Artykuł metodologiczny

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 marca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie superrozdzielcze zrewolucjonizowało badania biologiczne, ujawniając szczegóły strukturalne na skali nano. Większość optycznych metod superrozdzielczości opiera się na znakowaniu biomolekuł fluorescencyjnym, co umożliwia specyficzne oznaczanie gatunków cząsteczkowych, ale może zakłócać funkcje komórkowe, wprowadzać niedokładności cząsteczek linkerów oraz nie zapewniać stałej wysokiej gęstości znakowania wymaganej do obrazowania chromatyny na skali pojedynczych cząsteczek DNA. Technologia umożliwiająca obrazowanie genomowe in situ bez oznakowań z rozdzielczością nanometrową miałaby głęboki wpływ na biologię. Przedstawiamy tutaj protokół, który wykorzystuje wewnętrzną fluorescencję DNA do wykonania spektroskopowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki (sSMLM). Protokół szczegółowo opisuje przygotowanie próbek, pozyskiwanie danych oraz analizę widmową. Krótko mówiąc, cienki żel DNA powstaje przez nałożenie roztworu polinukleotydu na szkło i pozostawienie go do wyschnięcia przez kilka godzin. Po formowaniu żelu próbka jest obrazowana w obecności buforu obrazującego za pomocą sSMLM. Zarejestrowany zbiór danych składa się z obrazu rzędu zerotowego, zapewniającego lokalizacje przestrzenne, oraz obrazu pierwszego rzędu, kodującego widmo emisji każdej lokalizacji. Rekonstrukcje przestrzenne są generowane z danych rzędu zerotów, po czym odpowiadające im widma są wyodrębniane z sygnału pierwszego rzędu. Na koniec demonstrujemy wykonalność tego podejścia, wykorzystując wiele długości fal wzbudzenia oraz cząsteczki DNA o różnych długościach, sekwencjach i składzie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroskopii fluorescencyjnej superrozdzielczości — w tym mikroskopia strukturalnego iluminacji (SIM), mikroskopia stymulowanego redukcji emisyjnej (STED) oraz mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), takie jak fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna (PALM) i stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcyjna (STORM) — znacznie przesunęły rozdzielczość mikroskopii optycznej daleko poza granicę dyfrakcyjną 1,2,3,4.5,6,7, umożliwiając bezprecedensowy dostęp do nanoskalowej organizacji chromatyny 8,9,10,11,12. Jednak obecne metody barwienia do wizualizacji struktur kwasów nukleinowych opierają się na znakowaniu białek związanych z DNA, a nie na samym DNA, lub stosują barwniki małocząsteczkowe, które mogą zakłócać natywną konfigurację chromatyny i osłabiać żywotność komórek13,14. Ze względu na te ograniczenia rozwój bezoznakowych metod obrazowania optycznego superrozdzielczości w natywnych, niezakłócających warunkach jest bardzo pożądany. Przedstawiony tutaj protokół przeznaczony jest dla syntetycznych oczyszczonych nukleotydów jednoniciowych lub dwuniciowych DNA, gdzie fluorescencja wewnętrzna może być wiarygodnie wykrywana; nie jest zoptymalizowany do obrazowania cząsteczek DNA jądrowego w komórkach stałych lub żywych.

Ponieważ kwasy nukleinowe przez długi czas uważano za niefluorescencyjne ze względu na ich niezwykle niską wydajność kwantową (około 10−4 przy wzbudzeniu UV) oraz ultraszybki rozpad fluorescencji w temperaturze pokojowej15, badania fluorescencji wewnętrznej DNA (głównie czasu życia fluorescencji) były rzadkie, aż do opracowania spektroskopii femtosekundowej. Powszechnie wiadomo, że nukleotydy fluorescencją słabo pod oświetleniem UV, podczas gdy ich absorpcja w zakresie widzialnym jest znacznie słabsza. Niemniej jednak niedawno zaobserwowano, że istnieje fluorescencja wzbudzona światłem widzialnym niemodyfikowanych kwasów nukleinowych przy fizjologicznie istotnych stężeniach16. Zjawisko to prawdopodobnie zostało pominięte, ponieważ większość badań fotochemicznych nukleotydów przeprowadzano w rozcieńczonych roztworach (10-100 μM)17,18,19,20, podczas gdy w jądrach i chromosomach stężenia DNA mogą sięgać 0,1-1 M 21,22,23. Co ważniejsze, zaobserwowano stochastyczne przełączanie fluorescencji pod światłem widzialnym16, co położyło fundamenty pod wykorzystanie niemodyfikowanych kwasów nukleinowych jako endogennych środków kontrastowych w mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Charakterystyka fotochemiczna monomerów nukleotydowych i jednoniciowych cząsteczek DNA o prostych sekwencjach przy stężeniach fizjologicznych przy wzbudzeniu światłem widzialnym została zbadana24. Wykazano również, że cząsteczki DNA te mają stochastyczne właściwości zamieniania fluorescencji, co dobrze wpisuje się w teorię użycia stanu podstawowego (GSD)6,7, badając odbicie fluorescencji nukleotydów w różnych warunkach zubożenia. Ponadto, ponieważ nukleotydy wykazują stosunkowo wysokie wydajności kwantowe i niskie prawdopodobieństwo przejścia między systemami, liczba fotonów i czas mrugania podczas zdarzeń emisji pojedynczącej cząsteczki są porównywalne z popularnymi barwnikami egzogennymi w STORM (np. Alexa Fluor 647), wykazując wyraźne widma25,26 i czyniąc DNA idealnym środkiem kontrastu wewnętrznego do obrazowania wysokorozdzielczego. Dodatkowo, wdrożenie algorytmu regresji spektralnej opisanego w poprzedniej sekcji umożliwia obrazowanie wielonukleotydów i liniowych jednoniciowych włókien DNA w zakresie poniżej dziesięciu nanometrów27.

Aby uchwycić pełne spektrum wewnętrznej fluorescencji DNA, zastosowaliśmy dwuklinowy pryzmat (DWP) do detekcji spektralnej, który umożliwia jednoczesną, wysokoprzepustową analizę spektroskopową pojedyncząłek i obrazowanie przy minimalnych stratach transmisji i błędzie frontu fali 28,29,30, a także otwartoźródłowe oprogramowanie do analizy spektroskopowej SMLM (RainbowSTORM) do automatycznego przetwarzania danych 31,32. Bazując na tej możliwości, opracowaliśmy wielolaserową platformę SMLM zintegrowaną z detekcją spektroskopową oraz dedykowanym pipeline'em do analizy spektralnej. Protokół przedstawiony tutaj obejmuje przygotowanie próbek, pozyskiwanie danych i analizę, zapewniając powtarzalny sposób pracy do wykorzystania wewnętrznej fluorescencji DNA w mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki. Poza umożliwieniem badań dowodowych koncepcji na obrazowaniu jednoniciowych oligonukleotydów i cząsteczek DNA dwuniciowych z kontrastem wewnętrznym, podejście to stworzyło fundamenty dla szerszych zastosowań w obrazowaniu DNA w rodzimych, bezoznakowych warunkach, takich jak przewidywanie sekwencji oparte na wewnętrznej fluorescencji DNA w połączeniu z metodami obliczeniowymi.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek żelu DNA (Rysunek 1A)

  1. Rozpuszcz próbkę DNA (oligonukleotydową lub dwuniciową DNA) w wodzie dejonizowanej wolnej od nukleazy do końcowego stężenia 100 mM i przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze -4 °C.
  2. Przygotuj 5 μL aliquotów, aby zminimalizować powtarzające się cykle zamarzania i rozmrażania. Jeśli używasz mrożonych aliquotów, rozmrażaj je w temperaturze pokojowej przez 5-15 minut, w zależności od objętości.
  3. Delikatnie wyczyść szkiełko chusteczką laboratoryjną. Pipeta 5 μL roztworu cząsteczki DNA o pojemności 100 mM na świeżo wyczyszczony szkiełko i pozwól mu odparować przez 1-3 godziny, tworząc żel DNA.
  4. Dla bezpieczeństwa uruchom ten stopień w okapie spalinowym. Przygotuj bufor obrazowania zgodnie z Tabelą Materiałów. Zarówno bufor β-merkaptoetanolowy, jak i DABCO zostały zweryfikowane jako wsparcie stochastycznego fotoprzełączania cząsteczek DNA.
  5. Dla bezpieczeństwa uruchom ten stopień w okapie spalinowym. Dodaj 5 μL buforu obrazowego do żelu DNA i załóż na wierzch pokrywkę tuż przed obrazowaniem. W środku przykrytej próbki mogą być bąbelki. Użyj pęsety, aby usunąć pęchety z przykrytej próbki,

2. Kalibracja systemu sSMLM i akwizycja danych (Rysunek 1B)

  1. Przygotuj wykonaną matrycę nanootworów o średnicy otworów 100 nm i odstępie 4 μm, ułożoną w 8 rzędach x 5 kolumn do następnej kalibracji spektroskopowego systemu SMLM33.
    UWAGA: Alternatywnie, do kalibracji spektralnej33 można również użyć wykresu rozdzielczości Sił Powietrznych Stanów Zjednoczonych (USAF) R3L1S4N z 1951 roku.
    1. Wykonaj matrycę nanodziur poprzez sekwencyjne rozpylanie metalu i frezowanie wiązką jonów skupionych (FIB). Najpierw nałóż warstwę aluminiową o grubości 150 nm na pokrywę z borokrzemowego szkła o wymiarach 22 x 22 mm, stosując sputtering DC przy mocy 75 W przy przepływie argonu 20 standardowych centymetrów sześciennych na minutę (SCCM) przy 3 mTorr.
    2. Wzoruj matrycę 5 x 8 nanootworów w warstwie aluminiowej, używając frezowania FIB przy napięciu przyspieszającym 30 kV.
  2. Włącz spektroskopowy system SMLM (Rysunek 2), włóż filtry wąskopasmowe (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm i 750 nm) bezpośrednio przed kamerą i użyj białego źródła światła (np. lampy mikroskopowej) do oświetlenia próbki kalibracyjnej.
  3. Zbierz 10 klatek z każdym filtrem. Ustaw czas ekspozycji na 532 nm, 580 nm, 633 nm i 680 nm na 200 ms oraz na 2000 ms dla 750 nm ze względu na niską intensywność lampy i niską wydajność aparatu w obszarze bliskiej podczerwieni (Rysunek 3).
  4. Załaduj próbkę żelu DNA do mikroskopu, upewnij się, że strona pokrywy jest skierowana w stronę obiektywu, i otwórz oprogramowanie kamery do akwizycji danych.
  5. Zidentyfikuj odpowiednią pozycję z za pomocą automatycznego systemu śledzenia ostrości, zapewniając wyraźne stochastyczne migania. Ten krok jest kluczowy i wymaga cierpliwości, ponieważ próbki żelu DNA nie mają oczywistych sygnałów morfologicznych, takich jak struktury komórkowe, co utrudnia znalezienie właściwego sygnału.
  6. Upewnij się, że obiektyw nie dotyka krawędzi pokrywy, ponieważ może to powodować przeciek bufora do oleju immersyjnego i zakłócać prowadzenie osłony.
  7. Uzyskaj 10 000-30 000 klatek z typową mocą oświetlenia 5 kW/cm² i czasem naświetlenia 30 ms. Dostosuj liczbę klatek, moc oświetlenia i czas naświetlania w razie potrzeby. Po przejęciu oprogramowanie domyślnie zapisuje dane w formacie nd2.
  8. Po zakończeniu eksperymentu uśmieć szkiełko szkiełkowe do zatwierdzonego pojemnika na odpady ostre (np. pojemnik na rozbite szkło lub utylizację ostrych przedmiotów) i wyrzuć wszystkie pozostałe bufory do wyznaczonego pojemnika na ciecz chemiczną zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnym.

3. Analiza danych kalibracyjnych i spektroskopowych (rysunek 1C)

  1. Załaduj pobrany surowy stos obrazów próbki DNA do FIJI (Windows 64-bit), korzystając z wtyczki Bio-Formats.
  2. Odejmij minimalną projekcję ze stosu, aby uzyskać zbiór danych odejmowany przez tło i zapisz go do analizy spektralnej. Dla załadowanego stosu surowych obrazów wybierz Image > Stacks > Z Project i wybierz minimalną intensywność w typie projekcji. Następnie wybierz Process > Image Calculator , aby odejmować minimalną projekcję od surowego stosu obrazów i zapisać ją jako TIFF.
  3. Wykonaj identyfikację lokalizacji na stosie raw obrazów w kolejności zeroth za pomocą wtyczki ThunderSTORM (wersja 1.3). Użyj odpowiednich parametrów (np. próg = 1,2 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, promień dopasowania = 3) do rekonstrukcji obrazu rzędu zerotowego i wyodrębnienia współrzędnych zdarzeń emisyjnych (jednostki: nm). Aby uzyskać surowy stos obrazów w kolejności przyciętych zeroth, wybierz Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
  4. Użyj FIJI oraz otwartoźródłowego oprogramowania RainbowSTORM (link GitHub w32, wersja MATLAB nowsza niż 2020b) do przetwarzania danych kalibracyjnych i uzyskania zależności między przesunięciami poziomymi a pionowymi a długościami fal31,32.
    1. Wykonaj identyfikację lokalizacji na obrazach kalibracyjnych 5 długości fal za pomocą wtyczki ThunderSTORM. Użyj odpowiednich parametrów (np. próg = 5 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, promień dopasowania = 3) do rekonstrukcji lokalizacji nanodziur rzędu zerowego oraz ich odpowiadających lokalizacji widmowych na pierwszym rzędzie.
    2. Dostosuj próg (np. w zakresie 5-10 x std (Wave.F1)) do 80 lokalizacji dla każdego obrazu kalibracyjnego.
    3. Uruchom RainbowSTORM i kliknij Kalibracja Spektralna > Przejrzyj i załaduj pliki CSV dla każdej długości fali kalibracyjnej (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) z poprzedniego kroku. Kliknij Zapisz plik kalibracyjny.
  5. Przekonwertuj współrzędne oparte na nanometrach na współrzędne pikselowe i odwzoruj je na odpowiadające im okno spektralne na podstawie przesuwów poziomych i pionowych od rzędu zerowego do pierwszego, określonych w kalibracji (Rysunek 4), aby zmierzyć pełne spektrum fluorescencji wewnętrznej DNA.
    1. Użyj spersonalizowanych skryptów Pythona34 (wersja 3.11.7), aby wyodrębnić dane z całego spektrum według następujących kroków.
    2. Ustaw poprawne ścieżki plików dla stosu obrazów odejmowanego przez tło (.tiff) z kroku 3.2, pliku CSV lokalizacji (.csv) wygenerowanego w kroku 3.3 oraz pliku kalibracyjnego z kroku 3.4 (.mat).
    3. Użyj 900-950 pikseli jako poziomego przesunięcia dla danych 488 nm uzyskanych za pomocą 3D DWP, odpowiadającego oknu spektralnemu 484-588 nm, nieco szerszemu niż zakres filtrów 500-550 nm, aby zapewnić pokrycie.
    4. Użyj 925-984 pikseli jako przesunięcia poziomego dla danych 532 nm uzyskanych za pomocą 3D DWP, odpowiadającego oknu spektralnemu 525-750 nm, ponownie wybranym tak, aby był szerszy niż zakres filtrów 590-650 nm.
    5. Użyj 23 pikseli jako pionowego przesunięcia zarówno dla danych 488 nm, jak i 532 nm z 3D DWP.
      Powyższe wartości zostały wyprowadzone z krzywej kalibracji spektralnej uzyskanej za pomocą RainbowSTORM. Skrypty Pythona do pomiaru pełnego spektrum można znaleźć wnumerze 34.
  6. Linearyzuj widmo nieliniowe do dalszej analizy (porównania, klasyfikacja itp.) za pomocą dopasowania wielomianówtrzeciego rzędu (rysunek 3).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cały proces — od przygotowania próbki po pozyskanie i analizę danych — dla jednego stosu obrazów próbki DNA trwa około 120 minut, zakładając, że tworzenie żelu DNA zajmuje 1 godzinę (Rysunek 1). Łączny czas rozmrażania, formowania żelu i kalibracji spektralnej jest ustalone na około 90 minut, niezależnie od liczby obrazów lub próbek w eksperymencie. Aby zmaksymalizować efektywność, zalecamy zbieranie wielu stosów obrazów w kilku próbkach podczas jednej sesji.

Reprezentatywne obrazy w czasie rzeczywistym uzyskane po DWP pokazano na Rysunku 1B i 3A, gdzie sygnały fluorescencji dzielą się na zerowy (po lewej, zawierający informacje przestrzenne) i pierwszy (prawy, zawierający informacje spektralne). Na Rysunku 1B obrazy zostały wykonane za pomocą konfiguracji 2D DWP, w której odległość między obrazami zerotowymi a pierwszego rzędu jest stosunkowo niewielka. Dla porównania, Rysunek 3A pokazuje dane zebrane za pomocą 3D DWP, gdzie dwa rzędy dyfrakcji są bardziej oddzielone ze względu na inżynieryjną różnicę ścieżek optycznych wymaganą do dwupłaszczyznowego obrazowania 3D. Wszystkie dane przedstawione na Rysunku 1C, Rysunku 3 i Rysunku 4 zostały zebrane w konfiguracji 3D DWP. Wybór między obrazowaniem 2D a 3D zależy od celu eksperymentalnego: do pomiarów spektralnych fluorescencji wewnętrznej syntetycznych próbek DNA zazwyczaj preferuje się 2D DWP, ponieważ próbki te nie mają istotnych trójwymiarowych cech strukturalnych, choć konfiguracja 3D DWP może być również stosowana, gdy potrzebne są informacje osiowe.

Razem te reprezentatywne wyniki pokazują podstawową zdolność platformy obrazowania opartej na DWP do jednoczesnego rozdzielania lokalizacji przestrzennej i widma emisji z pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym. Prawidłowa wydajność systemu jest wskazana przez wyraźne i stabilne rozdzielenie obrazu przestrzennego rzędu zerotowego od obrazu rozproszonego spektralnie pierwszego rzędu, przy czym każda lokalizacja pojedynczej cząsteczki w rzędzie zerotowym odpowiada wyraźnemu śladowi spektralnemu w pierwszym rzędzie. Ilościowa analiza spektralna polega na identyfikacji izolowanych zdarzeń pojedynczych cząsteczek na obrazie rzędu zeroth, pomiarze względnego przesunięcia pikseli powiązanego sygnału pierwszego rzędu oraz przekształceniu tego przesunięcia na długość fali za pomocą skalibrowanej funkcji mapowania. Ponieważ zależność między przemieszczeniem piksela a długością fali emisji jest nieliniowa, stosuje się dopasowanie wielomianów trzeciego rzędu, aby dokładnie odtworzyć liniowe widma emisji na podstawie surowychdanych 28. Uzyskane widma pojedynczącej cząsteczki mogą być dalej integrowane z pipeline'ami analizy obliczeniowej, w tym z modelami uczenia maszynowego lub głębokiego uczenia, co umożliwia klasyfikację spektralną oraz wnioskowanie składu sekwencji DNA lub struktury molekularnej na podstawie wewnętrznych sygnatur fluorescencyjnych w różnych warunkach oświetlenia i stanach fotofizycznych.

Wszystkie dane przedstawione w tym protokole zostały zebrane za pomocą buforaobrazowego β-merkaptoetanolu 35. Zasadniczo każdy bufor obrazujący poprawiający zachowanie przełączania zdjęć fluoroforów powinien być kompatybilny z tym podejściem, np. bufor obrazowania oparty na DABCO36. Testowane cząsteczki DNA obejmują 20-zasadowe jednoniciowe A, G, C, T; 40-bazowy jednosprężynowy łańcuch AC (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); jednorzędne Guanine na 5, 8, 12, 16 bazach; Dwuniowe GC i AT z parą 20 zasad (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ). Wybór konstruktów DNA o 20 i 40 zasadach opiera się na obserwacji, że łańcuch DNA 40-zasadowy przyjmuje zwartą konformację o efektywnym rozmiarze mniejszym niż 40 x 3,4 = 13,6 nm, co umieszcza go poniżej limitu rozdzielczości zrekonstruowanego obrazu SMLM. Długości fal wzbudzenia (488 nm i 532 nm) nie zostały jednoznacznie zoptymalizowane dla konkretnych sekwencji, lecz wybrane w celu wykazania, że fluorescencja DNA wewnętrznej może być solidnie wykrywana w różnych składach zasad i stanach konformacyjnych przy użyciu dowolnej długości fali. Przetestowaliśmy bufor obrazowania, jak pokazano na Dodatkowym Rysunku 1 , i stwierdziliśmy, że niemal nie wykryto stochastycznych sygnałów migania, co wyklucza komponenty buforowe i obróbkę powierzchni szkła. Tylko żel DNA + bufor obrazujący wykazał znaczącą liczbę mrugnięć. Szkiełka i szkiełka były czyste i starannie obsługiwane, podczas gdy żel próbki formowany był w zamkniętym środowisku. Dlatego wykryte sygnały raczej nie pochodzą z zanieczyszczeń ani autofluorescencji substratów. Zmierzyliśmy także sygnał z żelu suszącego i roztworu DNA, oba, i nie stwierdziliśmy, że nie ma istotnej różnicy, więc artefakty fotochemiczne podczas suszenia nie są głównym źródłem sygnałów. Produkty fotodegradacji zazwyczaj wykazują szerokie widma i nie mają właściwości migania, co nigdy nie zostało zaobserwowane w naszym badaniu. Ilościowe granice wykrywania, odzwierciedlone przez minimalną liczbę fotonów lokalizacji, wynoszą 30 - 50 [liczba fotonów]. Ta wartość pozostaje taka sama dla próbek DNA i systemów oznakowanych, takich jak H3K9me3 oznaczony AF647 w stałych komórkach. Średnia dokładność lokalizacji wewnętrznej fluorescencji DNA wynosi około 15 - 25 nm, natomiast AF647 to około 10 - 15 nm.

W scenariuszu 2D zrekonstruowany obraz SMLM ma rozmiar piksela 22 nm. Precyzja lokalizacji emisji stochastycznych wynosi średnio ~20 nm, co opisuje przedział ufności, w którym lokalizuje się pojedyncza cząsteczka. Jednak próbki testowane pod kątem fluorescencji wewnętrznej nie mają struktur biologicznych, więc rozdzielczość struktur nie może być interpretowana. Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana ma rozdzielczość 250 - 300 nm37, a dwufotonowy ultrafoton UV 300 nm38. Stosunek sygnału do szumu w koherentnym obrazowaniu rozpraszania Ramana wynosi 10 - 10039, natomiast 2 - 20 (często wyrażane jako odchylenie standardowe sygnał do obu (SSDR) dla mikroskopii UV 2-fotonowej 40,41. SNR dla wewnętrznej fluorescencji DNA przy użyciu sSMLM wynosi około 5 ze względu na niską liczbę fotonów i ograniczenia wynikające z szumu detekcji kamery.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy z szacowanym czasem trwania. (A) Przygotowanie próbki polega na rozmrażaniu materiału, przygotowaniu żelu DNA oraz dodaniu buforu obrazowania. Całkowity czas waha się od 1 do 3 godzin w zależności od próbki i środowiska. (B) Każde pozyskanie wymaga procesu kalibracji z użyciem specjalnie zaprojektowanej próbki nanootworowej matrycy. Całkowity czas kalibracji wyniesie około 20 minut, a czas akwizycji danych dla jednego stosu obrazów około 10 minut, wliczając wyszukiwanie próbek (10 000 klatek i 50 ms czas ekspozycji). (C) Potok analizy obejmuje wstępne przetwarzanie FIJI oraz analizę spektralną w Pythonie. Wstępne przetwarzanie w FIJI trwa około 10 minut, podczas gdy analiza spektralna jest szybka przy użyciu ustalonych kodów. Przedstawione widma zostały zebrane z guaniny o 16 zasadach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat optyczny. Cztery linie laserowe (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) są kierowane do mikroskopu odwróconego za pomocą laserowego wyrównania, co czyni system stabilnym i łatwym w obsłudze. DWP jest umieszczony tuż przed kamerą sCMOS, umożliwiając spektroskopową detekcję pojedynczych cząsteczek. Podczas kalibracji do DWP między kamerą a DWP zostanie włożone koło filtrujące. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Kalibracja spektralna. Używane długości fal kalibracyjnych to 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm i 750 nm. Poprzez kolejne umieszczanie filtrów o wąskiej szerokości pasma z tymi centralnymi długościami fal po DWP i przed kamerą, można zmierzyć odpowiednie przesunięcia poziome i pionowe różnych długości fal, co pozwala na odwzorowanie krzywej kalibracyjnej między położeniem piksela a długością fali. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Widma wybranych cząsteczek DNA dwuniciowego i jednoniciowego pod wzbudzeniem odpowiednio 532 nm i 488 nm. (A - B) Widma nieliniowe i liniowe GC_alter, które odnoszą się do rodzaju cząsteczki DNA dwuniciowej, z obiema niciami jako 20-bazowymi 5'-GCGCGGGGGGGGGGGGCGC-3'. Podświetlone zielone spektrum pokazuje średnią krzywą. (C - D) Nieliniowe i liniowe widma A10C10, które odnosi się do rodzaju jednoniciowej cząsteczki DNA o długości 40 zasad i powtarzającej się 10 adeniny i 10 cytozyny (5'- AAAAAAAAACCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'). Podświetlone niebieskie spektrum pokazuje średnią krzywą. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek uzupełniający 1: Eksperymenty kontrolne dla fluorescencji DNA wewnętrznej. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po raz pierwszy przedstawiamy protokół umożliwiający uchwycenie pełnego spektrum wewnętrznej fluorescencji DNA zarówno z cząsteczek jednoniciowych, jak i dwuniciowych, obejmujący proces od przygotowania próbki po pozyskiwanie danych i analizę obliczeniową. Protokół ten umożliwia bezoznakowe obrazowanie superrozdzielczości cząsteczek DNA poprzez wykorzystanie fluorescencji wewnętrznej zamiast egzogennych sond. W teorii takie podejście można rozszerzyć na komórki stałe, a potencjalnie także na obrazowanie komórek żywych, ponieważ unika znakowania chemicznego i amplifikacji opartej na przeciwciałach. Chromatyna w jądrze obejmuje DNA, RNA i różne rodzaje białek, co jest znacznie bardziej skomplikowanym układem niż żel DNA. Obecnie, ze względu na niską liczbę fotonów z cząsteczek DNA, emisje stochastyczne z wnętrza jądra w stałych/żywych komórkach są wyzwaniem. Jednak dla izolowanych chromosomów, czyli jądra, zgłoszono sygnał fluorescencji wewnętrznej DNA 16,24,27. Jednak w obecnej formie protokół jest ograniczony do środowisk in vitro z wykorzystaniem syntetycznych próbek DNA. Dla porównania, znakowanie DNA jądrowego lub chromatyny za pomocą immunobarwienia zazwyczaj obejmuje długie, wieloetapowe procedury — w tym wygaszanie, blokowanie oraz inkubacje przeciwciał pierwotnych i wtórnych — które mogą trwać kilka godzin (często ~5 godzin na cel)12,42, wprowadzając zarówno złożoność eksperymentalną, jak i potencjalne zaburzenia w natywnej strukturze chromatyny. Eliminując etykiety egzogenne, obrazowanie oparte na fluorescencji wewnętrznej nie tylko znacznie skraca czas przygotowania próbki, ale także zapobiega zakłóceniom strukturalnym i błędom wiązania związanym z masywnymi sondami fluorescencyjnymi i przeciwciałami, umożliwiając tym samym wierniejszą lokalizację DNA na skalę nano.

Pomimo braku etykiet i prostoty koncepcyjnej, pomyślna implementacja tego protokołu wymaga szczególnej uwagi na kilka kluczowych szczegółów eksperymentalnych. Na przykład podczas przygotowania próbki niewystarczający czas na formację żelu DNA zmniejsza liczbę wykrywalnych lokalizacji pojedynczych cząsteczek w porównaniu do w pełni uformowanych żeli. Zazwyczaj żel powstaje około 1,5 godziny. Jeśli roztwór nie jest całkowicie wyschnięty, po prostu poczekaj jeszcze trochę. Dla pokrywy o wymiarach 22 x 22 mm wystarczy 5 μL bufora obrazowania, podczas gdy większa objętość bufora może powodować wycieki, które mogą zakłócić interfejs olejowo-immersyjnej obiektywu i negatywnie wpłynąć na wydajność obrazowania. Jeśli wystąpi wyciek, można go ostrożnie usunąć za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Podczas ustawiania ostrości stopniowo podnieś obiektyw z najniższej pozycji z. Po włączeniu obiektywu do oleju immersyjnego użyj trybu precyzyjnej korekty, aby zidentyfikować płaszczyznę ogniskową z częstymi stochastycznymi zdarzeniami emisji pojedynczej cząsteczki. Jeśli duże skupiska żelowe generują zagregowane sygnały z nakładającymi się widmami pierwszego rzędu, wybierz alternatywny obszar obrazowania.

Pomimo zalet, protokół ten ma kilka istotnych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przy ocenie jego zastosowania i wydajności. Po pierwsze, dokładna ekstrakcja spektralna opiera się na wystarczającym odstępie przestrzennym między pojedynczymi zdarzeniami pojedynczymi; Wysoka gęstość lokalizacji, taka jak ta powstała z dużych skupisk żelu DNA lub gęsto upakowanych makrocząsteczek, może prowadzić do nakładających się śladów widmowych pierwszego rzędu, które komplikują lub uniemożliwiają wiarygodną rekonstrukcję widma. Po drugie, metoda jest wrażliwa na optyczne wyrównanie i stabilność ostrości, ponieważ drobne niewyrównania dwuklinowego pryzmatu lub odchylenia od optymalnej płaszczyzny ogniskowej mogą wprowadzać systematyczne błędy w kalibracji długości fali i zmniejszać stosunek sygnału do szumu. Po trzecie, protokół obecnie nie implementuje spektralnego demiksowania, ograniczając jego zastosowanie w próbkach o wysokiej gęstości cząsteczkowej lub wielu spektralnie nakładających się na siebie gatunkach. Łącznie te czynniki definiują praktyczny reżim działania metody i powinny być starannie brane pod uwagę przy rozszerzaniu protokołu na bardziej złożone lub zatłoczone systemy biologiczne.

W tym protokole RainbowSTORM służy wyłącznie do kalibracji spektralnej, choć oprogramowanie oferuje także zaawansowane narzędzia do kalibracji 2D/3D, analizy danych sSMLM oraz rekonstrukcji obrazów. Takie narzędzia analityczne są dobrze przystosowane do łączenia informacji o lokalizacji przestrzennej z odczytami spektralnymi w spektroskopowym obrazowaniu superrozdzielczym i mogą być dalej wykorzystywane w przyszłych rozszerzeniach tego protokołu. Wreszcie, protokół ten jest potencjalnie możliwy do wykonania dla innych typów biologicznych makrocząsteczek43, 44, 45, takich jak RNA, tubulina itp. Wykryte widmo może być dodatkowo wprowadzane do modeli obliczeniowych, takich jak modele głębokiego uczenia46, w celu przeprowadzenia klasyfikacji, a tym samym przewidywania struktury sekwencji lub cząsteczki na podstawie widm wewnętrznych pod różnym oświetleniem oraz właściwościami fotofizycznymi. To badanie toruje również drogę do obrazowania chromatyny bez oznakowania, molekularnie specyficznego, co pozwala uniknąć zewnętrznego znakowania lub denaturacji struktur natywnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają ze sobą rywalizujących interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane grantami R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 i U54CA268084 od National Institutes of Health oraz grantem CBET-2430743 od National Science Foundation. Dziękujemy laboratorium prof. Hao F. Zhanga na Northwestern University za ich urządzenie z podwójnym klinowym pryzmatem jako kluczową część spektroskopowego systemu SMLM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr emisyjny 488 nm do obrazowaniaChroma Technology Corp.ET525/50M
Filtr przepustowy 532 nm do kalibracjiThorlabsFL532-3
Filtr emisyjny 532 nm do obrazowaniaChroma Technology Corp.ET620/60M
Filtr pasmowy 580 nm do kalibracjiThorlabsFB580-10
Filtr pasmowy 633 nm do kalibracjiThorlabsFL632.8-3
Filtr pasmowy 680 nm do kalibracjiThorlabsFB680-10
Filtr przepustowy 750 nm do kalibracjiThorlabsFB750-10
Beta-merkaptoetanol  SigmaM6250
Bufor obrazowania BMENANA7 μ L GLOX, 7 μ L Beta-merkaptoetanol oraz 690 μ Bufor glukozy L-L
Katalaza z wątroby bydłaSigmaC100
DABCO (1,4-di-azobicyclo-(2.2.2.)-oktan)SigmaD27802
Bufor obrazowania DABCONANA65 mM DABCO + 30 mM siarczyn sodu + 30 mM DTT 1 M  w DNA, wolna od RNA, zdejonizowana woda. Siarczyn sodu powinien być rozpuszczony w PBS 10 i razy; do 1 M przed utworzeniem bufora obrazowania.
Deplex DNA dla spektroskopowego SMLMIDTNAPara dwuniowych GC_alter GC_conti, AT_alter i AT_conti.
np. GC_alter ma oba włókna o długości 5' - GCGCGCCGCGCGGCGCGC - 3'; GC_conti ma jedną nitkę o wartości 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' a trzeci jako 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
Wszystkie próbki są zgodne ze standardem HPLC.
Oligonukleotyd DNA/DNA dwunicioweIDTNA
Oligotechniki DNA dla spektroskopowego SMLMIDTNA20-bazowe A, G, C, T; 40-bazowy łańcuch AC z pojedynczym łańcuchem (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   gwana jednoniowa 5-, 8-, 12-, 16-podstawowa.
np. A10C10 to
5'- AAAAAAAAAACCCCC
CCCCCAAAAAAAA
AACCCCCCCCCCCC - 3'
Wszystkie próbki są w standardzie HPLC.
Woda destylowana wolna od DNazy/RNazyInvitrogen10977015
DTT (DL-Ditiothreitol)Sigma43816
GLOXNANA14 mg oksydazy glukozy, 50 i mu; L katalaza (17 mg/ml) + 200 μ L bufor A, który ma 10 mM Tris (pH 8,0) i 50 mM NaCl. 
Bufor glukozowyNANA50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl i 10% glukozy.
Oksydaza glukozySigmaG7141
Glukoza, proszekThermo Fisher15023021
PBS (10X)Thermo FisherJ62036. K3
PBS (1X)Gibco10010023
Chlorek soduThermo Fisher424290010
Siarczyn sodu & nbsp;SigmaS0505
Tris (1M) pH 8,0InvitrogenAM9856

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie cz steczek DNAfluorescencja wewn trznaobrazowanie genomiczne bez znakowanialokalizacja pojedynczych cz steczekprzygotowanie elu DNAanaliza widmowastochastyczne migotaniewtyczka ThunderSTORMoprogramowanie RainbowSTORM

Powiązane artykuły