Działanie przeciwzapalne laktonów seskwiterpenowych z Eupatorium lindleyanum DC. w modelach gryzoni

Podsumowanie

Badanie to wykazuje, że laktony seskwiterpenowe z Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) wywierają istotne działanie przeciwzapalne w modelach obrzęku ucha myszy indukowanego ksylenem oraz obrzęku łapy szczurów wywołanych karagenanem, łagodząc uszkodzenia histopatologiczne, ograniczając uwalnianie cytokin oraz hamując aktywację sygnalizacji NF-κB.

Streszczenie

Ostry stan zapalny to fundamentalny proces patologiczny zaangażowany w wiele chorób związanych z układem odpornościowym. Eupatorium lindleyanum DC., tradycyjne zioło lecznicze, jest bogate w seskwiterpeny laktony (SLEL), które wykazują działanie farmakologiczne; jednak ich działanie przeciwzapalne oraz związane z nimi zmiany molekularne pozostają niedo końca scharakteryzowane. W tym badaniu wywołano ostre reakcje zapalne w modelu obrzęku ucha myszy indukowanego ksylenem oraz modelu obrzęku łapy szczura indukowanego karagenem. Uszkodzenia tkanek i infiltracja zapalna oceniano za pomocą barwienia hematoksyliny i eozyny. Poziomy cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-6 i IL-1β) zostały zmierzone w surowicy metodą ELISA, a ich ekspresja transkrypcyjna w tkankach zapalnych została przeanalizowana za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Zmiany w białkach związanych z szlakiem NF-κB, w tym fosforylowanym IκBα i p65, oceniono za pomocą western blottingu. Leczenie SLEL zmniejszyło obrzęk ucha i łap oraz złagodziło cechy histologiczne ostrego stanu zapalnego, w tym obrzęk tkanek, infiltrację komórek zapalnych oraz zatkanie naczyniowe. Równolegle podawanie SLEL wiązało się ze spadkiem poziomu surowicy i ekspresji mRNA tkankowego Tnf-α, Il-6 i Il-1β. Analiza Western blot wykazała obniżoną fosforylację IκBα i p65 w tkankach zapalnych po leczeniu SLEL, co wskazuje na modulację zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z NF-κB. Razem te wyniki pokazują eksperymentalny sposób oceny działania przeciwzapalnego SLEL w modelach ostrego zapalenia i sugerują, że jego efekty wiążą się ze zmniejszoną ekspresją cytokin prozapalnych oraz zmienioną sygnalizacją związaną z szlakiem NF-κB.

Wprowadzenie

Stan zapalny to złożona odpowiedź obronna wywołana przez patogenne naruszenie lub uszkodzenie tkanek i odgrywa kluczową rolę w ograniczaniu infekcji, eliminowaniu szkodliwych bodźców oraz wspieraniu naprawy tkanek¹. Chociaż kontrolowane odpowiedzi zapalne są niezbędne do utrzymania homeostazy tkanek, nadmierne lub utrzymujące się stany zapalne mogą prowadzić do uszkodzenia tkanek, dysfunkcji narządów oraz postępu chorób przewlekłych. Klinicznie stan zapalny charakteryzuje się zaczerwienieniem, obrzękiem, upałem i bólem, a w ciężkich przypadkach może prowadzić do ogólnoustrojowych reakcji patologicznych. Coraz więcej dowodów łączy zaburzenia stanu zapalnego z rozwojem nowotworów, chorób sercowo-naczyniowych i chorób autoimmunologicznych²˒³.

Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są obecnie najczęściej stosowanymi środkami w leczeniu stanu zapalnego. Pomimo skuteczności w łagodzeniu objawów, długotrwałe stosowanie NLPZ często wiąże się z działaniami niepożądanymi, w tym podrażnieniem przewodu pokarmowego, reakcjami nadwrażliwości oraz wątrobą⁴, które ograniczają ich zastosowanie kliniczne. W rezultacie rośnie zainteresowanie identyfikacją alternatywnych środków przeciwzapalnych o lepszym profilu bezpieczeństwa. Produkty naturalne, w tym tradycyjne leki ziołowe (tradycyjne leki zioło), były badane jako potencjalne źródła związków bioaktywnych o właściwościach immunomodulacyjnych. Jednak uogólnione twierdzenia dotyczące niskiej toksyczności lub systemowych funkcji regulacyjnych należy interpretować ostrożnie i wymagać eksperymentalnej weryfikacji w zdefiniowanych modelach chorób⁵.

Eupatorium lindleyanum DC. to tradycyjna roślina lecznicza, której charakterystyczne fitochemikalia obejmują laktony seskwiterpenowe, głównie związki typu guaianolid i eudesmanolid, a także germakranolidy i ksantanolidy⁶. Ekstrakty z Eupatorium lindleyanum DC. wykazywały działanie obniżające poziom lipidów, przeciwmiażdżycowe, przeciwguzowe i przeciwzapalne w różnych warunkach eksperymentalnych⁶. W szczególności ekstrakty etanolowe Eupatorium lindleyanum DC. wykazały efekty ochronne w modelach ostrych urazów płuc wywołanych lipopolisacharydami (LPS)⁷. Jednak działanie przeciwzapalne SLEL i jego efekty w klasycznych modelach ostrego zapalenia pozostają niewystarczająco scharakteryzowane.

Aby uzupełnić tę lukę, zastosowaliśmy dwa komplementarne modele ostrego zapalenia: obrzęk ucha wywołany ksylenem u myszy, który wykrywa szybkie reakcje zapalne neurogenne i naczyniowe, oraz obrzęk łapy wywołany karageenanem u szczurów, dobrze znany model odzwierciedlający zależne od czasu ostre zapalenie związane z produkcją cytokin i infiltracją komórkową. Alternatywne modele, takie jak ogólnoustrojowe zapalenie wywołane LPS, nie zostały wybrane ze względu na nacisk na aktywację systemową immunologii zamiast miejscowego obrzęku tkanek oraz ich ograniczoną przydatność do analiz histologicznych i molekularnych na poziomie tkanek w parach⁸.

Stosując tę połączoną strategię modelową, odpowiedzi zapalne oceniano poprzez ilościowe pomiary obrzęków, ocenę histopatologiczną za pomocą barwienia hematoksyliny i eozyny (H&E), profilowanie cytokiny w surowicy, analizę transkrypcyjną na poziomie tkanek oraz zmiany białek związanych z NF-κB. Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do badania działania przeciwzapalnego w ostrych stanach zapalnych, gdzie interesujące są powstawanie obrzęku, ekspresja cytokin oraz molekularne odczyty związane z szlakiem. Niemniej jednak należy uznać ograniczenia modeli ostrych, w tym ograniczoną ekstrapolację do przewlekłych schorzeń zapalnych oraz granice interpretacyjne przy wnioskowaniu przyczynowości na podstawie zmian sygnalizacji na poziomie tkankowym.

Łącznie to badanie podkreśla podejście oparte na protokole, które integruje komplementarne modele ostrego zapalenia z połączonymi analizami histologicznymi i molekularnymi, zapewniając powtarzalne ramy do oceny potencjału przeciwzapalnego związków pochodzących z ziół.

Protokół

Protokół badań na zwierzętach został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Chongqing (IACUC-CQMU-2025-10073).

Przygotowanie frakcji wzbogaconej laktonem seskwiterpenem (SLEL)

Suszone materiały lecznicze Eupatorium lindleyanum DC. zostały rozdrobnione i poddane ekstrakcji refluksu dwukrotnie z użyciem 70% (V/V) etanolu pod obniżonym ciśnieniem. Każda ekstrakcja przeprowadzono z stosunkiem rozpuszczalnika do materiału 10:1 (v/w) przez 2 godziny. Połączone ekstrakty były filtrowane, koncentrowane pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze ≤60 °C, a następnie liofilizowane próżniowo, aby uzyskać surowy proszek z ekstraktu etanolowego.

Wysuszony ekstrakt został całkowicie rozpuszczony w wodzie destylowanej (końcowe stężenie: 100 mg/mL) i poddano kolejno chromatografii żywicy poliamidowej, a następnie przeprowadzono chromatografię z żywicy makroporowej D101 w celu wzbogacenia laktonów seskwiterpenowych. Po osiągnięciu równowagi adsorpcyjnej żywica D101 była myta wodą destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia polarne, a następnie eluowana bezwodnym etanolem. Po elucii etanolu zebrana frakcja była koncentrowana pod obniżonym ciśnieniem i poddawana liofilizacji, aby uzyskać frakcję SLEL, przechowywaną w temperaturze −20 °C do czasu użycia.

Separację przeprowadzono na platformie UPLC wykorzystującej binarny system fazy komórkowej z acetonitrylem i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie. Program gradientu obejmował początkowe 25-minutowe utrzymanie izokratyczne przy niskiej zawartości organicznej, krótki liniowy etap do 70% acetonitrylu, fazę krokową o wysokiej zawartości organicznej przy 90% acetonitrylu oraz ostatni krok równoważenia powrotu do warunków początkowych. System działał przy napięciu 0,25 mL·min⁻¹ przy temperaturze kolumny 35 °C i objętości wtrysku 0,1 μL (Ilustracja uzupełniająca S1).

Zwierzęta

W tym badaniu wykorzystano łącznie 36 samców szczurów Sprague–Dawley (200 ± 20 g) oraz 36 samców myszy BALB/c (20 ± 2 g). Zwierzęta były trzymane w ustandaryzowanych warunkach (22 ± 2 °C, 55 ± 5% wilgotności, 12-godzinny cykl światła/ciemności) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody. Zwierzęta były aklimatyzowane przez 7 dni przed eksperymentami i codziennie monitorowane pod kątem ogólnego stanu zdrowia. Wszystkie procedury przeprowadzono w celu minimalizacji cierpienia zwierząt, a przed pobraniem krwi i pobraniem tkanek zastosowano znieczulenie.

Obrzęk ucha wywołany ksylenem u myszy

Model obrzęku ucha myszy został ustanowiony zgodnie z opisaniem⁹. Po aklimatyzacji myszy zostały losowo podzielone na sześć grup (n = 6 na grupę): grupy kontrolne (CG), modelowe (MG), deksametazon (DEX, 10 mg/kg) oraz SLEL w dawce niskiej dawki (75 mg/kg), średniej dawce (150 mg/kg) oraz grupy wysokich dawek (300 mg/kg). Wszystkie terapie były podawane doustnie raz dziennie przez 7 kolejnych dni (ostateczna dawka: 10 mL/kg). Po 1,5 godziny po ostatecznym podaniu zapalenie wywołano przez równomierne nałożenie 30 μL ksylenu na obie powierzchnie prawego ucha, z wyjątkiem grupy kontrolnej. Trzydzieści minut później myszy zostały znieczulone, pobrano próbki krwi i uzyskano 8 mm okrągłe ciosy w uszach z identycznych pozycji anatomicznych obu uszu.

Obrzęk łapy wywołany karagenem u szczurów

Model obrzęku łapy szczura został opracowany przy użyciu karagenanu, jak opisano^{wcześniej 10}. Szczury zostały losowo przydzielone do sześciu grup (n = 6 na grupę): grupy z CG, MG, DEX (5 mg/kg) i SLEL w dawce niskiej dawki (50 mg/kg), średniej dawki (100 mg/kg) oraz wysokiej dawki (200 mg/kg). Leczenie podawano doustnie raz dziennie przez 7 dni (10 mL/kg). Bazowe objętości łap mierzono przed ostatecznym podaniem gry. Trzydzieści minut po ostatnim podaniu wstrzyknięto podskórnie 0,1 mL roztworu 1% (w/v) karagenianu do powierzchni podeszwowej prawej tylnej łapy. Objętość łapy mierzono po 1, 2, 3 i 4 godzinach po wstrzyknięciu za pomocą pletysmometru. Obrzęk łapy obliczono jako:

Obrzęk łapy (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Badanie histologiczne

Tkanki uszu i łapy pobrano bezpośrednio po ocenie funkcjonalności. Tkanki były utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 72 godziny w temperaturze pokojowej, osadzane w parafinie, pocięte (5 μm) i barwione H&E zgodnie ze standardowymi protokołami¹¹.

Test immunosorbentny związany z enzymami (ELISA)

Próbki surowicy pobierano przez wirowanie w 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Poziomy TNF-α, IL-6 i IL-1β były ilościowo określane za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów ELISA zgodnie ze standardowymi protokołami.

Analiza zachodniej plamy

Całkowite ekstrakty białkowe przygotowywano z tkanek uszu i łapy przy użyciu buforu lizy RIPA wzbogaconego o inhibitory proteazy i fosfatazy. Stężenia białek zostały ilościowo określone za pomocą testu BCA, a równe ilości białka (30 μg na próbkę) zostały rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i przeniesione na błony PVDF. Błony były blokowane 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym nastąpiła inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi w temperaturze 4 °C przez noc oraz przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma immunoreaktywne wykryto za pomocą zwiększonej chemiluminescencji i zmierzono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Całkowite RNA zostało wyizolowane z tkanek uszu i łapy przy użyciu odczynnika ekstrakcyjnego RNA wymienionego w Tabeli Materiałów. Jeden mikrogram całkowitego RNA został przepisany odwrotnie do cDNA przy użyciu komercyjnego zestawu do transkrypcji odwróconej zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościowe PCR wykonano przy użyciu chemii SYBR Green z zapalnikami specyficznymi dla genów (Tabela 1) w objętości reakcji 10 μL według protokołu amplifikacji dwuetapowej. Szczegółowe warunki transkrypcji odwrotnej oraz parametry cykliczne PCR znajdują się w sekcji Protokoł. Względne poziomy transkrypcji obliczono metodą 2^⁻ΔΔCT , przy czym Gapdh użyto jako wewnętrznego genu referencyjnego.

Dane i analiza statystyczna

Dane wyrażane są jako średnia ± SD. Porównania statystyczne między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu Student's t, natomiast jednokierunkowy ANOVA zastosowano do analiz obejmujących więcej niż dwie grupy. Istotność statystyczna została zdefiniowana jako p < 0,05. Istotność oznaczana jest jako # p < 0,05 oraz ## p < 0,01 w porównaniu do grupy kontrolnej (CG), oraz * p < 0,05 i ** p < 0,01 względem grupy modelowej (MG).

Wyniki

Skład chemiczny w SLEL poprzez UPLC-Q/TOF/MSn

Profil chemiczny SLEL został zbadany za pomocą UPLC-Q/TOF-MSn w trybach dodatnich i ujemnych jonów. Zidentyfikowano dziewięć lakton seskwiterpenowych jako dominujące składniki (Ilustracja uzupełniająca S1). Przypisania wzorów molekularnych zostały wyprowadzone na podstawie obserwowanych jonów adduktowych, w tym [M+H]⁺ i [M+Na]⁺ w trybie dodatnim, a także [M−H]⁻ i [M+HCOO]⁻ w trybie ujemnym (Tabela Uzupełnia...

Dyskusja

W tym badaniu seskwiterpenowe laktony z Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) oceniono przy użyciu dwóch ugruntowanych modeli ostrego zapalenia, mianowicie obrzęku ucha wywołanego ksylenem u myszy oraz obrzęku łapy wywołanego karagenem u szczurów. Poprzez uwzględnienie oceny histologicznej, pomiarów cytocyn w surowicy, ilościowej identyfikacji mRNA na poziomie tkanek oraz sygnałów sygnalizacji na poziomie białka, protokół ten zapewnia wielowarstwową charakterystykę lokalnych i ogólnoustrojowych odpowiedzi zapalnych ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
anty GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anty Iκ Bα	Technologia sygnalizacji komórkowej	4812
anty P65	Abmart	TA5006
anty p-Iκ Bα	Technologia sygnalizacji komórkowej	2859
anty p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1β Zestaw	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
Zestaw IL-6	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Mikropipeta	Eppendorf
Czytnik mikropłyt	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Zestaw do transkrypcji odwrotnej	MedChemExpress	HY-K051A
Bufor RIPA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α Zestaw	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Zamrażarka ultra-niskiej temperatury	SANYO