Method Article

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

DOI:

10.3791/69868

⸱

June 5th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia superrozdzielcza znacznie rozwinęła naszą zdolność do badania struktur biologicznych poza granicą dyfrakcyjną, czyniąc ją niezbędną do badania gęsto upakowanych struktur jądrowych, takich jak chromatyna, lamina jądrowa oraz ciał jądrowych, takich jak jądrówki. Chromatyna wykazuje wieloskalową organizację – od nukleosomów o rozmiarze nanometrów po domeny mikronowe – co wymaga podejść do obrazowania zdolnego zarówno do wysokiej rozdzielczości, jak i specyficzności molekularnej. Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), szczególnie stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcji (STORM), umożliwia precyzyjne mapowanie znaków epigenetycznych, dostarczając kluczowych informacji o strukturze i funkcji chromatyny. Jednak obrazowanie wieloznaczne w środowisku jądrowym wiąże się z unikalnymi wyzwaniami, w tym zmniejszoną dostępnością przeciwciał, zwiększonym wiązaniem niespecyficznym oraz niestabilnością fluoroforów. Aby rozwiązać te problemy, przedstawiamy sekwencyjny protokół immunoznakowania zoptymalowany pod środowiska o wysokiej gęstości jądrowej, umożliwiający solidne trójkolorowe SMLM przy minimalnym przesłuchu i mniejszym pogorszeniu sygnału. Metoda ta obejmuje zoptymalizowane formułowania buforów, selekcję fluoroforu oraz strategie walidacji przeciwciał, aby zapewnić powtarzalne, wysokiej jakości znakowanie na wielu celach. Co ważne, integrujemy ten protokół z pipeline'em analizy obliczeniowej, który wykorzystuje lokalizacje z jednego celu molekularnego jako kotwicy przestrzenne (punkty zalążkowe) do ilościowego określania odległości między celami, lokalnych gęstości oraz wieloznacznej współafinity. Pozwala to na szczegółową analizę przestrzenną składników chromatyny na skali nano. Protokół ten służy jako powtarzalna rama do obrazowania wieloskładnikowego i analizy ilościowej w gęstych środowiskach subkomórkowych, oferując potężne narzędzie dla badaczy zajmujących się złożonymi architekturami jądrowymi, takimi jak chromatyna.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) umożliwiło bezprecedensowe badania struktur biologicznych na skali nanometrów 1,2,3,4,5. Poza obrazowaniem pojedynczym celem, rozszerzenie na wielokolorowe SMLM jeszcze bardziej rozwinęło tę dziedzinę, umożliwiając jednoczesną wizualizację wielu gatunków molekularnych, a także relacji przestrzennych i czasowych między strukturami subdyfrakcyjnymi 6,7,8,9,10,11 . Jednak zastosowanie multipleksowanego SMLM do obficie rozmieszczonych modyfikacji histonowych pozostaje wyzwaniem ze względu na gęsty, polimerowy charakter DNA jądrowego oraz ograniczoną dostępność przeciwciał w tym środowisku 12,13,14,15,16,17,18.

Chromatyna wykazuje hierarchiczną, wieloskalową organizację obejmującą kilka rzędów wielkości długości, od zespołów nukleosomów na skalę nanometrów po architekturę jądrową w skali mikrometrów. Na największych skalach chromosomy zajmują odrębne terytoria chromosomowe, w ramach których genom jest dalej podzielony na przedziały A/B oraz domeny topologicznie powiązane (TAD), które ograniczają długotrwałe interakcje regulacyjne poprzez mechanizmy takie jak wyciąganie pętli 19,20,21,22. Na skalach poniżej 200 nm chromatyna jest zorganizowana jako nieuporządkowany polimer złożony z heterogenicznych domen pakujących (PD), a nie z oddzielnych bloków euchromatyny i heterochromatyny, przy czym obszary aktywne transkrypcyjne preferencyjnie lokalizują się na granicach PD 23,24,25,26,27,28,29. Na najmniejszych skalach (5-20 nm) chromatyna składa się z nieregularnych zespołów nukleosomów i zgęsków nukleosomów, co podkreśla brak jednolitego motywu fałdowania wyższego rzędu i podkreśla emergentny, zależny od skali charakter organizacji genomu 24,26,30. Dzięki szybkiemu rozwojowi metod opartych na sekwencjonowaniach, takich jak sekwencjonowanie immunoprecipitacji chromatyny oraz wysokoprzepustowe wychwytywanie konformacji chromatyny 19,30,31,32,33, zidentyfikowano różne cechy struktur organizacyjnych mezoskalowych chromatyny31,32. Jednak te techniki, w przeciwieństwie do obrazowania, nie rejestrują geometrii przestrzennej, którą obserwuje się dopiero po rozwiązaniu tych struktur. Metody mikroskopii elektronowej, takie jak chromatynowa mikroskopia elektronowa (ChromEM24) oraz chromatynowa skaningowa transmisja elektronowa (ChromSTEM25), wykazały, że chromatyna jest heterogeniczna i zorganizowana w domeny pakowania w skalach długości 50-200 nm 25,28,29. Chociaż techniki te umożliwiają imponującą rozdzielczość identyfikacji domen pakowania chromatyny, nie zapewniają molekularnie specyficznego mapowania, które oferuje SMLM. Gromadzenie punktów DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT22) oraz wieloklarna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)19umożliwiają wysokie multipleksowanie; jednak DNA-PAINT jest silnie wpływany przez podwyższony szum tła wynikający z losowych zdarzeń wiązania w środowisku jądrowym bogatym w oligonukleotydy12,34, podczas gdy tradycyjne metody FISH oparte na denaturacji termicznej wymagają zakłócenia natywnego fałdowania chromatyny. Wcześniejsze badania stosowały techniki obrazowania superrozdzielczości do badania chromatyny na tej skali długości i zidentyfikowały hybrydowy skład domen pakowania, w przeciwieństwie do wcześniejszych modeli separacji fazowej 12,23,34,35. Protokół ten wynika z wcześniej opublikowanego artykułu omawiającego biologiczne znaczenie tych odkryć34. Dlatego, dzięki wysokiej rozdzielczości i możliwościom multipleksowania, dSTORM oparty na barwieniu immunobarwnym pozostaje najbardziej opłacalną strategią do obrazowania wielokolorowej chromatyny w warunkach niemal naturalnych.

Protokół ten nie jest pierwszym, który wykazał znakowanie większej liczby niż dwóch celów jądrowych, a wcześniejsze badania oznaczały poszczególne kompleksy białkowe lub geny jako12,36. Pomimo skutecznego oznaczania modyfikacji histonów posttranslacyjnych nukleosomów, wielokolorowe znakowanie, obrazowanie i analiza SMLM w kolorowej chromatynie stanowią poważne wyzwania. Po pierwsze, immunobarwienie w gęstym środowisku chromatynowym wymaga optymalizacji stężenia przeciwciał, sekwencji inkubacyjnej oraz składu buforu, aby zapewnić odpowiednie przenikanie i wiązanie bez nadmiernego tła. Po drugie, konieczna jest kompleksowa analiza wielu znaków, ponieważ interakcje między euchromatyną, heterochromatyną i enzymami takimi jak polimeraza RNA prawdopodobnie wykraczają poza proste wykluczenia binarne. Do tej pory maksymalna liczba kolorów wykazanych w obrazowaniu chromatynowym dSTORM wynosi dwa: 18,37,38,39.

Przedstawiamy tutaj solidny protokół do obrazowania i analizy trójkolorowej chromatyny SMLM. Nasz sposób barwienia optymalizuje czas inkubacji przeciwciał i wykorzystuje ulepszone bufory obrazowania40do dłuższych sesji obrazowania dla wielu etykiet. Dodatkowo opisujemy potoki obliczeniowe do analizy odległości dwukolorowej oraz analizy gęstości łączeń trójkolorowych, umożliwiając ilościową charakterystykę zależności między heterochromatyną, euchromatyną a maszynami transkrypcyjnymi. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań SMLM z dwukolorową chromatyną, które sugerowały rozdzielenie heterochromatyny i euchromatyny, obrazowanie trójkolorowej chromatyny ujawnia, że genom jest zorganizowany w domeny pakujące, przy czym euchromatyna i aktywna transkrypcja są lokalizowane na obrzeżach konstytutywnych rdzeni heterochromatyny34.

Protokół ten dostarcza społeczności powtarzalnych ram do wykonywania wielokolorowej chromatyny SMLM oraz ustala strategie analizy dostosowane do wielu funkcjonalnie sprzężonych celów jądrowych. Poprzez wypełnianie luk metodologicznych umożliwia systematyczne badanie organizacji domeny chromatyny na poziomie nadnukleosomalnym, uzupełniając podejścia sekwencjonowania i mikroskopii elektronowej, jednocześnie zachowując rodzimą architekturę jądrową. Ten artykuł jest rozszerzonym protokołem opublikowanego artykułu34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Kolejna sekcja protokołu zostanie podzielona na proces barwienia i proces pozyskiwania, opisany poniżej. Aby poznać tutoriale analizy danych, zapoznaj się z powiązaną publikacją34, która szczegółowo opisuje analizę wieloznacznych modyfikacji histonów.

1. Proces barwienia:

UWAGA: W całym protokole wspomina się o naczyniach 35 mm lub 8 dobrze komorowanych płytach. To są naczynia, których nasza grupa używa do hodowli komórek, choć możliwe są mniejsze i bardziej efektywne metody. Upewnij się, że jeśli stosuje się alternatywne materiały, zalecane stężenia przeciwciał buforowych są utrzymywane w utrzymaniu zalecanych stężeń. Ze względu na sekwencyjny charakter tego protokołu, dobór przeciwciał jest ważny dla skutecznego znakowania. Stosujemy standardowe rozumowanie, aby zapewnić, że przeciwciała gospodarza do celów są różne, tak aby przeciwciała wtórne mogły celować w różne gatunki gospodarza, skutecznie minimalizując efekty poza celem. Kolejność oznakowania ustalana jest na podstawie lokalizacji celu w jądrze. Ponieważ celujemy w domeny pakujące chromatynę25, 28, 34, 35 i rozumiemy, że jest to proces napędzany dyfuzją, zawsze najpierw oznaczamy cele heterochromatyczne, następnie euchromatynę, a na końcu RNAPII, aby zminimalizować wykluczenie steryczne w gęstych obszarach heterochromatycznych. Optymalizacja buforów była przeprowadzana empirycznie podczas opracowywania protokołu. Stwierdziliśmy, że dodanie surowicy koziej po pierwszym celu było pomocne w redukcji efektów poza celem w kolejnych etapach.

  1. Przygotowanie bufora
    1. Komponenty buforowe:
      UWAGA: Więcej informacji o komponentach, w tym czasach przechowywania i przygotowania, można znaleźć w Tabeli materiałów. Zalecamy, aby użytkownik miał przygotowane wszystkie rozwiązania przed rozpoczęciem protokołu, aby uniknąć błędów eksperymentalnych. Roztwór hartujący powinien być przygotowywany na końcu.
    2. Stwórz bufor blokujący
    3. Odważ albuminę surowicową (BSA) tak, aby końcowe stężenie w objętości buforowej potrzebnej do eksperymentu wynosiło 3% i dodaj do probówki wirówki. Przechyl rurkę pod kątem 45°, aby kryształy BSA rozłożyły się w prowadnicy, a następnie dodaj fosforanową sól fizjologiczną (PBS). Robi się to, aby zapobiec powstawaniu grudek kryształów, które nie rozpuszczą się.
    4. Zostaw rurkę w temperaturze pokojowej, aż wszystkie kryształy się rozpuszczą. Nie potrząsaj rurką ani wirem – to spowoduje powstawanie bąbelków, które przyciągną białka na powierzchnię i uniemożliwią całkowite rozpuszczenie BSA.
    5. Po całkowitym rozpuszczeniu dodaj Triton X-100 tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 0,2% (v/v) przy objętości wybranej w kroku 1.3. Jeśli kryształy nie są całkowicie rozpuszczone, pipetuj kilka razy, aby powoli mieszać roztwór bez tworzenia pęcherzyków.
      UWAGA: Jeśli robisz zmodyfikowany bufor, uwzględnij w tym procesie surowicę z koz. Jednak zmodyfikowane bufory blokujące powinny być wytwarzane świeżo podczas użytkowania i nie przechowywane przez długi czas, ale zapewnić, że końcowe stężenia są takie same jak w Tabeli materiałów – 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
    6. Zrób bufor do prania:
      Powtórz kroki blokowania buforu w wersji 1.1.2, ale dla wygody użyj stężeń wymienionych w sekcji materiałów i tutaj (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 w 1X -DPBS, a dla modyfikacji zawiera 1% surowicy koziej)
    7. Zrób roztwór utrwalający:
      1. Dodaj PBS do rurki wirówki.
      2. Do rurki wirówki dodaj odpowiednią ilość 16% paradehydu paraformale, aby uzyskać końcowe stężenie 4%.
        UWAGA: Przygotowuj świeże i gotowe podczas wyjmowania komórek z inkubatora. Chociaż obecny roztwór utrwalający zwykle nie wykorzystuje glutaraldehydu, można go uwzględnić i może być przydatny ze względu na bardziej wytrzymałe i dłużej utrzymujące się utrwalanie w porównaniu z paraformaldehydem. Układ dSTORM nie posiada możliwości wykrywania sygnałów fluorescencyjnych przez cały okres życia z glutaraldehydu (GA), jednak użytkownicy posiadający tę możliwość mogą uznać to za przydatne do oddzielenia się od struktur znakowanych fluoroforem.
    8. Spróbuj roztworu hartowania:
      1. Odważ borowodnikiem sodu na papierze wagowym.
      2. Przygotuj rurkę wirówki.
      3. Dodaj borowodnik sodu do rurki.
      4. Dodaj PBS do rury.
        UWAGA: Roztwór powinien mieć bąbelki po dodaniu PBS.
    9. Stwórz bufor obrazowania:
      1. Rozpuszcz 1,4-diazabicykloktan (DABCO) w wodzie bez DNAZY zjonizonej, aby uzyskać roztwór DABCO o stężeniu 13 mL o stężeniu 1 M.
      2. Dodaj 12 M HCl (~240 μL), aż DABCO całkowicie się rozpuści i pH osiągnie 8,0.
      3. Przygotuj 1 milion siarczynu sodu, rozpuszczając go w 10x PBS. DTT nie wymaga żadnego przygotowania.
      4. Do ostatecznego przygotowania użyj wcześniejszych zapasów do produkcji 65 mM DABCO z 30 mM siarczynu sodu i 30 mM DTT (1 M zapasu) w wodzie dejonizowanej.
      5. Dostosowuj pH poprzez miareczkowanie za pomocą HCl i NaOH, aż pH wyjdzie do 8,0. Przechowywany w sklepie i zabezpieczony Parafilmem w temperaturze 4°C nie dłużej niż 2 miesiące. Monitoruj pH podczas całego użytkowania.
  2. Szczegóły pierwszego procesu barwienia etykiety:
    1. Obsesja:
      1. Pobierz żywe komórki z inkubatora i usuń pożywkę z naczynia. Umieść podłoże hodowlane komórkowe do pojemnika na odpady niebezpieczne dla biohazardu.
      2. Dodaj wystarczająco dużo PBS, aby pokryć komórki (1 mL dla talerza 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego).
      3. Delikatnie mieszaj naczynie, aby umyć komórki PBS, a następnie usuń PBS z naczynia. Usuń PBS do pojemnika na odpady niebezpieczne.
      4. Dodaj wystarczającą ilość roztworu utrwalającym, aby pokryć komórki (1 mL dla naczynia 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie pozostawij komórki do utrwalenia na 10 minut.
      5. Podczas utrwalania ogniw odważ borowodnik sodu do roztworu hartującego i dodaj go do rurki wirówki.
      6. Usuń roztwór utrwalający z naczynia i wyrzuć go do odpowiednio oznakowanego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
    2. Hartowanie
      1. Dodaj do naczynia tyle PBS, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść miskę na shakerze (dowolny standardowy shaker) na 5 minut, aby umyć komórki.
      2. Zdejmij miskę z shakera, wyjmij PBS i wyrzuć ją do odpowiednio oznaczonego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
      3. Dodaj do miseczki tyle (250 μL, z 8-dołkiem) roztworu chłodzącego, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia 35 mm i 500 μL dla szkła komorowego), a następnie umieść miskę na shakerze na 7 minut, aby schłodzić autofluorescencję w komórkach.
      4. Gdy komórki są na shakerze, wyrzuć pozostały roztwór hartujący do rurki wirówki w odpowiednio oznaczonym pojemniku na cieczące się odpady chemiczne.
      5. Zdejmij miskę z shakera, usuń roztwór hartujący i wyrzuć ją do odpowiednio oznakowanego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
      6. Dodaj do naczynia tyle (250 μL, 8-dołkowa miska) PBS, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść naczynie na shakerze na 5 minut, aby umyć komórki.
      7. Zdejmij miskę z shakera, wyjmij PBS i wyrzuć ją do odpowiednio oznaczonego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
      8. Powtórz kroki 1.2.2.6 i 1.2.2.7 jeszcze dwa razy (łącznie 3 płukania PBS).
    3. Blokowanie
      1. Dodaj do talerza wystarczającą ilość bufora blokującego, aby pokryć powierzchnię (250 μL, miska 8-dołkowa, 1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkła komorowego).
      2. Umieść naczynie na shakerze na co najmniej godzinę, aby przeniknąć błony komórkowe i zablokować miejsca wiązania (zajmować nieokreślone miejsca, aby nie kolidowały z docelowymi). (Chociaż testowaliśmy różne razy, aby określić minimalny czas skutecznego blokowania na 20 minut, zdecydowanie zalecamy blokowanie przez co najmniej 1 godzinę lub dłużej do nocowania. Optymalizacja może być potrzebna w zależności od celu i linii komórkowej.)
      3. Gdy komórki są na shakerze, przygotuj pierwotny roztwór do barwienia przeciwciał (zobacz zalecane stężenie na stronie dostawcy lub tabelę w sekcji materiałów).
      4. Aby określić całkowitą objętość roztworów barwiących do przygotowania, dodaj 0,5 mL do objętości potrzebnej do pokrycia komórek (np. dla jednej misy o średnicy 35 mm przygotować roztwór 1,5 mL).
      5. Usuń objętość określoną w sekcji 1.2.3.1 z buforu blokującego i dodaj tę objętość do nowej rurki wirówki, aby przygotować roztwór barwiący.
      6. Dodaj odpowiednią ilość pierwotnych przeciwciał do bufora blokującego, aby uzyskać właściwe końcowe stężenie. Objętości zapasów przeciwciał pierwotnych dla kilku często stosowanych przeciwciał można znaleźć w sekcji materiałów.
      7. Zdejmij miskę z shakera, usuń bufor blokujący i wyrzuć ją do odpowiednio oznaczonego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
    4. Pierwotne barwienie przeciwciał:
      1. Dodaj do naczynia wystarczającą ilość pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść miskę na shakerze na co najmniej 1-2 godziny aż do nocy w celu oznaczania celów komórkowych.
      2. Zdejmij miseczkę z shakera, usuń główny roztwór do barwienia przeciwciał i wyrzuć go do odpowiednio oznakowanego pojemnika na płynne odpady chemiczne.
      3. Dodaj wystarczającą ilość bufora do mycia naczynia, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść naczynie na shakerze na 5 minut, aby umyć komórki.
      4. Zdejmij naczynie z shakera, usuń bufor do mycia i wyrzuć go do odpowiednio oznaczonego pojemnika na płynne odpady chemiczne.
      5. Powtórz kroki 1.2.4.3 i 1.2.4.4 jeszcze dwa razy (łącznie 3 płukania buforowe prania).
      6. Podczas ostatniego mycia komórki są na shakerze, przygotuj wtórny roztwór do barwienia przeciwciał (zobacz zalecane stężenie na stronie dostawcy lub wcześniejsze eksperymenty).
      7. Aby określić całkowitą objętość roztworów barwiących do przygotowania, dodaj 0,5 mL do objętości potrzebnej do pokrycia komórek (np. dla jednej misy o średnicy 35 mm przygotować roztwór 1,5 mL).
      8. Usuń objętość określoną w sekcji 1.2.4.7 z bufora blokującego i dodaj tę objętość do nowej rurki wirówki, aby przygotować roztwór barwiący.
      9. Dodaj odpowiednią ilość zapasów przeciwciał wtórnych do bufora blokującego, aby uzyskać właściwe końcowe stężenie. Wolumeny zapasów przeciwciał wtórnych dla kilku często stosowanych przeciwciał można znaleźć w tabeli materiałów.
      10. Owiń rurkę wirówki wtórnym roztworem do barwienia przeciwciał folią aluminiową, aż będziesz gotowy do dodania do komórek w naczyniu.
    5. Wtórne barwienie przeciwciał:
      1. Dodaj do naczynia wystarczającą ilość wtórnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść miskę na shakerze na co najmniej 40 minut, aby dodać fluorofory do oznaczonych celów komórkowych.
      2. Upewnij się, że naczynie jest pokryte folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.
      3. Zdejmij miseczkę z shakera, usuń wtórny roztwór do zabarwiania przeciwciał i wyrzuć go do odpowiednio oznakowanego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
      4. Dodaj do naczynia tyle PBS, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego), a następnie umieść naczynie na shakerze na 5 minut, aby umyć komórki.
      5. Zdejmij miskę z shakera, wyjmij PBS i wyrzuć ją do odpowiednio oznaczonego pojemnika na cieczne odpady chemiczne.
      6. Powtórz sekcje 1.2.5.4 i 1.2.5.5 jeszcze raz (łącznie 2 płynięcia PBS).
      7. Komórki te mogą być teraz obrazowane lub przechowywane do późniejszego obrazowania. Jeśli obrazujesz od razu, postępuj zgodnie z krokami w sekcji Akwizycja. Jeśli przechowujesz je do późniejszego obrazowania, kontynuuj postępowanie zgodnie z poniższymi krokami.
      8. Dodaj do talerza tyle PBS, aby pokryć powierzchnię (1 mL dla naczynia o średnicy 35 mm i 500 μL dla szkiełka komorowego) przed przechowywaniem.
      9. Owiń miskę parafilmem, a następnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu cieczy i wybielaniu fluoroforem.
      10. Przechowuj zapakowane naczynie w temperaturze 4°C, aż będzie gotowe do zdjęcia.
        UWAGA: W przypadku etykiet używanych w tym protokole naczynia można przechowywać przez 2-3 dni, zanim jakość obrazu zostanie znacząco pogorszona; Jednak różne przeciwciała mogą mieć różną stabilność, ale przy odpowiednim przechowywaniu pozostają stabilne przez pewien czas po zakończeniu protokołu. Przechowywanie etykietowanego naczynia dłużej niż tydzień nie jest zalecane, ponieważ roztwór utrwalający nie jest wystarczająco skoncentrowany dla długoterminowej stabilności.
  3. Proces późniejszego barwienia etykiety:
    1. Blokowanie:
      1. Należy stosować 1.2.3.1 - 1.2.3.2, ale stosuj bufor blokujący z surowicą kozą. Czas inkubacji blokowania może być krótki do 1 godziny, ale zalecamy dłuższy czas z górną granicą nocą (18-24 godziny) dla kolejnych oznakowań, aby zmniejszyć wiązanie poza celem. Proszę odwołać się do wcześniejszych eksperymentów.
      2. Jednocześnie przygotuj pierwotne roztwory przeciwciał, zamiast blokować bufor, w środku blokującym bufor za pomocą surowicy koziej.
    2. Pierwotne barwienie przeciwciał:
      1. Przygotuj zmodyfikowany bufor blokujący i bufor do mycia z surowicą kozą oraz bufor do mycia z serum kozią, jak opisano w sekcji przygotowania bufora.
      2. Należy odwołać się do sekcji kroków 1.2.3-1.2.4 (Blokowanie i pierwotne barwienie przeciwciał) z wykorzystaniem zmodyfikowanych buforów blokujących i myjących:
        UWAGA: Czas inkubacji przeciwciał pierwotnych może być krótki do 1 godziny (8-24 godziny). Chociaż najlepsze wyniki znakowania osiągnięto dzięki dłuższym czasom inkubacji, zwłaszcza dla multilabel. Dane w tym protokole zostały przygotowane z nocnymi krokami inkubacyjnymi.
      3. Krótko przed upływem czasu inkubacji przygotuj roztwory przeciwciał wtórnych w zmodyfikowanym buforze blokującym 1.1.3.
    3. Wtórne barwienie przeciwciał:
      1. Sprawdź sekcję 1.2.5 (Wtórne barwienie przeciwciał), ale użyj buforu blokującego z surowicą kozą.
        UWAGA: Prosimy pamiętać, że czas inkubacji może być krótki nawet 1 godzinę, ale testowaliśmy dłuższe czasy (2-4 godziny) o podobnych wynikach. Aby uzyskać kolejne etykiety, powtórz sekcję 1.3.

2. Proces pozyskiwania

UWAGA: Do akwizycji danych należy użyć oprogramowania Nikon Imaging Software (NIS) elements kompatybilnego z używanym mikroskopem. Każde oprogramowanie, które kontroluje filtr, ścieżkę światła i ustawienia kamery, jest odpowiednie dla tego protokołu. Następujący protokół obrazowania jest dostosowany do oświetlenia próbki całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF); jednak protokół oznakowania jest kompatybilny z wieloma formami obrazowania. Obrazowanie niezgodne z TIRF jest możliwe dzięki temu protokołowi oznakowania dla STORM i jest potrzebne w aplikacjach 3D STORM. Prosimy o stosowanie standardowego protokołu dla alternatywnych metod obrazowania.

  1. Proces późniejszego barwienia etykiety:
    1. Włącz potrzebne elementy optyczne i nawiąż połączenie z odpowiednim oprogramowaniem. W większości przypadków, jak w NIS, oprogramowanie nie iskializuje się w pełni, jeśli komputer nie będzie w stanie prawidłowo komunikować się z mikroskopem, kamerą i sterowaniem sceną.
    2. Open NIS Software (lub odpowiednik).
    3. Ustaw widok na żywo: Włącz widok na żywo >przełącznik Zachowaj automatyczne skalowanie > w ustawieniach aparatu, ustaw czas ekspozycji na 30 ms.
    4. Ustaw ścieżkę danych do akwizycji.
    5. Przejdź do górnego panelu Zdobywaj> Szybki Timelapse> Path
    6. Wybierz właściwą nazwę pliku przy pierwszym przejęciu i ustaw liczbę klatek na 10 000.
      UWAGA: Te kroki mają na celu ograniczenie czasu ekspozycji próbki na źródło światła po rozpoczęciu obrazowania.
    7. Upewnij się, że kąt krytyczny i kąt zerowy TIRF są ustawione przed pozyskaniem. Proszę zapoznać się z internetowymi źródłami tutoriali, jak to osiągnąć. Jak już wspomniano, jeśli nie używasz oświetlenia TIRF, ten krok można pominąć.
    8. Wybierz właściwą ścieżkę światła dla kamery i przełącz opcję Epi Illumination w sekcji Lampy (w oprogramowaniu NIS lub równoważnym programie), aby upewnić się, że lustro jest ustawione na szerokokątne oświetlenie z niestandardowego źródła światła laserowego.
  2. Przygotowanie próbki:
    1. Pobierz próbki i dodaj bufor obrazujący (formuła opisana w sekcji 1.1 Przygotowanie buforu) do próbki. (W zależności od używanego bufora obrazowania, mogą wymagać różne środki ostrożności. Chroń próbki przed światłem.)
    2. Po dodaniu oleju do obiektywu umieść próbkę na scenie z odpowiednim uchwytem i włącz Perfect Focus , a następnie skup się na próbce.
  3. Kroki obrazowania:
    1. Znajdź plamkę laserową i nawiguj do miejsca na talerzu/tacie, gdzie nie ma komórek.
    2. Przełączaj oświetlenie TIRF .
    3. Zmień filtr, aby pasował do odpowiedniego filtra, aby przepuszczać światło czerwone (lub inny laser używany do pozyskiwania danych dla tej konkretnej próbki).
      UWAGA: Użyj filtra wielonacięciowego, jak opisano w tabeli materiałów. Filtr wielonacięciowy nie jest konieczny, a użytkownicy mogą alternatywnie wykonywać obrazowanie kostek filtrów niewyraźnych przeznaczonych dla fluoroforów używanych do barwienia.
    4. Włącz laser przy najniższej mocy lasera ~ 1 mW (zależy to od źródła oświetlenia, ale robi się to, aby zapobiec przypadkowemu wybielaniu) i ustaw kąt lustra na kąt krytyczny.
    5. Jeśli w pobliżu nie ma ogniw, zwiększ moc lasera, aż plama lasera będzie wyraźnie widoczna w trybie na żywo.
    6. Użyj narzędzia Region of Interest (ROI), rysuj, ustaw i zapisuj ROI tam, gdzie znajduje się plama laserowa.
      UWAGA: W przypadku próbek wieloznacznych prosimy o to, aby plamy laserowe dla wszystkich niezbędnych źródeł światła były wyrównane. W tym protokole używamy trzech laserów i dbamy o to, aby wszystkie punkty były wyrównane. Jest to niezbędne, ponieważ współrejestracja danych przestrzennych wymaga laserowego wyrównania.
    7. Powrót do oświetlenia Epi i filtra Bright Field.
    8. Za pomocą narzędzia do definiowania ROI należy znaleźć odpowiednią, zdrową komórkę (np. odpowiednia komórka HCT116 powinna mieć przylegający, wielokątny lub owalny kształt z wyraźną granicą komórki).
    9. Wycentruj ROI na jądrze i kliknij OK , aby powiększyć pozycję ROI (Wykonaj oświetlenie jasnym polem, ponieważ stan komórki nie może być bezpośrednio określony na podstawie szerokich obrazów fluorescencyjnych jądra.
    10. Powrót do oświetlenia TIRF używając tej samej metody co w wersji 2.3.2.
    11. Wybierz odpowiedni filtr dla najdłuższej długości fali oznaczony jako cel (w większości przypadków jest to bardzo czerwony, np. Alexa Fluor 647 oznaczony jako cel). Zazwyczaj wybiera się najdłuższą długość fali jako pierwszą, aby uniknąć foto-bielenia próbki o krótszych długościach fal, w przypadku, gdy oznaczone cele mają elementy wtórne nakładające się na widma.
    12. Przy NISKIEJ mocy lasera dla każdego potrzebnego lasera (w przypadku multi-label są to 3 lasery), włącz laser i oświetl jądro, aby upewnić się, że próbka jest prawidłowo wyrównana.
    13. Stosuj kontrolę TIRF, aby upewnić się, że próbka jest oświetlona TIRF.
    14. Wybierz odpowiednią pozycję Z do pozyskania w zależności od potrzeb. Jednak można to dostosować tuż przed zakupem.
    15. Ustaw czas naświetlania według potrzeb fluoroforów (użyj od 10 do 30 ms).
    16. Kliknij Acquire > Szybki timelapse.
    17. Ustaw klatki na ≥10,000 i kliknij Apply , aby utworzyć plik w określonym katalogu.
    18. Włącz moc lasera do 50% i podaj próbkę fotowybielacza.
    19. Jądro powinno początkowo wybielić, ale wkrótce potem (po kilku sekundach) powinno zacząć migać.
    20. Powrót do pożądanego kąta krytycznego i pozycji Z, przełączając zapisane pozycje lub ręcznie kontrolując kąt lustrzanego i pozycję Z, aby uzyskać szybki poskok czasowy.
    21. Upewnij się, że nie ma dryfu na etapie lub współrejestracja obrazów wielokanałowych nie będzie prawidłowa. Używaj markerów fiduciarnych (fluorescencyjne mikrokulki) lub zapisuj pozycję Z na początku akwizycji, aby później wykorzystać ją do korekcji dryfu, stosując metodę zapisu pozycji do wielopunktowego pozyskiwania w urządzeniu.
    22. Zmień filtr (lub zostaw, jeśli używasz wielonacięcia z pasem przepustowym dla potrzebnego fluoroforu) i powtórz sekcję 2.3.17-2.3.20 (przy kolejnych etykietach zawsze zaczynaj od niskiej mocy lasera, dostosuj parametry i zdobywaj).
  4. Przetwarzanie danych:
    1. Załaduj stos surowych obrazów do FIJI za pomocą wtyczki Bio-Formats. Wygeneruj projekcję o minimalnej intensywności, wybierając Obraz> Stosy> Projekt Z i wybierając minimalną intensywność jako typ projekcji. Odejmij tę minimalną projekcję od surowego stosu obrazów za pomocą kalkulatora procesu > obrazów. Na uzyskanym obrazie wykonaj odejmowanie tła (Proces > odejmij tło) z promieniem toczącej się kuli 5 pikseli.
    2. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) dla poszczególnych komórek ręcznie lub za pomocą wtyczki Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. Wykonaj analizę lokalizacji na preprzetwarzanym stosie obrazów w ramach zdefiniowanego ROI, używając wtyczki ThunderSTORM (Plugins > ThunderSTORM > Run analysis). Stosuj odpowiednie parametry do solidnej lokalizacji (np. filtr obrazu: B-spline, rząd = 3, skala = 2; próg maksymalnej intensywności = 1,5× std (Wave.F1); metoda lokalizacji subpikselowej: Gaussian, sigma = 2; promień dopasowania = 4; metoda dopasowania: maksymalne prawdopodobieństwo). Uzyskane współrzędne mogą posłużyć do rekonstrukcji obrazu o nadrozdzielczości.
    4. W eksperymentach wielokanałowych łącz kanały, aby wygenerować złożony obraz dSTORM z rekonstrukcją chromatyny (Image > Color > Merge Channels).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne trójkolorowe obrazy chromatyny dSTORM

Proponowany protokół sekwencyjnego barwienia został przetestowany jako ważny dla różnych linii komórkowych, w tym fibroblastu BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A itd. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne obrazy z komórek fibroblastu BJ, HeLa i MCF10A.

Walidacja pipeline'u analitycznego z wykorzystaniem symulowanych zbiorów danych

Opracowanie protokołu fluorescencji immunofluorescencyjnej trójkolorowej wymagało stworzenia specjalistycznego podejścia obliczeniowego, zdolnego do obsługi złożoności wielocelowych danych nuklearnych SMLM (Rysunek 2A,2 B). Biorąc pod uwagę gęste środowisko chromatyny, gdzie wiele celów współistnieje w bliskości, wdrożyliśmy ramy analizy chmur punktów, które bezpośrednio przetwarzają współrzędne lokalizacyjne, a nie rekonstruują obrazy. To podejście wykorzystuje rozbudowane narzędzia do analizy klastrowania dostępne dla danych chmury punktów 40,41,42. Systematycznie oceniliśmy zdolność pipeline'u analitycznego do rozróżniania biologicznie istotnych wzorców przestrzennych za pomocą kontrolowanych, symulowanych zbiorów danych. Opracowano cztery typy rozkładów, aby reprezentować różne scenariusze organizacji chromatyny: rozkład normalny dla gęsto skupionych modyfikacji, rozkład jednolity dla wzorców rozproszonych, strefy wykluczenia modelujące toroidalne rozmieszczenie oraz rozkład losowy jako kontrola organizacyjna (Rysunek 2C). Te symulowane wzorce były zakotwiczone w prawdziwych pozycjach klastrów heterochromatyny uzyskanych na podstawie eksperymentalnych danych H3K9me3, zachowując realistyczne ograniczenia przestrzenne jądrowe. Ten framework analizy wykorzystuje klasteryzację DBSCAN (epsilon = 50 nm, minimum punktów = 3), która jest jedną z wielu metod analizy klastrowej w danych SMLM 40,41,42. Aby zapewnić prawidłowe parametry klasteryzacji, wcześniej opisaliśmy metodę optymalizacji dostosowaną do wykrywania domen pakowania chromatyny34. Prosimy pamiętać, że jako początkowy krok analizy użytkownicy będą musieli optymalizować parametry informujące o wyborze poprzez strukturę, środowisko i funkcję swojego celu. Tutaj granice klastrów są wyznaczane za pomocą obliczeń otoczki wypukłej, eliminując założenia dotyczące geometrii dziedziny. Nasza walidacja wykazała wyraźne rozróżnienie wszystkich symulowanych wzorców rozkładu za pomocą charakterystycznych profili histogramu odległościowego (Rysunek 2D). Każdy typ organizacji przestrzennej dawał charakterystyczne sygnatury podczas analizy lokalizacji względem centroidów heterochromatycznych. Analiza wspólnego zajmowania została przetestowana przy użyciu symulacji dual-markerów z kontrolowanymi relacjami przestrzennymi (Rysunek 2E). Przestrzennie segregowane markery (konfiguracja normalno-toroidalna) dawały minimalną gęstość łączeń, zgodnie z oczekiwaniami, co skutkowało płaskimi profilami rozkładu (Rysunek 2E). Nakładające się wzory markerów (konfiguracja normalno-losowa) powodowały malejącą gęstość łączeń wraz ze wzrostem odległości od punktów odniesienia, co odpowiadało teoretycznym przewidywaniom. Wyniki tych walidacji pokazują zdolność naszego frameworka do wykrywania i ilościowania zależności sprzężenia przestrzennego w złożonych zbiorach danych wielocelowych. Aby uzyskać więcej informacji na temat generowania tych symulowanych zbiorów danych, prosimy zapoznać się z pełną publikacją34.

Reprezentatywne wyniki analizy organizacji chromatyny

Wdrożenie naszego podejścia do analizy zwalidowanej w próbkach biologicznych ujawnia charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej, które można osiągnąć dzięki temu protokołowi. Wykorzystując komórki HeLa przetwarzane naszą metodą barwienia trójkolorowego dla H3K9me3, H3K27ac i polimerazy RNA II, demonstrujemy możliwości analityczne umożliwione przez tę metodę. Heterochromatyna H3K9me3 stanowi idealny system odniesienia, biorąc pod uwagę udokumentowane dowody na organizację koncentrycznej chromatyny w skali 200 nm z wcześniejszych badań superrozdzielczości 23,28,35. Analiza rozpoczyna się od identyfikacji domen heterochromatynowych na podstawie DBSCAN, które następnie są kategoryzowane według efektywnego promienia: małe domeny (25-40 nm), domeny średnie (40-80 nm) oraz duże domeny (80-253 nm). Ta stratyfikacja rozmiaru uwzględnia udokumentowaną heterogeniczność wymiarów domen pakujących DNA, ze średnimi domenami o promieniu około 80 nm25. Pomiary odległości wykorzystują okno przeszukiwania promienia klastra 1,5x (Rysunek 2B u góry) do rejestrowania sygnałów euchromatyny i polimerazy bliższych (Rysunek 3A,B).

Reprezentatywne wyniki pokazują, że zarówno H3K27ac, jak i polimeraza RNA II konsekwentnie lokalizują się blisko granic heterochromatyny we wszystkich kategoriach domen, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami 28,44 oraz modelami lokalizacji transkrypcji względem domen chromatynowych 23,35,45,46. Analiza ilościowa ujawnia średnie pozycje bardzo blisko peryferii domen: duże domeny wykazują H3K27ac na -1,0 nm oraz polimerazę RNA II na 8,4 nm od granic, podczas gdy mniejsze domeny wykazują porównywalne powiązania obwodowe z drobnymi różnicami pozycji. Pomiary te wskazują, że aktywne pierwiastki chromatyny koncentrują się na granicy między domenami represyjnymi a permissywnymi, a nie są całkowicie wykluczane. Wspólna analiza gęstości pokazuje zdolność protokołu do ujawniania sprzężenia przestrzennego między obiektami współoznaczonymi (rysunek 3C-F). Analiza względem domen heterochromatynowych wykazuje szczytową gęstość stawów występującą tuż poza granicami domen (r/r₀> 1), co wskazuje na preferencyjną współlokalizację polimerazy H3K27ac-RNA II w obszarach obwodowych (rysunek 3G-I). Wyniki te pokazują, jak ten proces barwienia i analizy może pomóc w badaniu złożonych relacji przestrzennych w gęstych środowiskach.

figure-results-1
Rysunek 1: Trzy kolorowe obrazy użytych komórek. Trójkolorowe zdjęcia (A) fibroblastu BJ, (B) HeLa i (C) MCF10A. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Ramy analizy ilościowej dla organizacji przestrzennej celów względem klastrów heterochromatyny. (A) Pipeline analizy dla wielokanałowych danych SMLM wykorzystanych w tym badaniu. (B) Schemat obliczeń odległości do peryferii dla zidentyfikowanych klastrów heterochromatyny oraz metoda Joint Affinity Counting. Obie metody służą do ilościowego określenia układu dwóch celów względem struktury klastra heterochromatyny. (C) Przykładowe rozkłady rozpraszania wokół specyficznych klastrów heterochromatyny użyte w badaniu34 do określenia odrębnych organizacji biologicznych struktur docelowych (skupionych w domenie, ws wokół domeny, ws niepowiązanych i losowo rozmieszczonych). (D) Odległość do histogramu peryferyjnego dla centralnie skupionych, losowo rozmieszczonych i toroidalnie rozkładających się oraz (E) Krzywe powinowactwa wspólnego dla przypadków symulacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Ilościowe przestrzenne zależności markerów transkrypcji wokół domen histonowych. (A) Wyniki histogramu odległości do obwodów dla przykładowych danych biologicznych wieloznakowanych komórek HeLa. Dla małych (<40 nm), średnich (40-80 nm) i dużych (>120 nm) domen dla RNAPII i (B) H3K27ac względem klastrów H3K9me3. (C-E) Przykładowe obrazy dla trzech obrazów dSTORM komórek HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p), z obrazem wstawionym i powiększonym dla jednej domeny. (F) Otoczka wypukła (czerwona) pasująca do dziedziny przedstawionej w E, z strefą analizy na szaro. (G) Wykresy powinowactwa dla RNAPII względem H3K27ac i H3K27ac (H) względem RNAPII w analizie ROI dla wszystkich domen w danych średniej wielkości w zbiorze danych. (I) Wspólna gęstość RNAPII i H3K27ac w analizie ROI dla wszystkich średniej wielkości dziedzin. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten trzykolorowy protokół SMLM stanowi znaczący postęp w naszej zdolności do badania organizacji chromatyny w gęstym środowisku jądrowym. Sekwencyjne podejście do znakowania immunofluorescencji, połączone z analizą przestrzenną chmur punktów, która wykorzystuje szacunki lokalizacyjne jako punkty jako podstawę analizy, dostarcza naukowcom potężnego narzędzia do badania relacji nanoskalowych między różnymi modyfikacjami chromatyny a aktywną maszyną transkrypcyjną, które wcześniej były niewykrywalne za pomocą konwencjonalnych technik mikroskopii.

Strategia sekwencyjnego barwienia protokołu rozwiązuje fundamentalne wyzwania związane z obrazowaniem jądrowym z udziałem wielu celów. W przeciwieństwie do struktur cytoplazmatycznych lub związanych z membranami, które są stosunkowo rzadkie, cele chromatyny jądrowej występują w niezwykle dużej gęstości i nakładających się domenach przestrzennych. Nasze zmodyfikowane podejście blokujące, polegające na włączeniu surowicy z wtórnych przeciwciał po każdej rundzie znakowania, skutecznie zapobiega krzyżowej reakcji między parami przeciwciał, zachowując jednocześnie specyficzność docelową. Inkubacje nocne w temperaturze 4°C zapewniają pełne przenikanie przeciwciał w całej objętości jądrowej, co jest kluczowe dla osiągnięcia jednolitej gęstości znakowania niezbędnej do ilościowej analizy SMLM. Protokół ten niezawodnie generuje obrazy o rozdzielczości 15-20 nm na wielu liniach komórkowych, co czyni go szeroko stosowalnym w badaniach organizacji chromatyny.

Poniżej znajdują się wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów podczas sesji obrazowania. Jeśli jądra nie bielą, najprawdopodobniej przyczyną jest niewystarczająca intensywność lasera w próbce, co może być spowodowane niskim poziomem mocy lub nieprawidłowym kątem TIRF; w takim przypadku należy zdiagnozować problem poprzez sprawdzenie ustawienia lasera, zwiększenie mocy lasera i dokładne ustawienie kąta TIRF. Jeśli mrugnięcia w jądrze są bardzo rzadkie, ale pozostają stale jasne, oznacza to, że jądra nie zostały wystarczająco wybielone. Jeśli mrugnięcia są bardzo rzadkie, a jądra w ogóle nie są widoczne, najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest nieudane barwienie i należy sprawdzić odczynniki oraz przeciwciała przed powtórzeniem protokołu. Natomiast jeśli liczba mrugnięć jądrowych jest bardzo wysoka (co jest pożądane), potrzebny jest dłuższy czas wybielania, aż pojedyncze, dobrze rozdzielone mrugnięcia pojedynczych cząsteczek zostaną wizualnie rozpoznane. W konwencjonalnych eksperymentach SMLM odpowiednią gęstość znakowania można często oszacować za pomocą dobrze zdefiniowanych struktur odniesienia, takich jak mikrotubule; jednak chromatyna wykazuje wysoce zróżnicowaną organizację i brakuje jej jasno określonej struktury podstawowej, co utrudnia takie oszacowanie. Na podstawie optymalizacji empirycznej i wcześniejszych doświadczeń zapewniamy, że efektywna gęstość znakowania osiąga około 100 lokalizacji na μm², co umożliwia solidną rekonstrukcję domen pakowania chromatyny. W naszym protokole nie stosowaliśmy żadnych wskaźników powierniczych, ale zalecaliśmy, czy użytkownicy je mają. W naszych eksperymentach przesunięcia boczne pozostają w granicach 0,2 piksela (mniej niż ~5 nm), co można pominąć. Dlatego nie stosowaliśmy markerów powierniczych.

Wybór H3K9me3, H3K27ac oraz polimerazy RNA II dostarcza uzupełniających informacji o organizacji chromatyny na poziomie nanoskalowym. H3K9me3 służy jako idealne odniesienie przestrzenne, ponieważ tworzy dyskretne, dobrze zdefiniowane klastry reprezentujące konstytutywną heterochromatynę i można je wiarygodnie identyfikować za pomocą zautomatyzowanych algorytmów klastrowania. H3K27ac oznacza chromatynę związaną z wzmacniaczem, która aktywnie uczestniczy w regulacji genów, podczas gdy polimeraza RNA II bezpośrednio wskazuje miejsca aktywnej transkrypcji. Razem te trzy cele pozwalają zbadać, jak mechanizmy transkrypcyjne i modyfikacje chromatyny regulacyjnej organizują się względem obszarów heterochromatycznych w architekturze jądrowej.

Ramy analizy chmury punktów odpowiadają na kluczowe ograniczenia wcześniejszych badań organizacji chromatyny, umożliwiając kompleksową analizę przestrzenną w gęstych środowiskach jądrowych. Tradycyjne metody porównania parowego nie są w stanie uchwycić złożonych relacji przestrzennych, które pojawiają się, gdy wiele modyfikacji chromatyny współistnieje w tych samych obszarach jądrowych. Nasze podejście wykorzystuje wspólną analizę gęstości, aby ujawnić, gdzie H3K27ac i polimeraza RNA II współlokalizują się względem klastrów H3K9me3, dostarczając informacji ilościowych, których nie można uzyskać z oddzielnych eksperymentów dwukolorowych.

Reprezentatywne wyniki konsekwentnie pokazują spójny model organizacyjny, a nie ścisłą kompartmentalizację chromatyny. Zarówno H3K27ac, jak i polimeraza RNA II lokalizują się preferencyjnie na obrzeżach klastrów heterochromatyny w różnych rozmiarach domen, a pomiary ilościowe pokazują położenie w odległości do 10 nm od granic klastra, co wspiera ustalenia innych grup o podobnych metodach i modelach transkrypcji 23,28,35,45,46 . Analiza gęstości łącznej ujawnia, że aktywne mechanizmy transkrypcyjne i chromatyna związana z wzmacniaczami najczęściej łączą się w obszarach otaczających heterochromatyczne klastry. Wyniki te podważają proste modele separacji fazowej i wspierają zintegrowane zasady organizacyjne, w których różne modyfikacje chromatyny zachowują bliską odległość przestrzenną, zamiast tworzyć odrębne, oddzielne przedziały.

Modułowa konstrukcja protokołu umożliwia badanie różnorodnych pytań dotyczących biologii chromatyny poprzez podstawianie celów, zachowując jednocześnie te same ramy analityczne. Badania nad czasem replikacji mogą zastępować białka cyklu komórkowego, takie jak proliferacyjny antygen komórkowy jądrowy (PCNA) i mini chromosomowy maintenance (MCM), podczas gdy badania odpowiedzi na uszkodzenia DNA mogą koncentrować się na γH2AX i czynnikach naprawczych. Badania cyklu komórkowego mogą dotyczyć modyfikacji histonów zmieniających się podczas podziału, a badania różnicowania mogą koncentrować się na znakach epigenetycznych związanych z zaangażowaniem w linię genetyczną. Podejście sekwencyjnego oznaczania uwzględnia dowolną kombinację białek jądrowych lub modyfikacji chromatyny, dla których istnieją wiarygodne przeciwciała, ograniczone głównie przez zgodność spektralną i czynniki krzyżowej reaktywności. Ta elastyczność pozwala badaczom rozwiązywać fundamentalne pytania dotyczące dynamiki chromatyny podczas różnych procesów komórkowych, jednocześnie zachowując możliwości ilościowej analizy przestrzennej.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy tego protokołu nie mają żadnych ujawnień ani konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty NIH U54CA268084, U54CA261694 i R01CA228272, granty National Science Foundation EFMA-1830961 i CBET-2430743 oraz wsparcie filantropijne od Roba i Kristin Goldman, pana Davida Sachsa oraz Christina Carinato Charitable Foundation.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 CCD mnożący elektrony;AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
Albumina surowicy bydłaSigma AldrichA7030Używa się go do blokowania i mycia buforów. Nie przechowuj bufora blokującego opartego na BSA dłużej niż 1 miesiąc w wysokości 4 stopni; C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., model MGL-FN-532 (532 nm)  PSU-H-LED  https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Spójna skrzynka laserowa OBIS (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm)  Spójność1228877 Lasery kolimowały z 3– 10 kW/cm³ średnia moc w próbce, minimum 10 000 klatek zebranych na kanał o długości fali with  10– 30  MS&NBSP; czas nabycia.
DABCO (1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktanowy)SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
Woda destylowanaNANAKażda woda destylowana jest w porządku 
DTT (Ditiothreitol), 1MSigma43816NA
Osiem dobrze komorowanych szkł osłonowychCellvisC8-1.5H-NMoże to być dowolna szklana płyta dna, ale objętości muszą być regulowane w zależności od naczynia.
Kozy antymyszy AF568Thermo FisherA11004Stężenie wywarowe: 2 mg/mL
Stabilność po oznakowaniu: 2– 3 dni
Kozy antykrólikowe AF647Thermo FisherA21245Stężenie zapasowe: 2 mg/mL
Stabilność po oznakowaniu: 4– 5 dni
Kozi antyszczurzy A488Thermo FisherA11006Stężenie wywarowe: 2 mg/mL
Stabilność po oznakowaniu: 2– 3 dni
Przeciwciało pierwotne H3K27acThermo FisherMA5-23516Stężenie zapasowe: 1,0 mg/mL 
Przeciwciało główne H3K9me3 & nbsp;AbcamAB1769156Stężenie w zapasie: 1,287 mg/mL 
Wysokoklarowna polimerpropylenowa stożkowa rurka 15 mL   Corning  352096Stosowany w roztworach utrwalających i chłodzących 
Stożkowa rurka poli-propylenowa o wysokiej klarowności 50 mLCorning352070Używany do pracy 40 mL buforów blokujących i myjących
Kwas solny (HCl), 12MSigma258148NA
Nikon Eclipse Ti-E z systemem perfekcyjnej ostrości NIikonTI-DH 611392 Mikroskop odwrócony 
Nikon SR APO TIRF, 100x powiększenie, 1,49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Zwykłe serum koziegoAbcamAB7481-1002Używam po pierwszej etykietie. Powinny być obecne w buforach blokujących i prających
Paraformaldehyd 16 % Nauki o mikroskopii elektronowej15710Stosuje się w roztworze utrwalającym, który powinien zostać zużyty w ciągu 2 tygodni od przygotowania. Chronić się przed światłem w kątach 4 i stopnie; C
Fosforanem buforowana sól fizjologiczna (PBS) 10XAmbionAM9625NA
Pipette Tips 1000 uLSureOne02-707-404Każda końcówka pipety jest w porządku, o ile odpowiednie dla objętości
RNAPII-PS2AbcamAB252855Koncentracja w magazynie: 0,98 mg/mL
Borowodnik soduThermo FisherS678-10Używaj świeżego do chłodzenia bufora za każdym razem.
Wodorotlenek sodu (NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
Siarczyn soduSigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher 28314NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).">Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  2. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).">Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).
  3. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).">Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).
  4. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).">Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).
  5. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).">Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  6. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).">Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).
  7. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).">Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).
  8. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).">Wang, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).
  9. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).">Zhang, Y., et al. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).
  10. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).">Daugird, T. A., et al. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).
  11. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).">Kant, A., et al. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).
  12. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).">Esa, A., et al. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).
  13. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).">Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  14. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).">Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).
  15. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).">Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).
  16. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).">Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).
  17. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  18. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).">Castells-Garcia, A., et al. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).
  19. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).">Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).
  20. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).">Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).
  21. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).">Davidson, I. F., Peters, J. M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).
  22. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).">Schueder, F., et al. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).
  23. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).">Miron, E., et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).
  24. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).">Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).
  25. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).">Li, Y., et al. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).
  26. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).">Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).
  27. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).">Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  28. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).">Li, Y., et al. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).
  29. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).">Li, W. S., et al. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).
  30. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).">Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  31. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).">Li, A., et al. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).
  32. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).">Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).
  33. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).">Satam, H., et al. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).
  34. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).">Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).
  35. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).">Almassalha, L. M., et al. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).
  36. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).">Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).
  37. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).">Xu, J., et al. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  38. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).">Xu, J., Liu, Y. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).
  39. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).">Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).
  40. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).">Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  41. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).">Weidner, J., et al. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).
  42. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).">Nieves, D. J., et al. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).
  43. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).">Hyun, Y., Kim, D. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).
  44. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).">Markaki, Y., et al. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).
  45. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).">Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).
  46. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).">Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationChromatin StructureSuper Resolution MicroscopySequential ImmunolabelingDense Nuclear EnvironmentThree Color SMLMEpigenetic MarksAntibody StainingFluorophore SelectionSpatial Analysis Chromatin

Related Articles