Mikrofabrykacja rusztowań wielkości chipów do trójwymiarowej hodowli komórek

Podsumowanie

Prezentujemy dwa procesy mikroprodukcji porowatych wiórów polimerowych do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszym z nich jest tłoczenie na gorąco połączone z procesem zgrzewania w osłonie wody rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią toru jonowego, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Streszczenie

Korzystanie z technologii mikrofabrykacji jest warunkiem koniecznym do stworzenia rusztowań o powtarzalnej geometrii i stałej jakości do trójwymiarowej hodowli komórek. Technologie te oferują szerokie spektrum korzyści nie tylko dla produkcji, ale także dla różnych zastosowań. Na rozmiar i kształt utworzonych skupisk komórek może mieć wpływ dokładna i powtarzalna architektura mikrowytwarzanego rusztowania, a tym samym można kontrolować długość drogi dyfuzji składników odżywczych i gazów.1 Jest to niewątpliwie przydatne narzędzie do zapobiegania apoptozie i martwicy komórek z powodu niewystarczającego dostarczania składników odżywczych i gazów lub usuwania metabolitów komórkowych.

Nasz polimerowy chip, zwany CellChip, ma zewnętrzne wymiary 2 x 2 cm z centralnym obszarem mikrostrukturalnym. Obszar ten jest podzielony na szereg do 1156 mikrokontenerów o typowym wymiarze 300 m długości krawędzi w przypadku konstrukcji sześciennej (cp- lub cf-chip) lub o średnicy i głębokości 300 m w przypadku konstrukcji okrągłej (r-chip).2

Do tej pory, do produkcji mikrostrukturalnych chipów stosowano tłoczenie na gorąco lub mikro formowanie wtryskowe (w połączeniu z późniejszą pracochłonną obróbką części). Zasadniczo, mikrowtryskiwanie jest jedną z niewielu technik replikacji opartych na polimerach, która do tej pory jest w stanie masowo wytwarzać mikrostruktury polimerowe.3 Jednak obie techniki mają pewne niepożądane ograniczenia ze względu na przetwarzanie lepkiego stopionego polimeru z wytwarzaniem bardzo cienkich ścianek lub zintegrowanych otworów przelotowych. W przypadku CellChip cienkie warstwy dolne są niezbędne do perforacji polimeru i zapewnienia małych porów o określonej wielkości w celu zaopatrzenia komórek w pożywkę hodowlaną, np. poprzez mikroprzepływową perfuzję pojemników.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia i obniżyć koszty produkcji, opracowaliśmy nowe podejście mikrotechniczne oparte na procesie termoformowania na mniejszą skalę. Do produkcji wysokoporowatych i cienkościennych wiórów polimerowych stosujemy kombinację naświetlania ciężkimi jonami, mikrotermoformowania i wytrawiania torowego. W tym tak zwanym procesie "SMART" (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) cienkie folie polimerowe są napromieniowywane ciężkimi pociskami o energii kilkuset MeV, wprowadzając tak zwane "ślady utajone" Następnie folia w stanie elastycznym gumy jest formowana w trójwymiarowe części bez modyfikacji lub wyżarzania ścieżek. Po procesie formowania selektywne trawienie chemiczne ostatecznie przekształca ścieżki w cylindryczne pory o regulowanej średnicy.

Protokół

Sekwencja procesu #1: Tłoczenie na gorąco, obróbka skrawaniem i spawanie parami rozpuszczalnika

CellChip w swoim sześciennym kształcie jest replikowany przez tłoczenie na gorąco lub mikro formowanie wtryskowe. W tym celu używamy mikroobrabianej mosiężnej formy o odwrotnej geometrii wióra. Pojemniki - ułożone w regularny układ do 1156 pojemników - mają konstrukcję sześcienną o długości krawędzi 300 μm. W przypadku wytłaczania na gorąco proces replikacji odbywa się na konwencjonalnym WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Niemcy). Narzędzie składa się z dwóch okrągłych metalowych płytek. W pierwszym etapie cienka płytka z PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) jest umieszczana na środku dolnej płyty otwartego narzędzia. Mikrostrukturalna wkładka formy jest zamontowana centralnie w górnej płycie. Następnie narzędzie jest zamykane w celu opróżnienia formy i podgrzewane do temperatury wyższej od temperatury zeszklenia polimeru. Poprzez ściskanie płyt razem, lepki polimer jest wpychany do opróżnionych wnęk, aż zostaną one całkowicie wypełnione, precyzyjnie odwzorowując geometrię formy. Po schłodzeniu narzędzia, mikrostrukturalna część polimerowa może zostać wyjęta z formy. Proces ten wymaga większej ilości masy polimerowej niż jest to faktycznie potrzebne do wypełnienia ubytków formy. Nadwyżka polimeru tworzy warstwę resztkową, którą można wykorzystać do ułatwienia wyjmowania części z formy. Jednak, aby utworzyć pory o średnicy mniejszej niż 3 μm na dnie pojemników, gruba warstwa resztkowa musi zostać rozrzedzona lub nawet całkowicie usunięta i zastąpiona porowatą membraną. Aby uprościć proces integracji porów, tył replikowanego CellChip jest całkowicie usuwany przez obróbkę za pomocą młyna diamentowego. W tym celu części są mocowane na chłodzonej płycie montażowej, a dodatkowo delikatne konstrukcje są zamrażane w wodzie dejonizowanej, aby chronić je przed uszkodzeniem.

W ostatnim kroku procesu, w końcu komercyjna membrana jonowa (poliwęglan, grubość 10 μm, wielkość porów 3 μm, 2x10⁶ porów/cm², Pieper Filter GmbH) jest przyklejana do tylnej części zestawu pojemników teraz otwartych zarówno na górze, jak i na dole. Proces klejenia to proces zgrzewania parami rozpuszczalnika wykonywany w gazoszczelnej, ogrzewanej komorze [rys. 1], składającej się z górnego tłoka i ruchomej dolnej płyty ze zintegrowanym uchwytem próżniowym. ⁴ Maksymalnie cztery obrobione maszynowo chipy CellChip i membrany trawione ścieżkowo są wystawiane równolegle na działanie odparowanego rozpuszczalnika po opróżnieniu komory. Następnie wypraski i membrany są dociskane do siebie przez górny tłok. Po krótkim okresie ekspozycji (<15 s) komora jest ponownie opróżniana, usuwając w ten sposób rozpuszczalnik. Ze względu na krótki czas kontaktu, rozpuszczana jest tylko powierzchnia w pobliżu materiału i można uniknąć deformacji struktury masowej pod wpływem obciążenia mechanicznego. Na koniec komora jest otwierana, a zgrzewane rozpuszczalnikiem CellChips mogą być wyjęte i przygotowane do hodowli komórkowej [Rys. 2].

Rysunek 1.

Rysunek 2.

Sekwencja procesu #2: napromienianie ciężkimi jonami, mikrotermoformowanie i trawienie śladów (proces SMART)

Nowy proces o nazwie SMART to niedawno opracowana mikrotechnologia do wytwarzania funkcjonalizowanych mikrostruktur przypominających membrany. ⁵ Technologia ta opiera się na mikrotechnicznym procesie termoformowania, zwanym "mikrotermoformowaniem". ^6,7 W tym centralnym etapie procesu, który został zaadaptowany z makroskopowego procesu termoformowania arkuszy z pułapką, podgrzewana cienka folia polimerowa jest formowana w stanie zmiękczonym, elastycznym gumy pod ciśnieniem gazu do gniazda formy [Rys. 3]. W przeciwieństwie do wytłaczania na gorąco lub formowania wtryskowego, proces ten nie jest formowaniem pierwotnym, a polimer nie jest topiony. Ze względu na fakt, że folia jest formowana jeszcze w stanie stałym ze stałą spójnością materiału, modyfikacje materiału o wysokich rozdzielczościach bocznych mogą być najpierw generowane na płaskich foliach polimerowych i są zachowywane przez cały proces formowania. Po etapie mikrotermoformowania modyfikacje te mogą być dalej selektywnie przetwarzane, np. poprzez mokrą obróbkę chemiczną.

Rysunek 3

Proces SMART zasadniczo składa się z trzech etapów:

1. Tworzenie wysokorozdzielczych wzorców modyfikacji na płaskich cienkich warstwach polimerowych w procesie wstępnym
2. Kształtowanie 3D folii metodą mikrotermoformowania bez utraty modyfikacji (wzorzystych)
3. Proces końcowy (opcjonalnie) w celu końcowej funkcjonalizacji cienkościennych części mikrostrukturalnych

Proces SMART, który obecnie stosujemy do produkcji porowatych CellChips, obejmuje następujące etapy procesu [Rys. 4]. Cienka warstwa polimerowa, np. z poliwęglanu (Pokalon OG461Gl, 50 μm, LoFo High Tech Film GmbH, Niemcy), jest napromieniana przyspieszonymi ciężkimi jonami (takimi jak jony Xe, Au lub U) w akceleratorach GSI (Darmstadt, Niemcy) o energiach ok. 1 GeV i fluencjach rzędu 106⁸ Po schłodzeniu narzędzia, Część cienkościenną można wyjąć z formy. jonów/cm². Podczas przenikania przez folię każdy jon wytwarza prawie prosty ślad zmodyfikowanego materiału, zwany śladem utajonym. Wstępnie obrobione folie są następnie formowane termicznie do zestawu cienkościennych mikropojemników o wymiarach 25x25, każdy o średnicy i głębokości 300 μm. Proces ten jest obecnie wykonywany na zmodyfikowanej prasie do wytłaczania na gorąco [rys. 5], gdzie folia polimerowa jest zaciskana pomiędzy dwiema metalowymi płytami. Górna płyta jest wyposażona w formę poddaną mikroobróbce, a dolna zawiera złącza ciśnieniowe i próżniowe. Folia jest rozciągana do wcześniej opróżnionych mikrownęk formy za pomocą azotu pod ciśnieniem do 5 MPa. Folie są formowane w temperaturze zbliżonej do temperatury zeszklenia, co zapobiega wyżarzaniu ścieżek.

Rysunek 4

Rysunek 5

W procesie końcowym, ścieżki jonowe są selektywnie wytrawiane do porów poprzez zanurzenie całej mikrostruktury w odpowiednim medium trawiącym (np. 5 Mol/L NaOH, 10% w/v MeOH). Kontrolując czas i warunki wytrawiania, takie jak stężenie, temperatura i specjalne dodatki (np. promotory wytrawiania), można dostosować wielkość i kształt powstałych porów [rys. 6].

Rysunek 6

Dyskusja

Chociaż uznane metody mikroreplikacji polimerów, takie jak mikrowtryskiwanie lub wytłaczanie na gorąco, są odpowiednie do wytwarzania mikrostruktur, nie są one tak naprawdę skuteczne w wytwarzaniu mikrostruktur o zintegrowanej i wysoce kontrolowanej porowatości, jak jest to potrzebne w przypadku CellChip. Wielkogabarytowe konstrukcje, np. wymagają kosztownej obróbki skrawaniem w celu zmniejszenia grubości ścianek w celu późniejszej perforacji laserowej lub ścianki muszą być całkowicie zastąpione membranami trawionymi ści...