Method Article

Rozwój i skuteczność enzymatywnie reagujących nanocząsteczek skwalen-chidamidu w leczeniu raka trzustki

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę i charakteryzację nanocząsteczek skwalen-chitosanu modyfikowanych kwasem folowym, ocenia ich enzymatyczne uwalnianie leków i ich wchłanię komórkową in vitro oraz stosuje je w celu wspomagania terapii raka trzustki poprzez celowane podawanie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący ograniczonego przenikania leków drobnocząsteczkowych wewnątrzguzowych spowodowanego gęstą macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Proleki mają duży potencjał do pokonania tego wyzwania poprzez zwiększenie penetracji leków i skuteczność w zwalczaniu nowotworów. Skwalen (SQ), naturalny prekursor biosyntezy cholesterolu o doskonałym bioasekuratywności i biokompatybilności, może poprawić kompatybilność błonową leków hydrofilowych oraz zwiększyć ich pobieranie komórek w połączeniu z chemioterapeutami lub bioaktywnymi małymi cząsteczkami. W tym badaniu opracowaliśmy nowatorski lipofilowy system prolekowy oparty na SQ: hydrofilowy lek przeciwnowotworowy chidamide (CHI) został sprzężony z SQ za pomocą wiązania amidowego – sprzężenia reagującego na trzustkę i katepsinę B (kluczowe enzymy nadekspresjonowane w mikrośrodowisku PDAC). Ta koniugacja dała amfifilowy prolek SQ-CHI, który następnie samoorganizował się w nanocząstki zmodyfikowane folianem (FA) (FA-SQ-CHI NP). Zoptymalizowane NP wykazywały jednolitą średnicę hydrodynamiczną 173,3 ± 1,5 nm, wskaźnik polidyspersji (PDI) 0,181 ± 0,18, wysoką zdolność ładowania leków na poziomie 59,0% ± 0,77% oraz stabilny potencjał Zeta -13,10 ± 0,86 mV. Badania in vitro wykazały, że NP osiągnęły 80,2% ± 4,22% skumulowanego uwalniania leku w ciągu 72 godzin w obecności 0,25% trzustki, podczas gdy tylko 33%-38% uwalniania zaobserwowano w buforach skorygowanych o pH (pH 4,5 lub 7,4) bez enzymów. Testy pobierania komórek potwierdziły, że modyfikacja FA znacząco zwiększyła efektywność dostarczania wewnątrzkomórkowego, z 1,8-2,3-krotnie wyższą intensywnością fluorescencji w komórkach PDAC (PSN-1 i CFPAC-1) w porównaniu do NP nieukierunkowanych po 12-24 godzinach. Obecny protokół zapewnia kompleksową metodologię syntezy i charakteryzacji proleku, ocenę in vitro kinetyki uwalniania reagującej na enzymy oraz analizy porównawcze skuteczności terapeutycznej i penetracji tkanek, podkreślając kluczowe zalety nanonośnika: ukierunkowane dostarczanie, wysokie obciążenie lekami oraz kontrolowane uwalnianie wywołane enzymami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) to wysoce złośliwy guz przewodu pokarmowego, o wskaźniku zachorowalności niemal równym śmiertelności oraz 5-letnim przeżyciu wynoszącym jedynie 8%-9%1. Złożone mikrośrodowisko nowotworowe (TME) jest cechą rozpoznawczą PDAC2. Składa się głównie z nieprawidłowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aktywowanych fibroblastów związanych z nowotworem (CAF) oraz głęboko immunosupresyjnego środowiska komórkowego. ECM PDAC jest bogaty w kolagen typu I. Zarówno zmieniona zawartość, jak i nieprawidłowa architektura sprzyjają postępowi guza i wiążą się ze złym rokowaniem3. CAF są najliczniejszymi komórkami stromalnymi i składają się z funkcjonalnie odrębnych podtypów, takich jak matrycowe produkujące myCAF oraz zapalne iCAF, które wykazują plastyczność fenotypową4.

Immunologicznie PDAC TME jest zdominowany przez komórki szpikowe pronowe. Limfocyty przeciwnowotworowe są rzadkie lub dysfunkcyjne. Dojrzałe limfocyty grupy B również przyczyniają się do immunosupresji 3,4. Łącznie te składniki tworzą wiele barier terapeutycznych. Gęsty stroma, charakteryzujący się wysokim ciśnieniem płynu śródmiąższowego, tworzy znaczącą barierę penetracyjną, która poważnie utrudnia podawanie środków terapeutycznych do obszarów głębokich guzów, co znacząco ogranicza skuteczność kliniczną leków chemioterapeutycznych5. W związku z tym kluczowe jest opracowanie systemów dostarczania leków zdolnych do pokonania tej bariery stromalnej i głębokiego przenikania w tkankę nowotworową trzustki.

W ostatnich latach skwalen (SQ), naturalny prekursor biosyntezy cholesterolu, zyskał znaczną uwagę ze względu na doskonałe bezpieczeństwo biologiczne i biokompatybilność6. Jako wysoce hydrofobowa, SQ może być sprzężona z lekami hydrofilowymi, tworząc amfifilowe proleki, co poprawia biokompatybilność hydrofilowych leków małopąsteczkowych z błonami komórkowymi i zwiększa ich efektywność wchłaniania7. Wcześniejsze badania wykazały, że SQ może być kowalencyjnie sprzężony z różnymi lekami chemioterapeutycznymi, takimi jak cisplatyna, paklitaksel i gemcytabina, tworząc pro-nanocząstki o wysokiej ładowności leku, co poprawia dostarczanie leków do guzów litych 8,9. Te właściwości podkreślają szeroki potencjał zastosowania SQ w rozwoju systemów dostarczania leków.

Aby poprawić celowanie nowotworów, badanie wykorzystuje kwas foliowy (FA) jako ligand celujący. FA to witamina rozpuszczalna w wodzie, kluczowa dla metabolizmu jednowęglowego, biosyntezy10, homeostazy redoks11 oraz reakcji metylacji12. Koniugacja FA za pomocą grup karboksylowych z nanonośnikiem umożliwia specyficzne rozpoznanie i wiązanie z receptorem foliowym (FR), a następnie endocytozą pośredniczoną przez receptory13. Wykorzystując zwiększoną przepuszczalność i efekt retencji komórek nowotworowych, Zheng i in.14 ocenili ekspresję receptora folianowego α (FRα) w raku trzustki, prawidłowej trzustce, sąsiednich tkankach oraz przewlekłym zapaleniu trzustki za pomocą metod Western blotting i immunohistochemii, a także przeanalizowali korelację z cechami kliniczno-patologicznymi. FRα był wyrażany w 94,7% (72/76) przypadków raka trzustki, co koreluje z przerzutami, ale nie występował w prawidłowych tkankach trzustki. Nanocząstki zmodyfikowane przez FA-mogą selektywnie gromadzić się w tkankach z FR-dodatnim, umożliwiając terapię ukierunkowaną na molekularną stronę.

Chidamid (CHI) to nowy inhibitor deacetylazy histonowej. Badania przedkliniczne wykazały, że wykazuje silną aktywność przeciwnowotworową przeciwko guzom litemu, takim jak rak trzustki i piersi, oraz może odwrócić oporność na leki w komórkach nowotworowych15,16. Jednak jego silna hydrofilowość wiąże się z niską efektywnością penetracji w mikrośrodowisku nowotworowym oraz słabym rozmieszczeniem w tkankach guzowych litych, co poważnie ogranicza jego potencjał kliniczny terapeutyczny dla raka trzustki5. Wykorzystując chidamid (CHI) jako lek modelowy, badanie to proponuje przygotowanie samoorganizujących się nanocząstek poprzez sprzężenie CHI z SQ i późniejszą modyfikację FA. Strategia ta ma na celu zwiększenie skuteczności przeciwnowotworowej CHI w leczeniu raka trzustki poprzez przezwyciężenie jego słabego przenikania do mikrośrodowiska guza oraz nieoptymalnego rozmieszczenia w tkance guzowej litego. Ponadto, poprzez ocenę skuteczności in vitro CHI w liniach komórkowych raka trzustki, oczekuje się, że to podejście znacząco poprawi penetrację i cytotoksyczne działanie CHI – reprezentatywnego hydrofilowego leku małocząsteczkowego – w mikrośrodowisku guza trzustki, zapewniając tym samym podstawę eksperymentalną do prowadzenia terapii opartej na CHI.

Nasze badanie rozwija procedury eksperymentalne przygotowujące samoorganizujące się nanocząstki proleku CHI-SQ-PEG-FA do leczenia raka trzustki. Szczegółowo opisujemy optymalizację i charakterystykę procesu przygotowania nanocząstek CHI-SQ-PEG-FA, wraz z badaniami in vitro uwalniania leków. Proces ten obejmuje: najpierw optymalizację formuły za pomocą eksperymentalnego podejścia jednoczynnikowego oraz określenie optymalnego rozmiaru cząstek i ładunku leku; po drugie, charakteryzację nanocząstek za pomocą testów UPLC i MTS; oraz wreszcie, ustanowienie in vitro współkulturowego modelu sferoidalnego guza. Wykorzystując kumarynę-6 (C6) jako sondę fluorescencyjną w celowanych nanocząstkach, dodatkowo walidujemy penetrację i rozmieszczenie nanocząstek w trójwymiarowych sferoidach nowotworowych oraz pozyskujemy istotne dane.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza SQ-CHI i SQ-PEG-FA

  1. Synteza SQ-CHI: Waż 120,4 mg (0,3 mmol) kwasu 1,1',2-tris-norskqualenonowego i rozpuszcza go w 1 mL N, N-dimetyloformamidu (DMF). Kolejno dodaj NHS (46 mg, 0,4 mmol) i EDCI (72 mg, 0,38 mmol) i pozwól reakcji przebiegać przez 90 minut pod ochroną azotową.
  2. Rozpuszcz chidamid (58,56 mg, 0,15 mmol) w 1 mL DMF i dodaj go kropelami do mieszaniny reakcji. Mieszanie reakcji w temperaturze pokojowej pod atmosferą azotową przez 72 godziny.
  3. Po zakończeniu odparuj rozpuszczalnik pod obniżonym ciśnieniem przy 5-15 kPa, aby uzyskać produkt surowy. Oczyść produkt surowy za pomocą chromatografii kolumnowej błyskawicznej z użyciem elucii gradientowej DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Weryfikacja strukturalna SQ-CHI: Włóż syntetyczny produkt SQ-CHI do szklanej fiolki i susz go pod próżnią w osuszacz przez 24 godziny. Rozpuszcz produkt w około 1 mL deuterowanego chloroformu (CDCl3) i przelej go do probówki NMR. Wykonaj analizę NMR 1H w celu potwierdzenia struktury chemicznej produktu17.
  5. Synteza SQ-PEG-FA: Rozpuścić 41,12 mg kwasu 1,1',2-tris-norskwalenonowego w 35 μL DMF. Kolejno dodaj N-hydroksukcynamid (NHS, 15,71 mg) oraz 1-etylo-3-(3-dimetylominopropylowy) karbodiamid (EDCI, 24,59 mg) do tego roztworu.
  6. Pozwól reakcji przebiegać przez 90 minut pod atmosferą azotową. Rozpuść 20 mg FA-PEG-NH2 w 35 μL DMF i dodać kropelo do mieszaniny reakcji.
  7. Mieszaj powstałą mieszankę w temperaturze pokojowej przez 72 godziny pod azotem. Oczyść produkt surowy rurką wirówki MWCO o mocy 3 kDa o mocy 5 200 x g przez 30 minut, aby usunąć niezreagowane kwasy wolne. Umieść oczyszczony roztwór wodny kompleksu SQ-PEG-FA w szklanej fiolce i zamroz go w temperaturze -50 °C. Liofilizuj wcześniej zamrożony roztwór w liofilizacji, aby uzyskać kompleks SQ-PEG-FA jako liofilizowany proszek.

2. Weryfikacja strukturalna SQ-PEG-FA

  1. Umieść liofilizowany kompleks SQ-PEG-FA w rurce wirówki o pojemności 2 mL i następnie wysusz go pod próżnią w osuszacu przez 24 godziny. Rozpuszcz produkt w około 1 mL deuterowanego dimetylosulfenenu (DMSO-d6) i przelej go do probówki NMR. Wykonaj analizę NMR 1H w celu potwierdzenia struktury chemicznej kompleksu.
  2. Optymalizacja przygotowania i charakterystyka SQ-CHI-PEG-FA NP
  3. Zważ 6,64 mg SQ-CHI i rozpuści go w 2 mL etanolu absolutnego, aby przygotować roztwór bulwarowy o stężeniu 3,32 mg/mL (4,3 μM).
  4. Dodaj roztwór etanolowy SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 lub 0,05 mL) kroplami do 1 mL wody zdejonizowanej pod mieszaniem. Mieszaj przez 5 minut, a następnie usuń etanol przez odparowanie o obniżonym ciśnieniu. Sonikować powstałą mieszaninę przez 30 minut, aby uzyskać zawiesinę nanocząsteczek CHI-SQ. Zmierz średnicę hydrodynamiczną i wskaźnik polidyspersji (PDI) nanocząstek za pomocą Zetasizera, aby zidentyfikować optymalną formułę18.
  5. Dodaj 0,1 mL roztworu etanolowego SQ-CHI kroplami do 1 mL wody dejonizowanej po różnych okresach mieszania (0, 5, 10 lub 20 minut). Po odpowiednim okresie mieszania należy usunąć etanol przez odparowanie obniżające ciśnienie, a następnie sonakować przez 30 minut, aby uzyskać zawiesiny nanocząsteczek CHI-SQ. Zmierz średnicę hydrodynamiczną i PDI, aby określić optymalny czas mieszania.
  6. Dodaj 0,1 mL roztworu etanolowego SQ-CHI kroplami do 1 mL wody dejonizowanej pod mieszaniem przez 5 minut. Po mieszaniu usuń etanol poprzez parowanie obniżające ciśnienie. Sonikować powstałą mieszaninę przez różne okresy (0, 5, 20 lub 30 min), aby uzyskać zawiesiny nanocząsteczek CHI-SQ. Zmierz średnicę hydrodynamiczną i PDI, aby określić optymalny czas sonizacji.
  7. Potwierdź optymalne warunki na podstawie powyższych wyników. Tutaj uzyskany stosunek objętości wody do roztworu bulwarowego = 10:1, czas mieszania = 5 min, a czas sonakacji = 30 min. Powtarzaj wszystkie eksperymenty niezależnie w trzech egzemplarzach, aby zapewnić niezawodność.
  8. Stosuj metodę jednoczynnikową, zachowując pozostałe parametry na stałym poziomie. Kolejno zmieniać następujące czynniki, aby ocenić ich wpływ na rozkład wielkości cząstek i potencjał Zeta nanocząstek: stosunek mas składników (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), współczynnik objętości fazowej (faza wodna: faza organiczna = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) oraz czas sonizacji (5, 15, 30, 45 min).
  9. Zgodnie z protokołem zoptymalizowanym mieszaj roztwory SQ-CHI i SQ-PEG-FA w określonym stosunku. Dodaj tę mieszankę kropelami do wody dejonizowanej przy stałym mieszaniu. Mieszaj przez 5 minut, aby dobrze wymieszać. Usuwanie etanolu przez odparowanie obniżające ciśnienie, a następnie 30-minutową sondę, aby uzyskać ostateczną zawiesinę nanocząsteczkową CHI-SQ-PEG-FA.
  10. Zmierz średnicę hydrodynamiczną, rozkład rozmiarów (PDI) oraz potencjał zeta nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła za pomocą laserowego analizatora rozmiarów cząstek. Obserwuj morfologię nanocząstek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM, powiększenie 150 000 razy) oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM, powiększenie 80 000 razy).
  11. Określenie zawartości ładunku leku za pomocą ultrawydajnej chromatografii cieczowej (UPLC)
  12. Ustaw warunki chromatograficzne następująco: kolumna C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); faza komórkowa: 0,1% roztwór wodny kwasu mrówkowego - acetonitryl (75:25, v/v); długość fali detekcyjnej: 258 nm; przepływ: 0,2 mL/min; temperatura kolumny: 23 °C; objętość wtrysku: 5 μL; Czas trwania: 10 min.
  13. Przebuduj zawieszenie CHI-SQ-PEG-FA NP i wiruj je w stężeniu 7 500 x g przez 30 minut. Zbieraj supernatant i filtruj go przez mikroporowatą błonę o średnicy 0,22 μm. Użyj powstałego filtratu jako roztworu testowego. Wstrzyknąć i przeanalizować roztwór testowy w określonych warunkach chromatograficznych. Oblicz zawartość ładunku leku w nanocząstkach na podstawie zmierzonego stężenia CHI w filtracie.

3. Badanie uwalniania leków in vitro

  1. Dokładnie pipetować 2 mL aliquot świeżo przygotowanego roztworu CHI lub zawiesiny nanocząstek CHI-SQ-PEG-FA do worka dializacyjnego z progiem masy cząsteczkowej 3 kDa.
  2. Zanurz worek dializacyjny w środku uwalniającym zawierającym różne stężenia trzustki (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). W ustalonych odstępach czasowych (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h) pobierać próbki po 1 ml z podłoża uwalniającego i natychmiast zastępować je równą ilością podgrzewanego świeżego podłoża, aby utrzymać warunki zanurzenia.
  3. Określ stężenie CHI we wszystkich próbkach metodą UPLC (warunki chromatograficzne określone w sekcji 3) i oblicz skumulowane uwalnianie leku.
  4. Użyj buforu octanowego amonu (pH 4,5) jako medium uwalniającego. Dokładnie pipetować 2 mL zawiesiny nanocząsteczkowej do worka dializacyjnego (3 kDa). Do woreczka dializacyjnego dodaj różne jednostki aktywności (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) katepsyny B. Zanurz worek w 40 mL medium uwalniającego i inkubuj w shakerze o stałej temperaturze w temperaturze 37 ± 0,5 °C i 75 obr./min. W ustalonych punktach czasowych (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h) pobierz próbki po 1 ml i natychmiast zamień je na równą objętość świeżego, podgrzanego medium o tym samym pH, aby utrzymać równowagę systemu.
  5. Filtruj pobrane próbki przez mikroporowatą błonę o średnicy 0,22 μm. Przeanalizuj filtraty za pomocą UPLC, aby określić stężenie leku. Oblicz skumulowany procent uwalniania CHI i narysuj profile uwalniania leków.
  6. Dokładnie podaj pipetą 2 mL aliquotu albo roztworu CHI, albo zawieszenia CHI-SQ-PEG-FA NP do worka dializacyjnego (3 kDa MWCO). Zanurz worek dializacyjny w środku uwalniającym zawierającym różne stężenia trzustki (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). W wyznaczonych punktach czasowych (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h) pobrać próbki 1 mL i natychmiast zastąć je równą objętością świeżego, wcześniej podgrzanego medium uwolnienia, aby utrzymać warunki zanurzenia.
  7. Ilościowo określ stężenie leku w próbkach za pomocą UPLC. Oblicz skumulowane uwalnianie leku i generuj krzywe uwalniania.
  8. Ocena stabilności nanocząstek w PBS
  9. Mieszaj CHI-SQ-PEG-FA NP z PBS (pH 7,4) w stosunku 1:20 (v/v). Inkubuj mieszankę w wstrząsance o stałej temperaturze w temperaturze 37 ± 0,5 °C i 100 obr./min. Pobieraj próbki w godzinach 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 godzin, aby zmierzyć średnicę hydrodynamiczną i potencjał Zeta.
  10. Badanie proliferacji komórek metodą MTS
  11. Komórki raka trzustki PSN-1 zostały wyhodowane w pełnym nośniku RPMI-1640. Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu były pobierane trawienie z użyciem 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C i zawieszane do gęstości 4-6 x 104 komórek /mL w pełnym nośniku. Zawiesina została zasiewana na płytach 96-dołkowych po 100 μL na odwór i prehodowana przez 2 godziny w inkubatorze 37 °C z zawartością 5%CO2, aby umożliwić całkowitą przyczepność komórek.
  12. Aspiruj oryginalne medium kulturowe. Ustal grupę kontrolną (puste medium hodowlane) oraz wiele gradientów stężeń grup chidamidu (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), z trzema odwiertami replikacyjnymi na grupę. Dodaj 100 μL pustego lub lekowego medium do każdego dołku, a następnie przenieś płytkę komórkową do inkubatora do kontynuacji hodowli. Grupy eksperymentalne należy traktować 100 μL świeżego medium zawierającego różne stężenia (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) SQ-PEG, wolnego CHI, CHI-SQ-PEG NP lub CHI-SQ-PEG-FA NP, podczas gdy grupa kontrolna otrzymuje równą objętość pustego nośnika. Po dalszej inkubacji przez 96 godzin usuń podłoże zawierające lek z każdego dołku.
  13. Dodaj 20 μL roztworu roboczego MTS do każdego dołku, a następnie inkubuj przez 4 godziny. Potrząsaj płytą z 96 dołkami przez 15 sekund, aby zapewnić jednorodność, a następnie natychmiast zmierz absorbancję (wartość A) każdej studni przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Oblicz tempo proliferacji komórek, odejmując wartość przedawkowania grupy pustej od wartości grupy leczonej lekami, dzieląc wynik przez różnicę między wartością przedawkowania grupy pustego medium a wartością przedawkowania grupy pustej, a następnie mnożąc przez 100.
  14. Ustanowienie in vitro współkulturowego modelu sferoidalnego guza
  15. Mieszaj komórki PSN-1 w fazie logarytmicznej wzrostu z komórkami HPSC w stosunku 2:7 i zasiewaj je na płytkach o ultra-niskim przyczepieniu 96 dołków o gęstości 5 000 komórek na dołek. Po utworzeniu sferoidy guza należy podleczyć sferoidy różnymi nanoformułami (CHI-SQ-PEG/C6 NP z kodmaryną 6 oraz CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP) lub DMSO (jako kontrolę) i współinkubować przez 48, 96 i 144 godziny w celu oceny skuteczności leku.
  16. Po inkubacji dodaj do każdej jamki równą objętość odczynnika żywotnego do każdego dołku. Umieść płytkę na orbitalnym wstrząsie i potrząsaj przez 15 minut, aby zapewnić pełną lizę, po czym następuje inkubacja w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
  17. Przelej lizat komórkowy na czarną płytkę z 96 dołkami. Zmierz sygnał chemiluminescencji o długości fali 562 nm za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłyt, aby ilościowo określić żywotność komórek.
  18. Badanie komórkowego pobierania nanocząstek
  19. Przygotuj celowane nanocząstki (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP) oraz niecelowane nanocząstki (CHI-SQ-PEG/C6 NP), z wykorzystaniem kumaryny-6 (C6) jako sondy fluorescencyjnej. Rutycznie hodować komórki PSN-1 w fazie logarytmicznej wzrostu przez 24 godziny, aby utworzyć monowarstwę. Rozpuść kumarynę 6 w etanolu, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 200 μg/mL. Wymieszaj 10 μL roztworu z SQ-CHI i SQ-PEG-FA (lub SQ-PEG) w stosunku 1:0,7, a następnie wstrzykuj kroplę po kropli do wody zdejonizowanej pod mieszaniem. Mieszaj przez 5 minut, usuń etanol przez odparowanie i sonikuj przez 30 minut. Na koniec oczyść przez ultrafiltrację (3 kDa, 12 000 obr./min, 20 min), aby uzyskać te produkty.
  20. Traktuj komórki następująco: grupy eksperymentalne otrzymują pożywkę wolną od surowicy zawierającą wolne C6, CHI-SQ-PEG/C6 NPs lub CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (z końcowym stężeniem CHI 5 μmol/L i stężeniem C6 2,6 μmol/L), podczas gdy grupa kontrolna otrzymuje równą objętość pustego środka.
  21. Po inkubacji przez 4, 12 i 24 godziny zasysaj medium zawierające lek. Barwi jądra komórek za pomocą 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI)19.
  22. Przeprowadz obserwacje pod mikroskopem fluorescencyjnym (40x, długość fali wzbudzenia Ex=360 nm, długość fali emisyjnej Em=477 nm). Oceń komórkowy pobór nanocząstek poprzez pomiar intensywności fluorescencji kumaryny-6.

4. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadz wszystkie eksperymenty z co najmniej 3 replikacjami, aby uzyskać dane przedstawione w badaniu. Analizuj statystyki za pomocą oprogramowania GraphPad Prism. Przedstawić dane eksperymentalne jako średnią ± błędu standardowego średniej (SD) i porównać grupy za pomocą testu Student's T, jednokierunkowego ANOVA lub testu Wilcoxona, jeśli to stosowne. Ustaw próg istotności statystycznej na P < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to z powodzeniem zaprojektowało i systematycznie oceniło nowatorski system dostarczania ukierunkowanego nanoleku – Chidamide Squalenylation Prodrug-based Self-Assembled Nanoparticles (CHI-SQ-PEG-FA NPs; Rysunek 1). Zsyntetyzowaliśmy CHI-SQ-PEG-FA NP (Rysunek 2) i systematycznie oceniliśmy wpływ różnych parametrów, w tym stosunku faz oleju do wody (Rysunek 3A), czasu mieszania (Rysunek 3B) oraz w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia praktyczny, krok po kroku przewodnik po wdrożeniu systemu o niskim talii opartego na samoorganizacji nanocząstek. Samoorganizujące się nanocząstki uzyskane w tym badaniu wykazywały regularny kształt sferyczny, dobrą dyspersję, jednolity rozmiar cząstek, wysoką wydajność ładowania leku i efektywność enkapsulacji oraz wykazywały satysfakcjonującą stabilność21. Zastosowano trójwymiarowy model kohodowania sferoidów guza (PSN-1/HPSC) do oceny penetracji nanocząstek, ujawni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty Fundacji Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang (LZ23H290001, LY19H280001); Granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82474338 i 82274364); Program współpracy Trzech Obszarów Wiejskich Prowincji Zhejiang oraz dziewięciu stron (2025SNJF075); a także w projekcie badawczym na rzecz dobrobytu publicznego Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); a także Ogólny Projekt Badawczy Departamentu Edukacji Prowincji Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% trypsyna-EDTAGibco (USA)25200072
1-Etylo-3-(3-dimetyloaminopropylowy) karbodiimid chlorowodorkowodowodorek (EDCI)Sigma-Aldrich (USA)E6383
2 mL fiolki kriogeniczneCorning (USA)430488
Płytki hodowli komórkowych z 96 dołkamiCorning (USA)3598
Absolutny etanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
AcetonChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2.5L
AcetonitrylTedia (USA)A998-4Klasa HPLC
Octan amonuChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
Bezwodny siarczan soduSigma-Aldrich (USA)31481
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoThermo Fisher Scientific, USA1380, 1332, 1356
Kolby hodowli komórkowejCorning (USA)CLS430372
Inkubator hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific, USAHERA51901126
chidamide(CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (Chiny)Czystość >95%
Cytation 5 wielomodowy czytnik mikropłytBioTek, USACYT5MV
DF-101S termostatyczna magnetyczna mieszadła grzewczaZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., Chiny
DichlorometanChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich (USA)D2650
dioksanAladyn (Chiny)D116156-5 ml
Medium DMEMGibco (USA)12100046
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (DPBS)Gibco (USA)14040141
Octan etyluChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
Eter etylowyChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B waga elektronicznaShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChinyFA2004B
Serum płodowe bydła (FBS)Gibco (USA)10099141C
Folian-poli(glikol etylenowy)-amina (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Chiny)PS2-NFA-2000
Kwas mrówkowyAladyn (Chiny)F112034Klasa HPLC
LiofilizacjaThermo Fisher Scientific, USA
Ludzka katepsina BSigma-Aldrich (USA)SRP0289
Linie komórkowe raka trzustki u człowieka (PSN-1, CFPAC-1)Amerykańska Kolekcja Kultury Typowej (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
Ludzkie komórki trzustkowe gwiaździste (HPaStec, HPSC)Amerykańska Kolekcja Kultury Typowej (ATCC)
Ludzka trypsynaSigma-Aldrich (USA)
Kwas solnyChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
Mikroskop odwróconyOlympus, JaponiaIX83
Zmodyfikowane medium Dulbecco Iscove'a (IMDM)Gibco (USA)12440053
IX 1000 wirowy mikser & nbsp;Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChinyIX 1000
MetanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
metanol Tedia (USA)MS1922-001Klasa HPLC
rurki mikrowirówki (1,5/2,0 mL)Axygen (USA)MCT-150-C
mikropipety (20, 100 i 1000 μ L)Thermo Fisher Scientific, USA4642050, 4642070, 4642090
System oczyszczania wody Mill-Q Millipore, USAZR0Q00800
  Zestaw do testów MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium)Promega (USA)G3582
N,N-dimetyloformamid (DMF)Aladyn (Chiny)
N-bromosukcynamid (NBS)Sigma-Aldrich (USA)B81255
N-hydroksukcynimid (NHS)Sigma-Aldrich (USA)56480
Optima Max ultrawirówka  Beckman, USA393490
Roztwór penicyliny/streptomycynyGibco (USA)15140-122
Kwas okresowySigma-Aldrich (USA)P7875
Eter roponośnyChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Fenazynowy metosiarczan (PMS)Sigma-Aldrich (USA)3180806
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco (USA)70011069
Poli(glikol etylenowy)-amina (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Chiny)PG2-AM-20k
RPMI-1640 średniGibco (USA)31800022
Proszek żelu krzemionkowegoSigma-Aldrich (USA)53698300 mesh
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich (USA)401676
Chlorek soduChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
Dichlorian soduSigma-Aldrich (USA)1.93689
SkwalenSigma-Aldrich (USA)Y0002131
Rurki do wirówek sterylnych (15 i 50 mL)Corning (USA)430791, 430828
Kwas siarkowyChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TetrahydrofuranChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4LPoziom analityczny
rurki odśrodkowe do ultrafiltracji (granica masy cząsteczkowej: 3,5 kDa)Beckman, USA344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles