Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie technologii mikrowytwarzania jest niezbędne do tworzenia rusztowań o powtarzalnej geometrii i stałej jakości do trójwymiarowej hodowli komórek. Technologie te oferują szeroki wachlarz zalet nie tylko w procesie produkcji, ale także w różnych zastosowaniach. Na rozmiar i kształt formowanych skupisk komórek można wpływać poprzez precyzyjną i powtarzalną architekturę mikrowytworzonego rusztowania, a tym samym kontrolować długość drogi dyfuzji składników odżywczych i gazów.1 Jest to niewątpliwie użyteczne narzędzie zapobiegające apoptozie i nekrozie komórek wynikającej z niewystarczającej podaży składników odżywczych i gazów lub z niedostatecznego usuwania metabolitów komórkowych.
Nasz polimerowy chip, nazwany CellChip, ma wymiary zewnętrzne 2 x 2 cm z centralnym obszarem mikrostrukturalnym. Obszar ten jest podzielony na macierz do 1156 mikrokontenerów o typowej długości krawędzi 300 m dla konstrukcji sześciennej (chip cp- lub cf-) lub o średnicy i głębokości 300 m dla konstrukcji okrągłej (chip r).2
Do tej pory do wytwarzania chipów mikrostrukturalnych stosowano tłoczenie na gorąco lub mikroodlew wtryskowy (w połączeniu z późniejszą pracochłonną obróbką części). W zasadzie mikroodlew wtryskowy jest jedną z niewielu technik replikacji opartych na polimerach, która do tej pory umożliwia masową produkcję mikrostruktur polimerowych.3 Jednak obie techniki mają pewne niepożądane ograniczenia wynikające z przetwarzania lepkiej stopki polimeru przy tworzeniu bardzo cienkich ścianek lub zintegrowanych otworów przelotowych. W przypadku CellChipu niezbędne są cienkie warstwy dolne, aby przebić polimer i zapewnić małe pory o określonym rozmiarze, służące do dostarczania komórkom pożywki hodowlanej, np. poprzez mikrofluidyczną perfuzję pojemników.
W celu przezwyciężenia tych ograniczeń oraz redukcji kosztów produkcji opracowaliśmy nowe podejście mikrotechniczne oparte na procesie termoformowania w skali mikro. Do wytwarzania wysokoporowatych polimerowych płytek o cienkich ściankach stosujemy kombinację irradiacji ciężkimi jonami, mikrotermoformowania oraz trawienia śladów. W tym tak zwanym procesie „SMART” (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) cienkie folie polimerowe są naświetlane wysokoenergetycznymi ciężkimi pociskami o energii rzędu kilkuset MeV, co prowadzi do powstania tzw. „śladów utajonych”. Następnie folia w stanie sprężystym jest formowana w części trójwymiarowe bez modyfikowania ani wyżarzania śladów. Po procesie formowania selektywne trawienie chemiczne przekształca ostatecznie ślady w cylindryczne pory o regulowanej średnicy.
Protokół
Sekwencja procesu nr 1: Tłoczenie na gorąco, obróbka skrawaniem i spawanie oparami rozpuszczalnika
CellChip o konstrukcji sześciennej jest powielany metodą tłoczenia na gorąco lub mikro-wtryskiwania. W tym celu stosujemy mikrobobioną formę mosiężną o geometrii odwrotnej do geometrii chipa. Pojemniki – rozmieszczone w regularnej macierzy liczącej do 1156 sztuk – mają kształt sześcianu o długości krawędzi 300 µm. W przypadku tłoczenia na gorąco proces powielania przeprowadzany jest na konwencjonalnym urządzeniu WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Germany). Narzędzie składa się z dwóch okrągłych płyt metalowych. W pierwszym kroku cienka płyta PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) jest umieszczana w centrum dolnej płyty otwartego narzędzia. Mikrostrukturalny wkład formy jest zamontowany centralnie w górnej płycie. Następnie narzędzie zostaje zamknięte w celu odessania powietrza z formy i podgrzane do temperatury powyżej temperatury przejścia szklistego polimeru. Poprzez dociśnięcie płyt do siebie, lepki polimer jest wtłaczany do opróżnionych jam, aż zostaną one całkowicie wypełnione, precyzyjnie odwzorowując geometrię formy. Po ochłodzeniu narzędzia mikrostrukturalny element polimerowy może zostać wyjęty z formy. Proces ten wymaga większej masy polimeru, niż jest to faktycznie niezbędne do wypełnienia jam formy. Nadmiar polimeru tworzy warstwę pozostałości, która może ułatwiać wyjmowanie elementu z formy. Jednak aby stworzyć pory o średnicy mniejszej niż 3 µm w dnie pojemników, gruba warstwa pozostałości musi zostać odchudzona lub nawet całkowicie usunięta i zastąpiona membraną porowatą. Aby uprościć proces integracji porów, tył powielonego CellChip jest całkowicie usuwany poprzez obróbkę frezarką diamentową. W tym celu elementy są mocowane na chłodzonej płycie montażowej, a dodatkowo kruche struktury są zamrażane w wodzie dejonizowanej, aby chronić je przed uszkodzeniem.
W ostatnim kroku procesu komercyjna membrana trawiona jonowo (poliwęglan, grubość 10 µm, rozmiar porów 3 µm, 2x106 porów/cm², Pieper Filter GmbH) jest przytwierdzana do spodu macierzy pojemników, która jest teraz otwarta zarówno od góry, jak i od dołu. Proces łączenia to spawanie oparami rozpuszczalnika przeprowadzane w szczelnej, podgrzewanej komorze [Ryc. 1], składającej się z górnego tłoka i ruchomej płyty dolnej z zintegrowanym uchwytem próżniowym.4 Do czterech obrobionych CellChipsów i membran trawionych jonowo poddaje się równolegle działaniu oparów rozpuszczalnika po uprzednim odpompowaniu powietrza z komory. Następnie formowane elementy i membrany są dociskane do siebie przez górny tłok. Po krótkim czasie ekspozycji (<15 s) komora jest ponownie odsysana, co usuwa rozpuszczalnik. Dzięki krótkiemu czasowi kontaktu rozpuszczany jest tylko materiał przypowierzchniowy, co pozwala uniknąć deformacji struktury rdzeniowej pod wpływem obciążenia mechanicznego. Na koniec komora zostaje otwarta, a zespawane rozpuszczalnikiem CellChipsy można wyjąć i przygotować do hodowli komórkowej [Ryc. 2].
Rysunek 1.
Rycina 2.
Sekwencja procesu nr 2: irradiacja ciężkimi jonami, mikrotermokształtowanie i trawienie śladów (proces SMART)
Nowy proces o nazwie SMART jest niedawno opracowaną mikrotechnologią do wytwarzania funkcjonalizowanych mikrostruktur przypominających membrany.5 Technologia ta opiera się na mikrotechnicznym procesie termoformowania, zwanym „mikrotermoformowaniem”.6,7 W tym kluczowym etapie procesu, który został zaadaptowany z makroskopowego procesu termoformowania arkuszów uwięzionych, podgrzana cienka folia polimerowa w stanie zmiękczonym i gumowo-sprężystym jest formowana pod wpływem ciśnienia gazu wewnątrz wnęki formy [Rys. 3]. W przeciwieństwie do tłoczenia na gorąco lub wtryskiwania, proces ten nie jest formowaniem pierwotnym i polimer nie ulega stopieniu. Ze względu na to, że folia jest formowana wciąż w stanie stałym z zachowaniem trwałości spójności materiału, modyfikacje materiałowe o wysokiej rozdzielczości bocznej mogą być najpierw generowane na płaskich foliach polimerowych, a następnie zachowywane podczas całego procesu formowania. Po etapie mikrotermoformowania modyfikacje te mogą być dalej selektywnie przetwarzane, np. poprzez mokrą obróbkę chemiczną.
Rysunek 3
Proces SMART w zasadzie składa się z trzech etapów:
- tworzenie wzorów modyfikacji o wysokiej rozdzielczości na płaskich cienkich filmach polimerowych w procesie wstępnym
- trójwymiarowe kształtowanie filmów poprzez mikrotermoformowanie bez utraty (wzorowanych) modyfikacji
- proces końcowy (opcjonalny) w celu finalnej funkcjonalizacji cienkościennych części mikrostrukturalnych
Proces SMART, który obecnie stosujemy do wytwarzania porowatych CellChips, obejmuje następujące etapy procesowe [Rys. 4]. Cienka folia polimerowa, np. z poliwęglanu (Pokalon OG461Gl, 50 µm, LoFo High Tech Film GmbH, Niemcy), jest naświetlana przyspieszonymi ciężkimi jonami (takimi jak jony Xe, Au lub U) w ośrodkach akceleracyjnych GSI (Darmstadt, Niemcy) przy energiach ok. 1 GeV i fluencji rzędu 108 jonów/cm². Przenikając przez folię, każdy jon tworzy niemal prosty ślad zmodyfikowanego materiału, zwany śladem utajonym. Wstępnie przetworzone folie są następnie termoformowane w macierz 25x25 cienkościennych mikrokontenerów, z których każdy ma średnicę i głębokość 300 µm. Proces ten jest obecnie przeprowadzany na zmodyfikowanej prasie do tłoczenia na gorąco [Rys. 5], gdzie folia polimerowa jest zaciskana pomiędzy dwiema metalowymi płytami. Górna płyta jest wyposażona w mikroobrobioną formę, a dolna zawiera przyłącza ciśnienia i próżni. Folia jest wciągana do uprzednio opróżnionych z powietrza mikrownęk formy za pomocą azotu pod ciśnieniem do 5 MPa. Formowanie folii odbywa się w temperaturze bliskiej temperaturze przejścia szklistego, co zapobiega wyżarzaniu śladów.
Rycina 4
Rysunek 5
W procesie końcowym ślady jonowe są selektywnie trawione do postaci porów poprzez zanurzenie całej mikrostruktury w odpowiednim medium trawiącym (np. 5 Mol/L NaOH, 10% w/v MeOH). Poprzez kontrolowanie czasu oraz warunków trawienia, takich jak stężenie, temperatura i specjalne dodatki (np. promotory trawienia), można dostosować rozmiar i kształt powstałych porów [Ryc. 6].
Rysunek 6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Choć ugruntowane metody mikroreplikacji polimerów, takie jak mikroodlewanie wtryskowe czy tłoczenie na gorąco, nadają się do wytwarzania mikrostruktur, nie są one w rzeczywistości skuteczne w tworzeniu mikrostruktur z zintegrowaną i ściśle kontrolowaną porowatością, której wymaga CellChip. Struktury masywne wymagają np. kosztownej obróbki w celu zmniejszenia grubości ścianek przed późniejszą perforacją laserową lub konieczna jest całkowita zastąpienie ścianek membranami trawionymi ścieżkowo. SMART to nowa i obiecująca ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Dirkowi Herrmannowi, Oliverowi Wendtowi, Siegfriedowi Hornowi, Hartmutowi Gutzeitowi i Joergowi Bohnowi za znaczącą pomoc w zakresie spawania oparami rozpuszczalnika. Ponadto chcielibyśmy podziękować Michaelowi Hartmannowi, Alexowi Gerwaldowi i Danielowi Leisenowi za wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation. J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Heckele, M., Schomburg, W. K. Review on micro molding of thermoplastic polymers. Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.
- Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips. Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).
- Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).
- Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. Nuclear tracks in solids. , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
