji STAT3, co skutkuje obniżoną ekspresją białka antyapoptotycznego BIRC5 (znanego również jako Survivin). Łącznie te wyniki wspierają działający model, w którym IRAIN pełni rolę mechanistycznego mostu łączącego regulację immunologiczną z przeprogramowaniem metabolicznym w glejaku. Hipotezujemy, że zaburzenia ekspresji IRAIN sprzyjają postępowi guza poprzez zaburzenie tej równowagi, co sprzyja immunosupresyjnemu mikrośrodowisku i zapewnia odporność na terapię.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem tkanek ludzkich były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi oraz Deklaracją Helsińską i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Uniwersytetu Medycznego w Fujian (Nr Zatwierdzenia 2021KYB089). Przed pobraniem tkanek uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników.

Analiza ekspresji genów i przeżycia
Dane sekwencjonowania RNA oraz odpowiadające im informacje kliniczne zostały pozyskane z wielu publicznych baz danych. 1) Kohorta TCGA: dane RNA-seq (FPKM) dla 175 próbek glejaka wieloformowego (GBM) i 534 glejaka niskiego stopnia (LGG) zostały pobrane z The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Badania kontrolne prawidłowe: Profile ekspresji 211 prawidłowych tkanek mózgowych i 662 tkanek glejaka zostały pobrane z bazy danych UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Zewnętrzna walidacja: Dane z CGGA693 i CGGA325 kohort pozyskano z chińskiego Atlasu Genomu Glejaka (http://www.cgga.org.cn); 4) Zbiór danych GEO: Zbiór GSE43378, zawierający dane o ekspresji i badaniach klinicznych dla 50 próbek glejaków, został pobrany z Omnibusa Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Wszystkie surowe dane liczebne zostały przekształcone na transkrypcje na milion (TPM) i przekształcone w log2. W przypadku już znormalizowanych zbiorów danych analizowano macierze ekspresji, aby zapewnić porównywalne rozkłady. Geny z wartościami TPM < 1 w ponad 80% próbek zostały wykluczone. Brakujące informacje kliniczne (wiek, status IDH, kodletacja 1p/19q, metylacja MGMT) zostały usunięte za pomocą filtracji pełnej sprawy. Efekty wsadowe między zbiorami danych były dostosowane za pomocą algorytmu ComBat zaimplementowanego w pakietie R sva. Wartości wyrażeń zostały standaryzowane przez transformację z-score w każdym zbiorze danych. Analizy przeżywalności przeprowadzono przy użyciu pakietów R – przetrwania i przeżywalnika. Pacjenci byli podzieleni na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji zgodnie z medianą poziomu ekspresji IRAIN. Opracowano krzywe przeżycia Kaplana-Meiera, a istotność statystyczną oceniono za pomocą testu log-rank. Współczynniki ryzyka (HR) oraz 95% przedziały ufności (CI) zostały oszacowane za pomocą modeli regresji Coxa w zakresie zagrożeń proporcjonalnych.

Definicja zestawów genów immunologicznych i metabolicznych
Geny powiązane z układem odpornościowym (IRG, n = 2 483) pozyskano z bazy danych ImmPort (https://www.immport.org/shared/), a geny związane z metabolizmem (MRG, n = 948) z Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). Połączony zestaw tych genów został zdefiniowany jako geny immunometaboiczne (IMRG). Listy te służyły jako odniesienia do późniejszych analiz różnicowej ekspresji i sieci.

Analiza różnicowej ekspresji i ważonej sieci współekspresji genów
Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) pomiędzy prawidłowymi tkankami mózgu a glejaka zostały zidentyfikowane za pomocą pakietu R limma. Dane ekspresyjne zostały wyposażone w model liniowy, po którym następnie zastosowano empiryczną moderację Bayesa. Geny z |log₂ zmianą fałdów| > 1,5 oraz wskaźnik fałszywego odkrywania (FDR) < 0,05 uznano za istotnie różnicowo wyrażone. Analiza ważonej sieci współekspresji genów (WGCNA) została przeprowadzona przy użyciu pakietu R WGCNA. Próbki odstawające zostały wykluczone przez hierarchiczne klasterowanie. Moc miękkiego progu została ustawiona na β = 8, aby uzyskać indeks dopasowania topologii wolny od skali (R2 ≥ 0,85) przy zachowaniu odpowiedniej średniej łączności. Skonstruowano topologiczne macierze nakładania się (TOM), a geny pogrupowano w moduły o minimalnym rozmiarze 50 za pomocą algorytmu dynamicznego cięcia drzewa. Geny własne modułów zostały skorelowane z cechami klinicznymi, a moduł najbardziej związany z glejakiem (r > Pearsona 0,7, P < 1×10-10) został wybrany do identyfikacji genu huba.

Prognostyczna konstrukcja oparta na uczeniu maszynowym
Zastosowano kompleksowy framework walidacji krzyżowej typu leave-one-out (LOOCV), integrujący dziesięć algorytmów uczenia maszynowego, aby skonstruować i ocenić modele prognostyczne. Łącznie zaimplementowano 101 kombinatorycznych przepływów pracy z wykorzystaniem kohorty TCGA jako zbioru danych treningowych. Geny immunometaboiczne związane z rokowaniem (IMRG) zostały po raz pierwszy zidentyfikowane za pomocą jednowymiarowej regresji Coxa (P < 0,05). Optymalny model został wyznaczony poprzez maksymalizację średniej indeksu konkordancji Harrella (C-index) w trzech zbiorach danych walidacyjnych (CGGA693, CGGA325 i GSE43378). Powstały model RSF-Enet (α = 0,3) wykazał najwyższe wyniki predykcyjne i zachował solidną uogólnialność pomiędzy niezależnymi kohortami22.

TME i infiltracja immunologiczna
Aby kompleksowo scharakteryzować krajobraz immunogenomiczny, zastosowaliśmy wielopoziomowe podejście analityczne. Najpierw poziomy infiltracji immunologicznej i stromalnej zostały zmierzone za pomocą algorytmu ESTIMATE23. Różnicową ekspresję kluczowych cząsteczek punktów kontrolnych immunologicznych, w tym PDCD1, CTLA4 i LAG3, oceniono następnie za pomocą analizy opartej na limma, a korelacje między genami punktów kontrolnych zwizualizowano za pomocą macierzy korelacyjnych. Profile mutacji somatycznej z 903 próbek glejaka w kohortze TCGA zostały wykorzystane do obliczenia wyników obciążenia mutacyjnego guza (TMB), niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) oraz dysfunkcji i wykluczenia odporności guza (TIDE), aby przewidzieć potencjalne odpowiedzi na immunoterapię. Pacjenci zostali następnie podzieleni na cztery grupy prognostyczne według łącznego statusu TMB (wysoki/niski) oraz wyników ryzyka (wysoki/niski), a wyniki przeżycia porównano za pomocą analizy Kaplan-Meier.

Analiza wzbogacania funkcjonalnego
Analizy wzbogacenia szlaków w Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zostały przeprowadzone przy użyciu pakietu R clusterProfiler. Wyniki wzbogacenia o skorygowanych wartościach P < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Nadmiernie reprezentowane procesy biologiczne, komponenty komórkowe i funkcje molekularne były wizualizowane za pomocą wykresów kroplowych i słupkowych. Sieci interakcji białko-białko (PPI) zostały skonstruowane przy użyciu bazy danych STRING (≥ 0.4) i zwizualizowane w Cytoscape. Moduły funkcjonalne w sieci PPI zostały zidentyfikowane za pomocą algorytmu MCODE. Interakcje gen-gen i sieci współekspresji zostały dodatkowo przeanalizowane za pomocą GeneMANIA (https://string-db.org wskaźnik ufności ≥ 0,4) i zwizualizowane w Cytoscape. Moduły funkcjonalne w sieci PPI zostały zidentyfikowane za pomocą algorytmu MCODE. Interakcje gen–gen i sieci współekspresji zostały dalej przeanalizowane za pomocą GeneMANIA (https://genemania.org), która integruje informacje o interakcjach fizycznych i genetycznych, współdzielonych szlakach oraz wzorcach współekspresji, aby wnioskować o potencjalnych funkcjonalnych powiązaniach.

Próbki kliniczne
Świeże tkanki glejaka (n = 6) oraz parowane nienowotworowe tkanki mózgowe (n = 6; położone co najmniej 3 cm od brzegu guza i histologicznie potwierdzone jako wolne od guza) pobrano od pacjentów poddawanych pierwotnej resekcji glejaka w Szpitalu Afiliowanym w Zhangzhou Uniwersytetu Medycznego Fujian. Żaden z pacjentów nie otrzymał chemioterapii ani radioterapii przed operacją. Wszystkie diagnozy patologiczne zostały niezależnie zweryfikowane przez dwóch neuropatologów zgodnie z klasyfikacją guzów ośrodkowego układu nerwowego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2021 roku. Bezpośrednio po wycięciu chirurgicznym próbki tkanek były płukane lodowato solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w celu usunięcia pozostałej krwi, zamrażano na szybko, w ciekłym azocie (-196 °C) i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.

Linie komórkowe i hodowla komórkowa
Linie komórkowe ludzkiego glejaka SHG44, U251, A172 i T98G, a także normalne ludzkie komórki glejowe (HEB), zostały pozyskane z uwierzytelnionych repozytoriów i potwierdzone, że przed użyciem są wolne od skażenia mykoplazmą. Komórki były utrzymywane w zmodyfikowanym medium Eagle's Medium (DMEM, wysoka glukoza) Dulbecco, uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydła (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1% penicylin-streptomycyny, w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂. Komórki były przepuszczane co 4-5 dni po osiągnięciu 80-90% zbiegu. Aby ustalić i kontrolować linie komórkowe z nadmierną ekspresją IRAIN, komórki zostały przetransdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych niosących pełnowymiarowy transkrypt IRAIN lub pusty wektor jako kontrolę. Stabilne klony zostały wybrane przy użyciu puromycyny (2 μg/mL) przez 14 dni. Skuteczność nadekspresji potwierdzono za pomocą ilościowej transkrypcji odwróconej PCR (qRT-PCR) przed dalszymi testami.

Test proliferacji komórek 3- (4,5-dimetytoltiazol-2-yl)-2,5-difenylottetrazolu bromku (MTT)
Komórki były zasiewane na płytach z 96 dołkami o gęstości 1× 104 komórek na dołek w 100 μL kompletnego medium hodowlanego. Po 24, 48 i 72 godzinach po zasiewaniu do każdej studni dodano 20 μL roztworu MTT (5 mg/mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie usunięto supernatant, a dodano 150 μL dimetylosulfenu (DMSO), aby rozpuścić kryształy formazonu. Płytka była delikatnie mieszana przez 10 minut, aby zapewnić pełną rozpuszczalność. Absorpcja została zmierzona na poziomie 490 nm za pomocą mikropłytkowego spektrofotometru. Odczyty tła z pustych studni zostały odejmowane. Żywotność komórek obliczono względem grupy kontrolnej 24-godzinnej (ustawionej na 1,0). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na sześciu replikatach technicznych oraz trzech niezależnych replikatach biologicznych. Dane wyrażane są jako średnie ± odchylenia standardowego (SD), a istotność statystyczna została określona za pomocą dwustronnego testu t.

Cytometria przepływowa w apoptozie (Annexin V - barwienie fitc/pi)
Komórki zostały zasiane przy zbiegu 60-70% i traktowane przez 24 godziny w wskazanych warunkach. Komórki pływające i przylegające zostały pobrane za pomocą trypsyny wolnej od EDTA, połączone i dwukrotnie przemyte lodowatym PBS. Pellety komórkowe zostały ponownie zawieszone w buforze wiązającym Annexin V (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) przy stężeniu 1 × 106 komórek/mL. Dla każdej próbki 100 μL zawiesiny inkubowano w ciemności z 5 μL Annexin V-FITC i 5 μL jodku propidium (PI; 50 μg/mL) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 400 μL buforu wiązającego, próbki były przechowywane na lodzie i analizowane w ciągu 1 godziny na cytometrze przepływowym (wzbudzenie 488 nm; 530/30 nm dla FITC i >585 nm dla PI). Uwzględniono odpowiednie kontrolne metody pojedynczego barwienia oraz fluorescencja minus jeden dla kompensacji. Zarejestrowano co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę. Dane analizowano według ograniczeń kwadrantowych: populacje żywe (Annexin V⁻/PI⁻), wczesne apoptotyczne (Annexin V⁺/PI⁻), późnoapoptotyczne (Annexin V⁺/PI⁺) oraz martwicze (Annexin V⁻/PI⁺). Zgłoszono procenty komórek wczesnej + późnej apoptozy (średnia ± SD, n = 3).

Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
Całkowite RNA zostało wyizolowane za pomocą odczynnika kwasowo-fenol-guanidyniowego zgodnie z protokołem producenta. Czystość RNA została zweryfikowana spektrofotometrią (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), a integralność potwierdzono elektroforezą żelową (integralność RNA ≥ 7). Jeden mikrogram całkowitego RNA został poddany DNazie I i odwrócony w reakcji 20 μL przy użyciu losowych heksamerów i oligo(dT) primerów. Reakcja przeprowadzono w temperaturze 25 °C przez 10 minut, 50 °C przez 30 minut oraz 85 °C przez 5 minut. Ilościowe PCR wykonano w systemie o pojemności 10 μL zawierającym 5 μL 2× SYBR Green Master Mix, 0,3 μM na każdy primer oraz 1 μL cDNA (≈ równoważnika 20 ng RNA). Warunki cyklicznego termicznego to 95 °C przez 5 minut, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s, a następnie analiza krzywej topnienia od 65 °C do 95 °C w krokach 0,3 °C. Wszystkie reakcje wykonywano w trzech egzemplarzach, wraz z użyciem sterowania bez szablonu i bez RT. Wartości Ct > 35 lub techniczne repliki SD > 0,5 zostały wykluczone. Wyrażenie względne obliczono metodą 2⁻ΔΔCt, z GAPDH jako wewnętrzną kontrolą. Zgłoszono średnie wartości ± SD z trzech niezależnych biologicznych replikacji, a różnice grupowe analizowano za pomocą dwustronnego testu T.

Analiza zachodniej plamy
Komórki były lizowane na lodzie w buforze RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksycholatu sodu, 0,1% SDS) uzupełnionym inhibitorami proteazy i fosfatazy. Lizaty inkubowano przez 30 minut na lodzie z przerywanym wirowaniem i oczyszczano przez wirowanie w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Stężenia białek zmierzono za pomocą testu BCA, skorygowano do 1-2 μg/μL i mieszano w proporcji 1:3 z buforem Laemmli 4× (ostatni bufor 1× zawierający 100 mM DTT). Próbki były denaturowane w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Równe ilości białka (50 μg) były rozdzielane przez 12% SDS-PAGE przy napięciu 100 V przez 90 minut i elektrotransmitowane do membran PVDF przy 250 mA przez 90 minut. Błony były blokowane 5% mlekiem beztłuszczowym w TBST (0,1 % Tween-20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (lub 5% BSA dla fosfoprotein) i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 oraz β-aktynie (typowe rozcieńczenie 1:1000, β-aktyna 1:5000). Po trzech 10-minutowych płukaniach w TBST błony były inkubowane z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP (1:5000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ponownie myte i wywoływane przy użyciu chemiluminescencyjnego podłoża. Intensywności pasmowe zostały zmierzone za pomocą ImageJ, znormalizowane do β-aktyny lub białka całkowitego i wyrażone jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów.

Immunocytochemia
Komórki wyhodowane na sterylnych szklanych pokrywkach były dwukrotnie płukane PBS i utrwalane w 4% paradehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach PBS komórki zostały permeabilizowane 0,2% Tritonem X-100 przez 10 minut, zablokowane 5% błoniną surowicy bydłej (BSA) przez 1 godzinę i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnym przeciwciałem przeciwCD31 (rozcieńczenie 1:200 w 1% BSA). Po trzech płukaniach PBS komórki były inkubowane z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorem Alexa (rozcieńczenie 1:500) przez 1 godzinę w ciemności, barwione DAPI (1 μg/mL, 5 min) i zamontowane w medium antyfade. Obrazy były wykonywane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy identycznych ustawieniach ekspozycji i wzmocnienia. Procent powierzchni CD31 dodatniej został zmierzony w pięciu losowo wybranych niepokrywających się polach na próbkę za pomocą oprogramowania ImageJ. Test ten przeprowadzono na modelach komórkowych, a nie na przekrojach tkanek.

Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzano przy użyciu wersji R 4.3.0 wraz z powiązanymi pakietami. Do porównania zmiennych kategorycznych zastosowano test chi-kwadrat, natomiast zmienne ciągłe oceniano za pomocą testu sumy rangi Wilcoxona lub testu T. Ocena zmiennych ciągłych została przeprowadzona za pomocą współczynnika korelacji Pearsona. Analizy przeżycia przeprowadzono przy użyciu pakietu przeżywalności, który obejmował modelowanie proporcjonalnych zagrożeń Coxa oraz generowanie krzywych Kaplana-Meiera, z optymalnymi progami stratyfikacyjnymi ustalonymi przez pakiet survminer oraz wzór Riskscore = Równanie 1. Pakiet CompareC został użyty do oceny indeksów C różnych zmiennych. Krzywa charakterystyki pracy odbiornika (ROC), mająca na celu przewidywanie binarnych zmiennych kategorycznych, została wygenerowana za pomocą pakietu pROC. Dodatkowo, obszar zależny od czasu pod krzywą ROC (AUC) dla metryk przetrwania został przeanalizowany za pomocą pakietu timeROC. Wszystkie testy statystyczne przeprowadzono w sposób dwustronny. Poziom istotności P < 0,05 uznano za istotny statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

IRAIN jest obniżony w glejaku i wiąże się z niekorzystnymi cechami kliniczno-patologicznymi
Proces analizy przedstawiono na Rysunku 1. Ekspresję IRAIN po raz pierwszy oceniono za pomocą qRT-PCR w pierwotnych astrocytach, tkankach glejaka oraz liniach komórkowych glejaków. Poziomy IRAIN zostały wyraźnie obniżone zarówno w tkankach glejaka o niskim stopniu, jak i wysokim stopniu oraz we wszystkich czterech liniach komórkowych glejaka (SHG44, A172, U251 i T98G) w porównaniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Glejak pozostaje jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów ośrodkowego układu nerwowego, charakteryzującym się głęboką niejednorodnością wewnątrznowotworową i opornością na terapię konwencjonalną. Pomimo chirurgicznej resekcji połączonej z chemioradioterapią, nawroty i śmiertelność pozostają wysokie, a mediana przeżycia pacjentów, szczególnie tych z glejakiem, wykazała w ostatnich dekadach niewielką poprawę – 4,24. Coraz więcej dowodów wskazuje, że przeprogram...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim uczestnikom i badaczom zaangażowanym w projekt Genotype-Tissue Expression (GTEx) oraz bazy danych TCGA, CGGA za udostępnienie dostępnych danych. Prace te były wspierane przez Prowincjonalny Projekt Technologii Zdrowotnej Fujian (2024GG01010154) oraz Projekt Wspinaczki na stanowisko doktoranckie w szpitalu Zhangzhou (PDA202306). Fundator zapewnił środki na nasze badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do apoptozy Annexin V-PI  Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USANAWykorzystywane do oceny apoptozy
Zestaw apoptozy AnnexinV-PIPołudniowa Biotechnologia10010-02Wykorzystywany do oceny apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.
Anty-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-β-aktynaAbcamab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227Przeciwciała używane do analizy szlaków sygnalizacji Western Blot.
BiocManagerCRAN1.30.25Instaluj i zarządzaj pakietami Bioconductor w R ≥ 3.6.
Bio-Rad Cfx96 SystemBioconductor1.5.1Programowy dostęp do białka STRING– Interakcje białkowe.
CaretCRAN0.4Zależność od czasu ROC/AUC dla modeli przetrwania.
Chiński atlas genomu glejaka (CGGA)NACGGA693 i CGGA325 Wykorzystywane do konstrukcjonowania i walidacji modeli
ClusterprofilerBioconductor2.18.0Analizować pliki MAF; obliczaj obciążenie mutacyjne guza (TMB) i krajobraz mutacji.
CorrplotCRAN3.5.0Ogólne wykresy (wykresy pudełkowe, wykresy skrzypiec, rozrzut, linie trendu).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC do stopniowego wyboru modelu Coxa.
Data.TabelaCRANreadr2.1.5Szybkie odczytywanie plików z delimitacją; solidne prowadzenie UTF-8.
DawkaBioconductor3.17.0Adnotacje genów ludzkich (Entrez, Ensembl, SYMBOL mappings).
Dynamiczny cięcie drzewaCRAN1.73Analiza sieci współekspresji genów ważonych; wybierz SoftThreshold, TOM, wykrywanie modułów.
EdgerBioconductor3.56.2Ekspresja różniczkowa (modele voom/liniowe); Wilcoxon/empirical Bayes; Wyjścia wulkanów/mapy cieplnej.
EnrichplotBioconductor3.26.2Wzbogacenie ontologii chorób i pomocniki GSEA (używane z clusterProfilerem).
FlashclustCRAN1.63-1Adaptacyjne cięcie gałęzi do wykrywania modułów WGCNA.
GbmCRAN1.12Nadzorowane główne komponenty analizy przeżycia.
Omnibus ekspresji genów (GEO)NAGSE43378Wykorzystywane do konstrukcjonowania i walidacji modeli
GEOqueryBioconductorNAPobierz i analizuj zbiory danych GEO.
Ggplot2CRAN1.0.12Gotowe do publikacji mapy ciepła sygnatur wyrazów.
GlmnetCRAN3.3.1Losowy las przetrwania dla właściwie ocenzurowanych wyników.
Przeciwciała przeciwprzeciwkowe przeciw królikom znakowane peroksydazą chrzanowąAbcamab6721Przeciwciała wtórne do wykrywania w Western Blot.
Linie komórkowe glejaka ludzkiego (SHG44, U251, A172, T98G)Amerykańska Kolekcja Kultury TkankowejNALinie komórkowe ludzkiego glejaka do badań nad glejakami. Komórki hodowano w DMEM + 10% FBS, 2 mM L-glutaminy.
IgraphCRAN10.0.1Dostęp do zestawów genów MSigDB (np. metabolicznych MRG); wygodne, uporządkowane ramy.
Oprogramowanie Image J  Media Cybernetics, USA152Wykorzystywane do wizualizacji
Wektor lentiwirusowy kodujący lncRNA-IRAINGeneChem, Szanghaj, Chiny  NAWektory lentiwirusowe używane do transfekcji glejaka i komórek HEB w celu ustanowienia stabilnych klonów.
LimmaBioconductor3.48.0Korekcja wsadowa (ComBat) i analiza zmiennych zastępczych.
MaftoolsBioconductor1.52.0Harrell' s concordance index (C index) oraz narzędzia do porównywania przetrwania.
MasaCRAN4.1-8Kary modele Cox: lasso, grzbiet i siatka elastiska.
MsigdbrCRAN0.0.5Metody wektorów wektorowych wspierają dane przetrwania.
MTTSigma-AldrichM2128Wykorzystywane do testów proliferacji komórek.
Prawidłowe komórki glejowe (HEB)Amerykańska Kolekcja Kultury TkankowejNAPrawidłowa ludzka linia komórek glejowa do badań porównawczych. Hodowlane w DMEM + 10% FBS.
Org.Hs.Eg.DbBioconductor4.8.3Wzbogacanie GO/KEGG i GSEA; obsługuje wiele typów ID.
PheatmapCRAN2.0.0Gramatyka data science; zawiera Dplyr, Tidyr, Purrr, GgPlot2 do zarządzania i planowania.
PlsrcoxCRAN1.5Boosting oparty na prawdopodobieństwie dla modeli Coxa.
Membrany PVDFMilliporeIPVH00010Błony używane do transferu białek po SDS-PAGE.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Zunifikowane próbkowanie (w tym LOOCV), siatki strojenia i modelowanie potoków.
ReadrCRANNAPobieraj macierze/fenotypy z UCSC Xena (np. huby TCGA/GTEx).
SDS-Page Gel (12%)Bio-Rad185-5096System stosowany do ilościowego PCR.
StringdbBioconductor1.20.3Wizualizacja wyników wzbogacania (wykres kropkowy, cnetplot, wykres grzbietowy).
SuperpcCRAN1.7.7Regresja najmniejszych kwadratów częściowych dostosowana do modeli Coxa.
SurvcompBioconductor3.42.4Liczy normalizację i estymację dyspersji, gdy jest potrzebna (opcjonalnie, uzupełnia limma voom).
PrzetrwanieCRAN1.01-2Szybkie hierarchiczne klasteryzowanie używane przez WGCNA (opcjonalne).
SurvivalsvmCRAN2.2.2Uogólnione modelowanie regresji z wzmocnieniem (gradient boosting).
SurvminerCRAN3.8-3Modele ryzyka proporcjonalnego Coxa; Kaplan– Meier curves.
TCGAbiolinksBioconductorT9039Programowy dostęp do danych TCGA; Pobieraj/przygotowuj dane dotyczące ekspresji i klinicznych.
Program Atlasu Genomu Raka (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM i 534 LGGWykorzystywane do konstrukcjonowania i walidacji modeli
TidyverseCRAN1.17.6Wysokowydajna manipulacja danymi dla dużych macierzy/tabel.
TimerocCRAN0.5.0Wizualizacja KM i renderowanie tabel ryzyka.
TRIzolInvitrogen15596026Odczynnik do ekstrakcji RNA z komórek.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Wykorzystywane do konstrukcjonowania i walidacji modeli
UcscxenatoolsBio-Rad4561044Wykorzystywany do separacji białek w analizie Western Blot.
WGCNACRAN0.95Macierze korelacji dla genów punktów kontrolnych i zależności cech.

Bibliografia

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunometabolizm glejak wsygnatura prognostycznawa ona wsp ekspresja gen wmodele uczenia maszynowegomikro rodowisko guzaunikanie odpowiedzi immunologicznej

Powiązane artykuły