Przedstawiamy protokół integrujący multiomikę Mendelowską randomizację, transkryptomikę pojedynczych komórek oraz przesiewowe badania in silico oparte na strukturze, aby systematycznie wyznaczyć oś Drebrin Like (DBNL)-makrofag w niewydolności serca. Zalecamy DBNL jako lek podatny na cel immunometiczny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Molekularne mechanizmy DBNL w niewydolności serca: od immunometabolizmu makrofagów do implikacji terapeutycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niewydolność serca (HF) pozostaje poważnym globalnym wyzwaniem zdrowotnym, a skuteczne leczenie jest ograniczone i dotyczy jej podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W tym badaniu zastosowano zintegrowane podejście multiomiczne łączące randomizację mendelowską (MR) i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) do identyfikacji potencjalnych biomarkerów i celów terapeutycznych dla HF. Wykorzystaliśmy dane z badań asocjacyjnych na poziomie genomu (GWAS), loci cech ilościowych ekspresji (eQTL), lokusów ilościowych metylacji (mQTLs) oraz lokusów ilościowych białek (pQTL) do badania mechanizmów genetycznych HF. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek przeprowadzono w celu analizy ekspresji genów w makrofagach serca, a analizę pseudoczasu zastosowano do badania dynamicznej regulacji DBNL podczas różnicowania makrofagów. Symulacje dokowania molekularnego i dynamiki zidentyfikowały kwas piriniksowy (WY-14643; PubChem CID: 4594; synonimy: 50892-23-4; WY-14643) jako potencjalnego regulatora DBNL. Analiza multiomiki wykazała, że DBNL (podobny do Drebrina) jest kluczowym genem związanym z ryzykiem HF. Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA wykazało, że DBNL jest eksprimowany głównie w makrofagach sercowych i jest zwiększany w warunkach patologicznych. Ekspresja DBNL przez makrofagi wiąże się z metabolizmem odpornościowym i szlakami profibrotycznymi, szczególnie szlakami sygnalizacyjnymi IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR i TGF-β. Analiza pseudoczasu wykazała, że DBNL ma dynamiczny wpływ regulacyjny na różnicowanie makrofagów, zwłaszcza w przewlekłym stanie zapalnym. Molekularne dokowanie i symulacje dynamiczne wykazały, że kwas pirydynowy odgrywa potencjalną rolę w regulacji DBNL. Badanie to wyjaśnia rolę DBNL w postępie niewydolności serca i sugeruje jego potencjał jako celu terapeutycznego. Co istotne, znaczenie terapeutyczne wynika z przewidywań obliczeniowych. Te odkrycia dostarczają nowatorskich wglądów w metabolizm odpornościowy oraz komunikację międzykomórkową pośredniczoną przez makrofagi, tworząc teoretyczne podstawy dla przyszłych zastosowań w optymalizacji leków ukierunkowanych na DBNL oraz badań funkcjonalnych. Niemniej jednak potrzebne są dodatkowe badania eksperymentalne i badania przedkliniczne, aby potwierdzić skuteczność kliniczną DBNL jako celu terapeutycznego.
Wprowadzenie
Niewydolność serca (HF) stanowi istotne i rosnące globalne wyzwanie zdrowotne, które dotyka miliony osób na całym świecie i wywiera znaczne obciążenie ekonomiczne na systemy opieki zdrowotnej1. W związku z tym istnieje pilna potrzeba skutecznych interwencji w leczeniu niewydolności serca (HF).
Złożona patofizjologia niewydolności serca wynika z upośledzonej kurczliwości mięśnia sercowego lewej komory, prowadząc do kaskady powikłań ogólnoustrojowych, takich jak zatkanie płuc i obwodów2. Jednak bezpośrednie zajęcie się fundamentalnymi mechanizmami patofizjologicznymi, które leżą u podstaw postępu niewydolności serca, szczególnie niekorzystnej remodelacji mięśnia sercowego, pozostaje kluczowym i niespełnionym wyzwaniem3. W ostatnich dekadach dziedzina badań biomedycznych przeszła znaczącą zmianę paradygmatu, głównie dzięki włączeniu technologii multiomiki oraz zaawansowanych metod bioinformatycznych. Narzędzia te oferują wyjątkowe możliwości identyfikacji nowych biomarkerów chorób i celów terapeutycznych. Randomizacja mendelowska (MR), rygorystyczne podejście genetyczne epidemiologiczne, wykorzystuje polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) jako zmienne instrumentalne do wnioskowania o związku przyczynowym między ekspozycją genetyczną a wynikami klinicznymi4. Przyjmując ramy metodologiczne randomizowanych badań kontrolowanych, randomizacja mendelowska (MR) skutecznie rozwiązuje problemy zakłóceń i odwrotnej przyczynowości, dostarczając solidnych dowodów na identyfikację i ponowne wykorzystanie celów lekowych. Równolegle, sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) ujawnia heterogeniczność tkanek z niespotykaną rozdzielczością, dostarczając głębokich informacji na temat ekspresji genów specyficznych dla typu komórek oraz sieci komunikacji międzykomórkowej w złożonych organach, takichjak serce5. Podejście multiomiczne, które syntetyzuje dane genetyczne, transkryptomiczne i proteomiczne, oferuje znaczący potencjał w wyjaśnianiu mechanizmów chorób i identyfikacji szlaków terapeutycznych.
Pomimo tych postępów technologicznych, istnieją istotne luki w wiedzy dotyczące specyficznych mechanizmów komórkowych i molekularnych napędzających stany zapalne serca oraz przebudowy w niewydolności serca. Rosnące dowody sugerują, że komórki odpornościowe, szczególnie makrofagi, są kluczowe dla koordynacji odpowiedzi zapalnych i późniejszej przebudowy tkanek podczas urazów mięśnia sercowego i przewlekłej niewydolności serca, które z kolei są kluczowe dla postępu choroby6. Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na szerokich mediatorach zapalnych lub markerach powierzchni komórek, co skutkowało znaczącą luką w badaniu wewnątrzkomórkowych celów regulacyjnych w tych kluczowych populacjach komórek odpornościowych. Dodatkowo, chociaż tradycyjne badania asocjacyjne obejmujące cały genom (GWAS) zidentyfikowały liczne genetyczne powiązania związane z niewydolnością serca, często napotykają trudności w ustalaniu jednoznacznych związków przyczynowych, co ogranicza ich zastosowanie do bezpośredniego terapeutycznego tłumaczenia7. W związku z tym wdrożenie kompleksowego multiomicznego frameworka randomizacji mendelowskiej (MR), który obejmuje warianty genetyczne wpływające na metylację DNA (mQTL), ekspresję genów (eQTL) oraz obfitość białek (pQTL), jest niezbędne do uzyskania bardziej solidnych wniosków przyczynowych na wielu biologicznych warstwach regulacyjnych. Takie podejście rozwiązuje inherentne ograniczenia związane z badaniami QTL w jednej warstwie. Warto zauważyć, że białko podobne do Drebrinu (DBNL) było przedmiotem szeroko zakrojonych badań w kontekście rozwoju neuronów i dynamiki cytoszkieletu8; Jednak jego funkcjonalne znaczenie i potencjał terapeutyczny w chorobach sercowo-naczyniowych, szczególnie niewydolności serca, pozostają w dużej mierze niezbadane. Ta znacząca luka w naszym rozumieniu utrudnia rozważenie DBNL jako nowego i potencjalnie realnego celu rozwoju leków w leczeniu niewydolności serca.
Aby załagodzić te kluczowe luki w wiedzy, celem tego badania jest solidna identyfikacja kluczowych genów przyczynowo związanych z ryzykiem niewydolności serca poprzez zintegrowany multiomiczny framework MR łączący dane eQTL, mQTL i pQTL. Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście polegające na integracji multiomicznych analiz randomizacji mendelowskiej — w tym loci cech ilościowych ekspresji (eQTL), lokusów ilościowych metylacji (mQTL) oraz lokusów ilościowych białek (pQTL) — z wysokorozdzielczymi danymi transkryptomicznymi pojedynczych komórek (GSE161470) oraz danymi transkryptomicznymi objętymi (GSE161472), aby systematycznie zidentyfikować gen DBNL jako kluczowy czynnik ryzyka niewydolności serca. Wyniki te pokazują, że DBNL jest głównie i specyficznie wyrażany w makrofagach sercowych oraz że jego ekspresja zmienia się dynamicznie w trakcie procesu różnicowania. Ponadto wyniki tego badania wyjaśniają kluczową rolę DBNL w modulacji mikrośrodowiska układu odpornościowego serca oraz koordynacji szlaków immunometlicznych związanych z niewydolnością serca, takich jak kaskada sygnalizacji IL-6/JAK/STAT3, a także szlaków sygnalizacji profibrotycznych. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu technik biologii obliczeniowej, badania te przewidują, że kwas pirydylowy (WY-14643) jest ligandem o wysokiej afinitecie dla DBNL, co zapewnia kompleksowe, wielowymiarowe ramy teoretyczne, które wspierają uznanie DBNL za nowy cel terapeutyczny w leczeniu niewydolności serca i ułatwiają rozwój ukierunkowanych interwencji farmakologicznych. Za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek scharakteryzowaliśmy specyficzną dla komórek ekspresję i szlaki funkcjonalne kluczowego genu DBNL zidentyfikowanego w mikrośrodowisku serca oraz badaliśmy rolę DBNL w szlakach sygnalizacji immunometlicznej i profibrotycznej, a także w komunikacji między komórkami między typami komórek serca. Potencjalne ligandy małocząsteczkowe dla DBNL zostały zidentyfikowane dzięki obliczeniowym dokowaniu molekularnym i symulacjom dynamiki molekularnej. Hipotezujemy, że DBNL, który jest wyrażany głównie w makrofagach sercowych, wywiera przyczynowy wpływ na postęp niewydolności serca poprzez regulację szlaków immunometlicznych i międzykomórkowych przesłuchów. Podsumowując, integrując zaawansowaną multiomikę randomizację mendelowską z wysokorozdzielczą analizą pojedynczych komórek, systematycznie zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy nowe terapeutyczne cele niewydolności serca oraz badaliśmy potencjalne cele modulatorów małych cząsteczek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie danych
Dane ekspresji genów
Dane dotyczące sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) wykorzystane w niniejszym badaniu pochodzą z repozytorium Gene Expression Omnibus (GEO) utrzymywanego przez National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), a konkretnie z zestawu danych o numerze9 GSE161470 (ludzka tkanka sercowa składająca się z czterech próbek kontrolnych i jednego preparatu patologicznego). Ten zbiór danych został pierwotnie opublikowany przez Zhang i in. w 2022 roku10. Głównym celem pierwotnego badania było zbadanie heterogeniczności komórkowej oraz molekularnych mechanizmów regulacji w ludzkiej tkance sercowej w warunkach niewydolności serca. Do obecnej analizy wybrano pięć próbek z tego zbioru danych, z których każda zawiera kompleksowe profile ekspresji pojedynczych komórek pochodzące z ludzkiej tkanki serca. Pozostałe dane wykorzystane w tym badaniu również pochodzą z publicznego repozytorium NCBI GEO, a konkretnie z pliku Series Matrix odpowiadającego numerowi przystąpienia GSE161472, wraz z plikiem adnotacji GPL11154. Profil ekspresji obejmuje łącznie 84 próbki, w tym 37 próbek kontrolnych i 47 próbek chorobowych. Badania te obejmują integratywną analizę multiomiczną, przy czym wszystkie badania prowadzone są na podstawie danych dostępnych publicznie.
dane eQTL
Dane eQTL, uzyskane od konsorcjum eQTLGen, koncentrują się na wyjaśnieniu genetycznych ram ekspresji genów we krwi oraz czynników genetycznych wpływających na cechy złożone3. Konsorcjum obecnie prowadzi drugą fazę swojego szeroko zakrojonego projektu, realizując metaanalizy danych obejmujących cały genom dotyczące ekspresji genów we krwi.
Dane ekspozycji - mQTLs
Dane mQTL pochodzą z opublikowanej metaanalizy europejskiej (EUR) kohorty, która bada metylację DNA pełnej krwi w ramach genetycznych 3 701 próbek z populacji europejskiego pochodzenia11. Zbiór danych zawierał informacje o 426 636 cechach mQTL.
Dane ekspozycji – pQTL
Dane pQTL plazmy zostały pobrane z bazy danych deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. Badanie to wykorzystało dane opublikowane w 2021 roku z zestawu danych deCODE pQTL, obejmujące badanie genomowe (GWAS) poziomów białek w osoczu mierzonych przy użyciu 4 907 aptamerów w kohorcie 35 559 osób pochodzenia europejskiego.
Dane dotyczące wyników
Podsumowanie statystyk dotyczących niewydolności serca pozyskano z szeroko zakrojonego badania asocjacyjnego (GWAS), głównie obejmującego uczestników pochodzenia europejskiego, dostępnego w bazie danych Europejskiego Instytutu Bioinformatyki (EBI) (GCST90162626). Zestaw danych o niewydolności serca obejmował 115 150 przypadków i 1 550 331 kontrolnych. Katalog GWAS, który obejmuje publikacje, wiodące stowarzyszenia oraz szczegółowe statystyki podsumowujące, obecnie oferuje dane mapowane na Genome Assembly i dbSNP Build.
Analiza randomizacji mendelowskiej mQTL, eQTL i pQTL
Aby systematycznie zbadać potencjalne związki przyczynowe między ekspresją genów, obfitością białek, poziomem metylacji DNA oraz ryzykiem niewydolności serca, przeprowadzono analizy randomizacji Mendla (MR) z wykorzystaniem ilościowych loci cech ekspresji (eQTL), białkowych ilościowych loci cech (pQTL) oraz mQTL (mQTL). Podczas fazy wstępnego przetwarzania danych ekspozycji z odpowiednimi bazami danych o pojedynczym nukleotydzie (SNP) powiązane z każdą zmienną ekspozycji (gen, białko lub miejsce metylacji) były wyodrębniane z odpowiednich baz danych z progiem istotności dla całego genomu P < 1 × 10⁻⁵, aby służyć jako początkowe kandydaty zmienne instrumentalne (IV). Następnie przeprowadzono zgrupowanie nierównowagi sprzężenia (LD) dla IV każdego czynnika ekspozycji, używając okna o wielkości 10 000 kilobaz (kb) i progu LD R² 0,001, aby zapewnić niezależność między instrumentami. Wybrane dożylne dożylności zostały następnie zharmonizowane ze statystykami podsumowanymi z badania asocjacji genomu niewydolności serca (GWAS; ID: GCST90162626) poprzez zastosowanie funkcji read_outcome_data, zachowując tylko te SNP, które wykazują wartość P powiązania poniżej 5×10⁻⁵ w zbiorze danych. Aby zminimalizować słabe błędy instrumentów, statystyka F dla każdego IV została obliczona jako F = (β_exposure/SE_exposure)², a w kolejnych analizach uwzględniono tylko instrumenty z F > 10. Do szacowania efektu przyczynowego wykonano wyrównanie alleli między zestawami danych ekspozycji a wyników za pomocą funkcji harmonize_data z pakietu TwoSampleMR. Następnie przeprowadzono analizy MR z wykorzystaniem czterech uzupełniających się metod statystycznych: (1) metody odwrotnej wariancji ważonej (IVW), która dostarcza metaanalizy szacunków współczynnika Walda między SNP; (2) regresję MR-Eggera, która uwzględnia kierunkową plejotropię poprzez uwzględnienie wyrazu przecięjącego w ramach założenia Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE); (3) metoda ważonej mediany, która daje spójne oszacowania przyczynowe nawet jeśli do 50% instrumentów jest nieprawidłowych; oraz (4) metoda ważonego trybu, która identyfikuje najczęściej spotykany klaster szacowania efektu przyczynowego, oferując zwiększoną moc statystyczną i zmniejszony błąd typu I w porównaniu do MR-Egger. W przypadkach, gdy dostępna była tylko jedna zmienna instrumentalna, stosowano wyłącznie metodę stosunku Walda. Aby ocenić wiarygodność wyników, przeprowadzono kompleksowe analizy wrażliwości, w tym testy heterogeniczności za pomocą funkcji mr_heterogeneity, ocenę plejotropii z użyciem mr_pleiotropy_test oraz analizy typu leave-one-out realizowane przez funkcję mr_leaveoneout, która iteracyjny wyklucza każdy SNP, aby określić wpływ poszczególnych wariantów na ogólne wyniki. Znaczące powiązania zostały zwizualizowane za pomocą narzędzi graficznych, takich jak mr_scatter_plot i mr_forest_plot. Ten analityczny pipeline został jednolicie stosowany we wszystkich zbiorach danych eQTL, pQTL i mQTL, aby zachować spójność metodologiczną przez cały proces.
Analiza kolokalizacji
Analiza kolokalizacji została przeprowadzona metodą Coloc, podsumowanymi danymi eQTL oraz GWAS niewydolności serca5. Do obliczenia prawdopodobieństwa posteriornego w oknie zgrupowania 100 kb wykorzystano polimorfizm indeksowy pojedynczych nukleotydów (SNP). W analizie kolokalizacji (coloc) hipoteza H3 oznacza prawdopodobieństwo tylne, że dwie cechy, czyli ekspresja genów i niewydolność serca, są skorelowane, ale posiadają odrębne warianty przyczynowe. Natomiast hipoteza H4 wskazuje na posteriorne prawdopodobieństwo, że związek między tymi dwoma cechami wynika z jednego, wspólnego wariantu przyczynowego. Próg SNP. PP. Do określenia kolokalizacji użyto H4 większego niż 0,90.
Infiltracja immunologiczna
Metoda CIBERSORT to szeroko stosowana technika oceny typów komórek odpornościowych w mikrośrodowisku12. Korzystając z zasad regresji wektorów wsparcia, można przeprowadzić analizę dekonwolucyjną macierzy ekspresji podtypów komórek odpornościowych. Dzięki wdrożeniu 547 biomarkerów, CIBERSORT może różnicować 22 fenotypy ludzkich komórek odpornościowych, w tym limfocyty T, B, plazmatu oraz różne podpopulacje komórek szpikowych. Wykorzystując GSE161472 zbiór danych, przeprowadzono analizę z wykorzystaniem algorytmu CIBERSORT w połączeniu z jego zintegrowaną matrycą sygnatur LM22, która charakteryzuje profile ekspresji genów 22 różnych typów ludzkich komórek odpornościowych. Poziomy infiltracji tych 22 populacji komórek odpornościowych zostały ilościowo określone dla każdej pojedynczej próbki. Następnie zastosowano funkcję cor.test, aby ocenić korelacje między ekspresją kluczowych genów a odpowiadającym im poziomem infiltracji komórek odpornościowych.
Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, przetwarzanie danych i kontrola jakości
Dane profilu ekspresji pojedynczej komórki były przetwarzane za pomocą pakietu Seurat (V4.3.0) w środowisku R (V4.3.0)6. Badanie to wykorzystało konwencjonalny sposób pracy do analizy danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Początkowo profile wyrażeń były importowane za pomocą pakietu Seurat. Komórki były filtrowane na podstawie kilku wskaźników jakości, w tym całkowitej liczby UMI każdej komórki, liczby ekspresyjnych genów, proporcji odczytów mitochondrialnych oraz proporcji odczytów rybosomalnych. Wartości odstające zostały zidentyfikowane jako wartości odchylające od mediany o więcej niż trzy mediany odchyleń bezwzględnych (MAD). Konkretne progi filtracji były następujące: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 oraz nCount_RNA ≤ 5194,27. Zazwyczaj komórki wykazujące nadmiernie wysoką całkowitą liczbę UMI i ekspresyjną liczbę genów klasyfikowano jako dublety, podczas gdy komórki o podwyższonym odsetku odczytów mitochondrialnych lub rybosomalnych uważano za niskiej jakości, potencjalnie podlegające apoptozie lub fragmentacji. Po tych etapach filtrowania zastosowano DoubletFinder (wersja 2.0.4) do identyfikacji i usunięcia dubletów z każdej próbki osobno, kończąc proces kontroli jakości komórek. Początkowo normalizacja danych była przeprowadzana za pomocą funkcji normalizeData. Status cyklu komórkowego został następnie oceniony za pomocą funkcji CellCycleScoring, a geny o wysokiej zmienności zidentyfikowano metodą FindVariableFeatures. Zbiór danych został następnie skalowany za pomocą ScaleData, aby ustandaryzować dane i złagodzić wpływ genów mitochondrialnych, genów rybosomalnych oraz wpływu cyklu komórkowego na dalsze analizy. Redukcja wymiarowości liniowej została przeprowadzona za pomocą analizy głównych składowych (PCA) za pomocą funkcji RunPCA, przy czym wybrano istotne główne składniki do dalszej analizy. Aby rozwiązać efekty wsadowe na różnych próbkach, zastosowano algorytm Harmony (wersja 1.1.0). To podejście iteracyjnie klastruje podobne komórki z różnych partii w przestrzeni PCA, zachowując jednocześnie różnorodność partii w obrębie klastrów. Biorąc pod uwagę stosunkowo łagodne efekty partiowe obserwowane w zbiorze danych, zastosowano domyślne parametry (θ = 2). Następnie przeprowadzono redukcję nieliniowej wymiarowości za pomocą RunUMAP, a następnie skonstruowano graf otoczenia komórek za pomocą FindNeighbors oraz klastrowanie komórek za pomocą FindClusters. Dla adnotacji typów komórek zaimplementowano hierarchiczny framework adnotacji: podstawowa ręczna adnotacja opierała się na charakterystycznych wzorcach ekspresji genów opartych na bazie danych CellMarker oraz odpowiedniej literaturze; uzupełnione były wyniki automatycznych adnotacji uzyskane z oprogramowania SingleR jako punkt odniesienia. Aby jeszcze bardziej zwiększyć dokładność i kompleksowość identyfikacji typów komórek, skonsultowano się z wieloma autorytatywnymi bazami danych, w tym Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell oraz NovershternHaematopoietic. Adnotacja komórek była przeprowadzana poprzez zapytania do bazy danych CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) i przeglądanie literatury, wspierane przez automatyczne wsparcie adnotacji oferowane przez oprogramowanie SingleR (V2.4.0)13. Celem jest identyfikacja typów komórek obecnych w odpowiadającej tkance oraz ich powiązanych genów markerowych14.
Analiza interakcji ligand-receptor
W tym badaniu CellCall (wersja 1.0.7) została wykorzystana do kompleksowej analizy sieci komunikacji międzykomórkowej15. Wykorzystując adnotacje typu komórek pochodzące z Seurat obok surowej macierzy liczby, skonstruowano znormalizowany obiekt analizy z parametrami skonfigurowanymi dla ludzkiego genomu. Funkcja TransCommuProfile została zastosowana do ilościowego określenia siły interakcji komórka-komórka za pomocą algorytmu ważonego, implementując próg istotności wartości p < 0,05 w celu identyfikacji wiarygodnych par ligand-receptor. Znaczące pary interakcji zostały następnie poddane analizie wzbogacenia szlaków KEGG za pomocą funkcji getHyperPathway, a relacje między typami komórek i szlakami zilustrowano za pomocą wykresów bąbelkowych. Ogólna sieć komunikacyjna została ostatecznie zobrazowana za pomocą okrągłego wykresu, w którym osiem wyraźnych kolorów oznaczało różne typy komórek. Siła oddziaływania i kierunkowość były reprezentowane przez rysy strzałkowe, co dostarczało szczegółowej charakterystyki dynamiki sygnalizacji międzykomórkowej.
Analiza pseudoczasu
Aby zbadać dynamiczną regulację transkrypcyjną makrofagów w trakcie postępu niewydolności serca, badanie to wykorzystało algorytm Monocle do analizy pseudoczasu subpopulacji makrofagów. Macierz ekspresji genów odpowiadająca podpopulacjom komórek docelowych została wyodrębniona, aby skonstruować obiekty analizy trajektorii pojedynczych komórek, z genami o wysokiej zmienności wybranymi jako cechy porządkowe. Stosując technikę redukcji wymiarowości DDRTree, komórki zostały odwzorowane na przestrzeni dwuwymiarowej, aby odtworzyć trajektorię różnicowania. Przeprowadzono analizy wizualizacyjne, aby określić rozkład komórek wzdłuż osi pseudoczasu oraz zidentyfikować geny, których ekspresja zmieniała się istotnie w czasie pseudo-czasu. Kolejne analizy koncentrowały się na kluczowym genie DBNL i charakteryzowały jego dynamikę ekspresji wzdłuż trajektorii komórkowej, wyjaśniając mechanizmy transkrypcyjnego przeprogramowania makrofagów podczas progresji niewydolności serca16.
Analiza wzbogacania zbiorów genów (GSEA)
W tym badaniu zastosowano podejście GSEA, aby wyjaśnić mechanizmy regulacyjne związane z kluczowymi genami zaangażowanymi w niewydolność serca. Wykorzystując wcześniej zidentyfikowane kluczowe geny, próbki zostały podzielone na kohorty o wysokiej i niskiej ekspresji na podstawie wartości mediany ekspresji. Analiza różnicowej ekspresji przeprowadzono przy użyciu pakietu limma, generując uporządkowaną listę genów według log fold change (logFC). Kolejna analiza wzbogacenia szlaków KEGG została przeprowadzona za pomocą narzędzia clusterProfiler, a zestawy genów pochodzące z bazy danych MsigDB służyły jako tło referencyjne. Następnie zastosowano algorytm GSEA do identyfikacji szlaków sygnalizacyjnych, które były istotnie wzbogacone między tymi dwoma grupami ekspresji, a do określenia istotności statystycznej użyto skorygowanego progu wartości p poniżej 0,05. Aby zilustrować funkcje regulacyjne genów podstawowych w kluczowych szlakach, zastosowano różne techniki wizualizacyjne, w tym wykresy GSEA wieloszlakowych oraz diagramy sieci kołowych.
Analiza zmienności zbioru genów (GSVA)
GSVA to nieparametryczne, nienadzorowane podejście stosowane do oceny wzbogacenia zestawu genów w danych transkryptomicznych. Metoda ta przekształca wariacje na poziomie genu w warianty na poziomie szlaku poprzez obliczanie wyników złożonych dla konkretnych zestawów genów, ułatwiając ocenę biologicznych zmian funkcjonalnych w różnych próbkach. W niniejszym badaniu zestawy genów pochodziły z bazy danych sygnatur molekularnych. Algorytm GSVA został wykorzystany do obliczania wyników złożonych dla każdego zestawu genów, umożliwiając ocenę potencjalnych biologicznych zmian funkcjonalnych w różnych próbkach. Wyniki analizy wzbogacenia GSVA są przedstawione w materiałach uzupełniających (Tabela Uzupełniająca 1).
Przewidywanie leków na CTD
Gen docelowy (DBNL) został wprowadzony do pola wyszukiwania Comparative Toxicogenomics Database (CTD), wybrano kategorię choroby "choroba sercowo-naczyniowa" i wykonano zapytanie w celu uzyskania danych predykcyjnych dotyczących leków związanych ze schorzeniem "niewydolność serca". Uzyskane wyniki prognoz zostały następnie zaimportowane do oprogramowania Cytoscape, aby ułatwić wizualizację danych i umożliwić budowę mapy sieci interakcji gene-chemikalium.
Metody dokowania molekularnego
Ze względu na nierozszyfrowaną trójwymiarową strukturę krystaliczną ludzkiego białka DBNL (UniProt ID: Q9UJU6), badanie to przewidziało trójwymiarową strukturę DBNL na podstawie AlphaFold317. Kwas piriniksowy (WY-14643) jest dostępny do pobrania z bazy danych PubChem (PubChem CID: 5694). Następnie struktura białka była wstępnie przetwarzana za pomocą oprogramowania MGLTools (wersja 1.5.7)18, w tym etapy takie jak dodawanie atomów wodoru. Jednocześnie białka i małe cząsteczki były przekształcane w format PDBQT wymagany do dokowania. Oprogramowanie AutoDock Vina (wersja 1.1.2)19 było używane do globalnego dokowania molekularnego (egzogeniczność=16, num_modes=30) w celu badania potencjalnych trybów wiązania. Po zakończeniu obliczeń dokowania należy wybrać złożoną konformację o najwyższym powinowactwie, wskazaną przez najniższą wolną energię wiązania, jako strukturę początkową do kolejnych symulacji dynamiki molekularnej.
Metoda symulacji dynamiki molekularnej
Aby systematycznie zbadać stabilność wiązania i mechanizmy interakcji między związkami kandydatami a białkami, przeprowadzono konwencjonalne symulacje dynamiki molekularnej (MD) z wykorzystaniem pakietu oprogramowania GROMACS (wersja 2024.03)20. Parametry białka zostały wygenerowane za pomocą pola siłowego Amber14SB21, model cząsteczek wody za pomocą modelu TIP3P22, a parametry topologii ligandów za pomocą narzędzia Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), opartego na General Amber Force Field (GAFF). System kompleksu ligand-białko został następnie umieszczony w okresowym ośmiościanowym pudełku granicznym wypełnionym cząsteczkami wody TIP3P. Wprowadzono jony sodu (Na⁺) i chlorku (Cl⁻), aby osiągnąć stężenie 0,15 mol/L i zneutralizować ogólny ładunek układu. Po zakończeniu budowy systemu pierwszym krokiem było zminimalizowanie energii przy użyciu metody najstromszego opadu na 50 000 kroków, aby wyeliminować potencjalnie nierozsądne konformacje w konstrukcji. Następnie przeprowadzono dwa etapy równowagi układu: symulację NVT o częstotliwości 100 ps (stała liczba cząstek, objętość i temperaturę), a następnie symulację 100 ps NPT (stała liczba cząstek, ciśnienie i temperatura). Podczas tych symulacji zastosowano ograniczenia pozycyjne do ciężkich atomów szkieletu białka, aby zachować integralność strukturalną białka. Temperatura była utrzymywana na poziomie 300 K za pomocą termostatu V-rescale, a ciśnienie regulowano do 1 bara za pomocą barostatu Parrinello-Rahmana do sprzężenia ciśnieniowego. Po zakończeniu fazy równowagi przeprowadzono symulację fazy produkcyjnej trwającą 100 nanosekund, podczas której eliminowano wszelkie ograniczenia pozycyjne. Trajektoria została zintegrowana za pomocą kroku czasowego 2 femtosekundy, a do precyzyjnego zarządzania interakcjami elektrostatycznymi na duże odległości zastosowano metodę Ewalda (particle-mesh) (PME). Trajektoria była zapisywana co 10 ps, a łącznie wychodziło 10000 klatek do dalszej analizy. Ponadto z symulacji wyodrębniono stabilne trajektorie w przedziale 90-100 ns, a energia wolna wiązania kompleksów białek ligandowych została obliczona za pomocą narzędzia gmx MMPBSA23.
Analiza statystyczna
Ważność tej analizy randomizacji mendelowskiej (MR) zależy od trzech podstawowych założeń. (1) Istotność: Zmienne instrumentalne (IV) muszą wykazywać silne powiązanie z ekspozycją. (2) Niezależność: IV muszą być niezależne od wszelkich czynników zakłócających zarówno ekspozycję, jak i wynik. (3) Ograniczenie wykluczenia: IV powinny wpływać wyłącznie na wynik poprzez swój wpływ na ekspozycję. Naruszenie tego założenia, gdy dożylność wpływa na wynik przez ścieżki niezwiązane z ekspozycją, nazywane jest poziomą plejotropią. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w wersji R 4.3.0, z testami dwustronnymi, a wartość p poniżej 0,05 była zazwyczaj uznawana za istotną istotność statystyczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Identyfikacja DBNL jako genu związanego z ryzykiem niewydolności serca poprzez randomizację i kolokalizację metodą Mendla
Identyfikator wyniku dla próbek związanych z niewydolnością serca, GCST90162626, został pozyskany z zestawu danych statystyk podsumowującej. Związki przyczynowe między 1 247 parami ekspresji, ilościowymi lokusami cech (eQTL) i wynikami zostały określone przy użyciu funkcji extract_instruments i extract_outcome_data (Tabela Uzupełniająca 2). Kolejna analiza randomiz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż stan zapalny stanowi fundamentalny aspekt patofizjologii niewydolności serca (HF), wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na uogólnionych mediatorach zapalnych oraz markerach powierzchniowych komórek 17,18,24. To skupienie ograniczyło wyjaśnienie konkretnych mechanizmów komórkowych, które się z tym angażują. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy podejście integracyjne łączące multiomikę randomizację m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają ze sobą rywalizujących interesów.
Podziękowania
Program badawczy był wspierany przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang (LTGY24H020001), Projekt Nauki i Technologii dotyczący tradycyjnej medycyny chińskiej w prowincji Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), Kluczowy Projekt Dobrobytu Publicznego Ningbo (2024S030), Program R&D Kluczowych Technologii w Ningbo (2022Z149), Kluczowe Laboratorium Medycyny Precyzyjnej w Chorobach Miażdżycowych Prowincji Zhejiang (2022E10026), oraz Specjalny Projekt Funduszu na Badania Kliniczne Stowarzyszenia Medycznego Zhejiang (2021ZYC-A11).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Baza danych CellMarker | Harbiński Uniwersytet Medyczny (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | Baza danych CellMarker; Do zapytywania genów markerów tkanek/typów komórek podczas adnotacji pojedynczych komórek |
| Baza danych Toksykogenomiki Porównawczej (CTD) | CTD (Duke University i in.) | http://ctdbase.org/ | baza danych CTD; Do wykrywania interakcji między substancjami chemicznymi, genami, fenotypami i chorobami, wykorzystywanymi do przewidywania leków |
| Zestaw danych deCODE Plasma pQTL (2021, 4 907 aptamerów, 35 559 próbek europejskich) | genetyka deCODE | https://www.decode.com/summarydata/ | Publikacja danych pQTL 2021; Wykorzystywane jako dane ekspozycji pQTL do analizy MR |
| eQTLGen Whole Blood eQTL Data | eQTLGen Consortium | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen faza I/II (specyficzna wersja według użycia); Wykorzystywane jako dane ekspozycji eQTL do analizy MR i kolokalizacji |
| Jednokomórkowy zestaw danych RNA-seq GSE161470 (Ludzka tkanka sercowa: 4 osoby kontrolne + 1 próbka patologiczna) | Omnibus ekspresji genów NCBI (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470; Uzyskanie danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek tkanki serca ludzkiej do dalszej analizy |
| Katalog GWAS | NHGRI– EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | katalog GWAS; Do pobierania informacji GWAS związanych z HF, adnotacji oraz analiz pomocniczych |
| Podsumowanie niewydolności serca – statystyki GWAS (GCST90162626) | NHGRI– Katalog EBI GWAS | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Dostęp do studiów: GCST90162626; Wykorzystywane jako dane wyników do analizy MR i kolokalizacji |
| Baza danych sygnatur molekularnych (MSigDB) v7.0 | Instytut Broad | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0; Dla zestawów genów tła GSEA / GSVA oraz adnotacji szlaków |
| Dane struktury kwasu pirinixowego (WY-14643) (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID: 5694; Wykorzystywane do uzyskania trójwymiarowej struktury ligandów do symulacji dokowania i dynamiki molekularnej |
| Baza danych białek UniProt (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6) | Konsorcjum UniProt | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt: Q9UJU6; Używany do uzyskania sekwencji aminokwasowej DBNL do przewidywania struktury i dokowania |
| Meta-analiza mQTL pełnej krwi (Ref 11, 3 701 próbek europejskich, 426 636 cech mQTL) | Autorzy / Konsorcjum (według twojego źródła 11) | Oczekuje na dodanie oryginalnego adresu URL / DOI od autora | Odniesienie do DOI lub identyfikatora zestawu danych; Wykorzystywane jako dane ekspozycji mQTL do analizy MR |
Bibliografia
- Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
- Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
- Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
- Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
- Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
- Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
- van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
- Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
- Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
- Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
- Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
- Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
- Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
- Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
- Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
- Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
- Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
- Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
- Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
- Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
- Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
- Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
- Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
- Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
- Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
- Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
