Tworzenie organoidów gruczołów ślinowych z ludzkich małych gruczołów ślinowych

Podsumowanie

Protokół ten generuje organoidy ślinowych u człowieka poprzez samoorganizację komórek macierzystych z gruczołów ślinowych (hMSG-SC) oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSG-MSC) w systemie 3D Matrigel.

Streszczenie

Badanie opisuje protokół budowy organoidów ślinowych dla człowieka (hMSG), aby ustanowić powtarzalny model badań nad regeneracją tkanek. Komórki macierzyste/progenitorowe gruczołów ślinowych (hMSG-SC) oraz mezenchymalne komórki macierzyste (hMSG-MSC) zostały wyizolowane z dziecięcych tkanek gruczołów ślinowych, powiększone i współzasiewane w trójwymiarowym (3D) systemie opartym na Matrigelu. Samoorganizacja doprowadziła do powstawania organoidów o strukturach przypominających przewodowo-acynar, co skuteczniej odtwarzało rodzimą heterogeniczność komórkową niż modele wyłącznie nabłonkowe. Obecny protokół kładzie nacisk na zoptymalizowane warunki hodowli w celu zachowania fenotypów komórek oraz standaryzowanych kroków do przekazywania, mieszania proporcyjnego i obsługi Matrigela (komercyjnej matrycy bazalnej), co zwiększa powtarzalność. Co ważne, obecność komórek mezenchymalnych zapewnia wspierające mikrośrodowisko, które sprzyja przetrwaniu, proliferacji i morfogenezie nabłonka, przezwyciężając ograniczenia niskiej wydajności i niepełnej struktury. Takie podejście umożliwia spójną generację organoidów gruczołów ślinowych i stanowi solidny model do badania rozwoju, funkcji odbudowy oraz mechanizmów chorób, a także wspiera potencjalne zastosowania translacyjne w terapiach regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Gruczoły ślinowe są niezbędnymi gruczołami egzokrinnymi w jamie ustnej, odpowiedzialnymi za wydzielanie śliny, aby utrzymać wilgoć jamy ustnej, wspomóc trawienie i zapewnić obronę przeciwdrobnoustrojową¹. Dysfunkcja tych gruczołów, taka jak w zespole Sjögrena lub uszkodzeniach po promieniowaniu, może prowadzić do poważnych problemów ze zdrowiem jamy ustnej, a skuteczne terapie regeneracyjne obecnie są niewystarczające. Technologia organoidów, rozwijająca się metoda tworzenia substytutów komórkowych naśladujących strukturę i funkcję tkanek oraz narządów w trójwymiarowym (3D) systemie hodowli, oferuje obiecujące narzędzie do badań nad regeneracją gruczołów ślinowych³.

W ostatnich latach z powodzeniem ustanowiono systemy hodowli organoidów gruczołów ślinowych myszy i ludzi ^4,5. Do wytwarzania tych organoidów wykorzystywano różne typy komórek macierzystych gruczołów ślinowych, w tym komórki macierzyste gruczoły ślinowe ^4,5, pluripotentne^komórki macierzyste ^6,7 oraz komórki macierzyste pochodzące z nabłonka naniedelowego, takie jak komórki macierzyste pęcherzyków zębowych⁸. Niemniej jednak wciąż istnieje kilka wyzwań technicznych. Pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe gruczoły ślinowe (hSG-epiS/PC) wykazują ograniczoną proliferację i niskie przeżycie in vitro, co ogranicza efektywność i powtarzalność organoidów⁹. Ponadto organoidy pochodzące wyłącznie z komórek nabłonkowych często nie mają wielokomórkowej heterogeniczności i nie są w stanie w pełni odtworzyć rozgałęzionej architektury oraz funkcjonalnej organizacji acinarysto-duktalnej gruczołów natywnych¹⁰.

W tym kontekście badanie ma na celu ustalenie ustandaryzowanej metody budowy organoidów gruczołów ślinowych u człowieka u niewielkich osób. Najpierw wyizolowaliśmy komórki macierzyste (hMSG-SC) oraz mezenchymalne komórki macierzyste (hMSG-MSC) z ludzkich tkanek ślinowych 11,12,13. Organoidy były następnie inicjowane za pomocą mechanizmu samoorganizującego się poprzez współzasiewanie hMSG-SC i hMSG-MSC w Matrigelu. Ta metoda stanowi powtarzalną platformę do hodowli organoidów gruczołów ślinowych i stanowi ważne podstawy dla przyszłych badań nad regeneracją gruczołów ślinowych oraz modelowaniem chorób.

Protokół

Pobrano próbki ludzkiego ślinowego gruczołu niewielkiego (hMSG) od pacjentów poddawanych operacji ustnej w Dziale Chirurgii Plastycznej i Rekonstrukcyjnej, Szanghajskim Dziewiątym Szpitalu Ludowym, Wydziale Medycznym Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju. Pacjenci (nr > 10) mieli od 3 miesięcy do 10 lat, bez historii chorób gruczołowych lub autoimmunologicznych. Wszystkie tkanki zostały pobrane z redundantnych, histologicznie prawidłowych drobnych gruczołów ślinowych usuniętych podczas naprawy rozszczepu wargi, co stanowi etycznie zatwierdzone i optymalne źródło żywotnej tkanki do izolacji komórek macierzystych i progenitorowych. Uzyskano świadomą zgodę przedoperacyjną, a badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Medycznej Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju (nr 2018-56). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie tkanek gruczołów ślinowych u człowieka

1. Bezpośrednio po wycięciu należy zanurzyć tkanki gruczołów ślinowych w zmodyfikowanym podłożu orłym (DMEM) Dulbecco, uzupełnionym antybiotykami i utrzymywać temperaturę 4 °C do dalszego przetwarzania (w ciągu 6 godzin).

2. Izolacja komórek z tkanek gruczołów ślinowych u człowieka

1. Zapewnij warunki sterylne, przygotowując zestaw chirurgiczny z autoklawem i wykonując wszystkie procedury wewnątrz szafki biobezpieczeństwa (klasa II BSC).
2. Przełóż wyciętą tkankę do naczynia do hodowli zawierającej fosforanową sól fizjologiczną Dulbecco (PBS) i dokładnie umyj. Podczas mycia użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć tkankę łączną i resztki krwi, zapewniając całkowite oczyszczenie tkanki gruczołów ślinowych.
3. Dodaj 1 ml medium bezsurowicowego, aby zapobiec odwodnieniu tkanek. Tkankę pokrój na kawałki nie większe niż 0,5 mm³ za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych.
4. Za pomocą sterylnych kleszczy równomiernie rozłóż fragmenty tkanki na dno kolby T-25.
5. Dodaj 10 ml medium do piersiówki.
   UWAGA: Do hodowli komórek macierzystych nabłonka (hMSG-SC) głównym medium hodowlowym jest Keratinocyte Medium (KM), zawierające 5 μg/mL albuminy surowicy bydlęcej, 50 μg/mL ekstraktu przysadki bydlęcej, 5 μg/mL transferyny, 3,75 μg/mL insuliny, 3 ng/mL czynnika wzrostu fibroblastów 2, 1 ng/mL czynnika wzrostu naskórka, 500 ng/mL epinefryny, 0,5 μg/mL hydrokortyzonu, ^10-8 M prostaglandyny E₂ oraz 30 nM_T3. Do hodowli komórek macierzystych mezenchymalnych (hMSG-MSC) głównym pożywką jest DMEM/F12 uzupełniony o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 1% penicylinę-streptomycynę (5 000 U/mL) oraz 1% suplement GlutaMAX.
6. Umieść kolbę T-25 pionowo w inkubatorze 37 °C z zawartością 5%_CO2 na 4-5 godzin. W pozycji pionowej medium nie styka się z podrobnioną tkanką, co pozwala roślinom osiąść i mocno przykleić się do dolnej powierzchni.
7. Po 4-5 godzinach przestaw kolbę w pozycji poziomej, tak aby pożywka całkowicie pokrywała przyczepione fragmenty tkanki i wspierała wyrost komórek.
8. Wymień połowę podłoża 4. dnia, a potem co 3 dni, aż pojawią się kolonie komórkowe. Gdy zaobserwowane jest hamowanie wzrostu komórek, należy przejść do passageingu.

3. Przechodzenie komórek

1. Komórki przejściowe, gdy pierwotne kolonie komórkowe wykazują hamowanie wzrostu lub gdy konfluencja komórek osiąga 80%-90%.
2. Aspiruj podłoże hodowlane i raz przemyj komórki PBS.
3. Dodaj 1 mL 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37°C, 5%_CO2 przez 4 minuty dla komórek nabłonkowych i 1,5 minuty dla komórek mezenchymalnych, odpowiednio.
4. Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml podgrzanego medium DMEM z 10% FBS. Delikatnie pipetuj komórki, aby zapewnić prawidłową dysocjację, następnie przenieś zawiesinę do rurki wirówki i wiruj w 300 × g przez 5 minut.
5. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesić hMSG-SC w ośrodku KM, a następnie zawiesijcie hMSG-MSC w mezenchymalnym ośrodku komórek macierzystych (MSCM).
6. Rozsiewaj ponownie zawieszone komórki w kolbach hodowlowych T-25 w stosunku 1:3, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 , aby kontynuować ekspansję.

4. Samoorganizacja hMSG-MSC i hMSG-SC do budowy organoidów

1. Rozmrażać Matrigel na lodzie przez 3-4 godziny.
2. Podgrzej płytkę z 24 dołkami w inkubatorze w 37 °C i schłodź końcówki pipety w 4 °C dla precyzyjnego obsługi.
3. Dodaj 450 μL wcześniej schłodzonego, sterylnego PBS do 1 mL w pełni rozmrożonego Matrigela.
4. Delikatnie wymieszaj za pomocą wcześniej schłodzonych końcówek pipety i rozprowadzaj 350 μL rozcieńczonego Matrigelu na dołek na podgrzaną płytkę z 24 dołkami, dbając o to, by nie powstały pęcherzyki.
5. Delikatnie przechyl płytkę, aby zapewnić równomierne pokrycie Matrigel.
6. Włóż talerz do inkubatora o stężeniu 37 °C z zawartością 5%_CO2 na 20-30 minut, aby Matrigel mógł się zastygnąć. Unikaj nadmiernego suszenia Matrigela.
7. Hodować hMSG-MSC i hMSG-SC osobno w przepustkach 3-5, aż osiągną łączność 80%-90%. Trawić komórki z 0,25% trypsyny-EDTA, neutralizować za pomocą pełnego medium i liczyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hematometru.
8. Wirówka w 300 × g przez 5 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawiesić w świeżym medium hodowlanym.
9. Mieszaj hMSG-MSC i hMSG-SC w proporcji 1:1.
10. Zasiewaj komórki na płytki 24-dołkowe pokryte Matrigelem przy łącznym stężeniu komórek 2 x^{10 5 komórek} na dołek.
11. Dodaj 1 mL pożywki hodowli organoidów (MSCM:KM = 1:1) do każdego dołku.
12. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 , i wymieniaj podłoże co 3 dni.
13. Podhodowla organoidów co 7 dni w proporcji 1:2 do 1:4 i ponownie zawieszona w ośrodku zamrażającym komórki do przechowywania w temperaturze -80 °C.

5. Statystyka i powtarzalność

1. Przeanalizuj wszystkie dane za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego i prezentuj jako średnią ± odchylenia standardowego (SD). Dwustronne niesparowane testy Student były wykorzystywane do porównań między dwiema grupami. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.
   UWAGA: Wszystkie eksperymenty były niezależnie powtarzane co najmniej trzy razy z podobnymi wynikami, a wszystkie analizy statystyczne opierały się na co najmniej trzech niezależnych eksperymentach lub próbkach.

Wyniki

Rośliny z dziecko-ślinowych gruczołów ślinowych u ludzi hodowane w kolbach T25 wykazały wyraźny wzrost komórek wokół bloków tkankowych po około 5 dniach. W pożywce bogatej w surowicę komórki macierzyste komórki wykazywały morfologię w kształcie wrzeciona charakterystyczną dla hMSG-MSC (Rysunek 1A,B). Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że komórki te wykazują wysokie poziomy mezenchymalnych markerów komórek macierzystych, w tym CD29, CD90, CD105 i CD166 (

Dyskusja

Protokół ten umożliwia skuteczną budowę organoidów ślinowych u człowieka poprzez izolację i hodowlę hMSG-SC oraz hMSG-MSC. Tworzenie organoidów zależy od starannego przygotowania eksplantów tkankowych, utrzymania specyficznych warunków hodowli dla komórek nabłonkowych i mezenchymalnych oraz dokładnego współzasiewania obu typów komórek na Matrigelu. Odpowiednie proporcje komórek i gęstość zasiewów są kluczowe dla samoorganizacji i powtarzalnego tworzenia struktur podobnych do kanałów acynarycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11885500BT
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco	25200056
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)/F12	Gibco	C11330500BT
Serum bydła płodu (FBS)	Gibco	10270106
GlutaMAX	Gibco	35050061
Ośrodek keratynocytowy	Sciencell	2101
Matrigel	BD	356230
Mezenchymalne Medium Komórek Macierzystych (MSCM)	Sciencell	7501
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Gibco	C20012500BT