Nowy protokół uszczelniający do produkcji wodoodpornych uszczelek silikonowych dla membran urządzeń z układem polidimetylosiloksanu (PDMS). Przeznaczony do laboratoriów do tworzenia modeli chipów oraz rozwoju małych platform chipowych. Demonstrujemy protokół przy użyciu plastikowych i natywnych błon tkankowych. Procedura ta wymaga jedynie PDMS, toluenu, formy, membrany i komory próżniowej.
Artykuł metodologiczny
Dostępna procedura uszczelniania silikonu chip-to-membrana dla elastycznego i niezawodnego łączenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Platformy organ-on-chip to szybko rozwijający się aspekt badań biomedycznych. Rozwój tej dziedziny przyniósł szereg różnych materiałów i metodologii ich konstrukcji i zastosowań. Chociaż liczba różnych urządzeń – zarówno komercyjnych, jak i rozwijanych w środowisku akademickim – stale rośnie, dla nowych badaczy wchodzących w dziedzinę organ-on-chip zwykle pozostaje do podjęcia duży krok do podjęcia. Jednym z kluczowych zagadnień zarówno w nowatorskich, jak i bieżących technologiach układów scalonych pozostaje zapewnienie bezpiecznego i wolnego od wycieku uszczelnienia urządzeń chipowych. W tym artykule przedstawiamy nową ścieżkę rozwoju chipów, prezentując proces uszczelniania chipów, który zapewnia niezawodne, szczelne połączenia między silikonowymi chipami a trzema membranami hodowlanymi z różnych materiałów. Przedstawiona procedura jest dostępna dla rozwoju nowych układów scalonych przy ograniczonych materiałach wejściowych i zapewnia interfejs powietrze-ciecz (ALI) Organ-on-Chip. Te chipy przeznaczone są do hodowli komórek podawanych przez porowatą błonę i wierzchołkowo wystawionych na powietrze, na przykład w Gut-, Skin- lub, jak w przypadku przedstawionym tutaj, Airway-on-chip. Oferujemy dwa różne projekty form 3D, pokazujące ich wiązanie z komercyjnie dostępnymi plastikowymi membranami oraz rusztowaniami z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) dla świń. Ten Airway-on-Chip można wyprodukować we własnym zakresie; przedstawiono tutaj różne przeszkody, które można napotkać, oraz pokaz ich wcześniejszego zastosowania jako Airway-on-Chip. Nowa procedura uszczelniania polega na próżnieniu zaprawy polidimetylosiloksanu (PDMS) rozcieńczonej toluenem w celu usunięcia toluenu, co prowadzi do powstania cienkiej i mocnej powłoki silikonowej osadzonej w porowatej powierzchni plastiku lub natywnej membrany ECM. Drugą nowością tej procedury jest utwardzanie zaprawy PDMS w temperaturze pokojowej, aby zapobiec uszkodzeniu membran spowodowanych różnym rozszerzaniem cieplnym w materiałach uszczelnianych razem. Prowadzi to do szeroko stosowalnej techniki wiązania testowanych materiałów, tworząc wielokomorowe układy PDMS z membranami hodowli wewnętrznych.
Wprowadzenie
Urządzenia organ-on-chip stają się fundamentem badań biomedycznych, a w laboratoriachna całym świecie rozwijane jest szeroki wachlarz modeli komercyjnych i otwartych 1. W miarę jak modele te stają się kluczową częścią badań, zastępując tradycyjne statyczne modele plastikowe i zwierzęce 2,3, coraz ważniejsze jest, aby były łatwo dostępne i dostępne dla badaczy o różnych środowiskach na całym świecie. Kluczową częścią tego jest dostępność realizacji indywidualnego, małopartiowego rozwoju, niezależnego od nakładów i kosztów produkcji4, zwłaszcza w modelach niekomercyjnych lub akademickich1.
Jednym z największych wyzwań w technologiach On-Chip jest zapewnienie bezpiecznego uszczelnienia chipów bez wycieków podczas przepływu. Niedawny przegląd testów nieszczelności w urządzeniach chipowych wskazał wyciek między komorami lub do środowiska jako główny sposób awarii modelowych i eksperymentalnych, zarówno w przemyśle, jak i w środowisku akademickim 5,6. Istnieje wiele powodów niepowodzenia w uzyskaniu skutecznego uszczelnienia: małe wymiary urządzeń, przepływ i ciśnienie, a przede wszystkim fakt, że urządzenia te składają się z różnych materiałów, uszczelnionych warstwami i połączonych różnymi procesami6. Zakres różnych materiałów wykorzystywanych jako membrany hodowlane w platformach chipowych jest tak szeroki, jak zakres ich zastosowań, w tym polietylen-tereftalan (PET), poliwęglan (PC), PDMS oraz membrany ECM1. W związku z tym istnieje wiele różnych procedur i metod leczenia łączenia tych różnych materiałów z gotowymi urządzeniami. Procedury te obejmują kompresję klejem/PDMS, plazmową chemię silanową, funkcjonalizację chemiczną struktur, elektrospining oraz wiązanie rozpuszczalników parowanych, w zależności od materiałów użytych w modelu7. Fakt, że te procesy wymagają różnych umiejętności i środowisk laboratoryjnych, nakłada pewne ograniczenia na akademicką dostępność badań na chipie. Zidentyfikowano, że podczas gdy koszty i ograniczenia związane z korzystaniem z systemów komercyjnych ograniczają dostęp akademicki, długotrwałe, wieloetapowe procesy budowy chipów i wymaganego sprzętu ograniczają ich samodzielny rozwój akademicki 1,8,9. Na czele tych badań jednym z obecnych problemów jest standaryzacja i walidacja modeli pod kątem ich powtarzalności10,11. Jednak dla wielu laboratoriów, które próbują rozpocząć rozwój układów scalonych, wciąż istnieje luka w osiągnięciu tego punktu, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze, zastąpić pracę na zwierzętach i pracować w modelach bardziej istotnych biologicznie12.
W tym artykule przedstawiamy proces uszczelniania chip sealing, który wymaga jedynie umiejętności i sprzętu dostępnego w większości środowisk badawczych. Procedura ta pozwala uzyskać wodoodporne interfejsy PDMS chip-membrana dla trzech różnych materiałów membranowych. Proces ten wymaga jedynie ograniczonego czasu pracy aktywnej, może być realizowany w środowiskach laboratoryjnych bez układów scalonych i może być skalowany od produkcji małych do średnich partii chipów.
Przedstawiony proces uszczelniania może być wykonany za pomocą porowatych membran plastikowych lub ECM; Przykładowe układy scalone są zbudowane zgodnie z tą procedurą i mogą być stosowane jako urządzenia do posiadania dróg powietrznych z ekspozycją na powietrze. Procedura ta może być stosowana w innych podobnych urządzeniach, pod warunkiem, że błony zawierają pory, które są niezbędne do zabiegu. Główne zastosowanie dostarczonych chipów to hodowla ALI oraz komórki nabłonkowe dróg oddechowych, ale mogą być stosowane także w innych zastosowaniach oraz modelach współhodowli z komórkami mezenchymalnymi lub jelitowymi, na przykład 8,13. Pierwszym dostarczonym chipem jest standardowy układ dróg oddechowych na chipie z dużą powierzchnią hodowli (92mm2) z dwoma komorami hodowlanymi, w tym komorą wierzchołową do ekspozycji powietrza, oddzieloną przez porowatą błonę od komory podstawowej zawierającej podłoże oraz opcjonalnie inny typ komórek hodowlanych pod wodą (np. fibroblasty, komórki śródbłonka). W zastosowaniach ALI kluczowe jest, aby komórki z zasiewem wierzchołkowym były w stanie utrzymać szczelną barierę, zapobiegającą przeciekowi medium do kanału górnego. Drugi chip ma tę samą konstrukcję co pierwszy, z dwoma dodatkowymi komorami po obu stronach membrany, tutaj z wykorzystaniem ECM wieprzowego, aby ułatwić rozciąganie membrany hodowli poprzez zastosowanie podciśnienia, imitując rozciąganie naturalnych dróg oddechowych.
Nasz proces uszczelniania łączy kilka elementów z dziedziny rozwoju układów PDMS z dodatkiem nowych warunków, które są dwojakie. Po pierwsze, szybkie zastosowanie próżni do zaprawy PDMS rozcieńczonej toluenem, która zapobiega chemicznemu atakowi toluenu na błony, sprzyja przenikaniu silikonu do porów lub powierzchni membrany oraz prowadzi do powstania cienkiej, odpornej na przemieszczenie powierzchni. Toluen powoduje pęcznienie i deformację powierzchni PDMS, ale w wysokim stężeniu działa jak rozpuszczalnik, stąd jego zastosowanie do rozcieńczania ciekłych PDMS w tej procedurze. W przypadku tworzyw sztucznych, takich jak membrany PC i PET użyte tutaj, toluen powoduje zniekształcenia i pękanie naprężeniowe, jeśli nie zostanie szybko usunięty. Niezbędne jest, aby przy ręcznym nakładaniu zaprawy stosować ją tylko na ścianę gotowej połowy wióra i nigdy nie dostać się jej do obszaru hodowli, ponieważ zablokuje to pory błon hodowlanych i powoduje powstawanie PDMS, które spowodują zakłócenia i zmiany w zdolności hodowli komórkowej. Po drugie, utwardzanie zaprawy PDMS w temperaturze pokojowej (RT) przez 72 godziny zapobiega przesunięciu membrany zarówno od części chip-half, jak i zaprawy, co może nastąpić, gdy materiały kurczą się do różnych stopni po rozszerzaniu termicznym.
Oferujemy dwa projekty form do wiórów, które można wykonać za pomocą drukarki 3D lub mikro-frezarki (jak opisano w Pliku Uzupełniającym 1, Plik Uzupełniający 2), a także metodę tworzenia cienkiej zaprawy z PDMS i toluenu14. Zastosowanie tej metody umożliwia uszczelnianie komercyjnych membran plastikowych (PET, PC) wewnątrz urządzenia. Dodatkowo przetestowaliśmy zakres zastosowań tego procesu, tworząc ten sam układ z wieprzową natywną membraną ECM, aby uzyskać biologiczny układ o zdolności cyklicznego rozciągania. Ponieważ Organ-on-Chips mają odwzorować fizjologiczne właściwości środowiska in vivo , Air-on-Chips, które mają zdolność wytwarzania sił mechanicznych doświadczanych przez ciało podczas oddychania, takich jak naprężenia ścinające od przepływającego powietrza czy mechaniczny krajobraz zwężających się dróg oddechowych, są wysoce istotne biologicznie16. Błona stosowana składa się z błony bazalnej, lamina propria, a także kolagenu, lamininy i innych otaczających białek macierzowych. Z naszej wiedzy jest to pierwszy natywny układ bazowy oparty na błonie podstawowej oraz pierwszy z możliwością rozciągania, co ułatwia naśladowanie mechanicznego obciążenia np. podczas oddychania na membranie ECM15 z niesilikonu. To nowatorskie zastosowanie podkreśla funkcję naszej procedury uszczelniania z użyciem plastiku i ECM. Na koniec przedstawiamy zastosowanie tej procedury uszczelniania chipów i membran jako Airway-on-Chip, który może być używany do hodowli komórek ALI8.
Protokół
Badanie to było zwolnione z zatwierdzenia przez komisję etyki na mocy Ustawy o eksperymentach na zwierzętach, ponieważ materiały pochodziły z pośmiertnych przypadków i żadne zwierzęta nie były składane w ofierze do celów naukowych (Wet op de dierproeven). Protokół izolacji pierwotnych komórek nabłonkowych dróg oddechowych był zgodny z kodem badawczym Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg dostęp 14 stycznia 2025) oraz krajowymi i etycznymi wytycznymi zawodowymi dotyczącymi wykorzystania materiału z ludzkiego ciała (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf dostęp 14 stycznia 2025). Badanie to zostało zwolnione z wymogu zatwierdzenia przez komisję etyczną, ponieważ tkanka tchawicowa pozostała po przeszczepach i została całkowicie zanonimizowana zgodnie z holenderskim Kodeksem Cywilnym oraz Wet op de orgaandonatie (ustawą o dawcach).
1. Przygotowanie połowy chipu i błony
- Produkcja chipów
- Pobierz . Pliki projektowe STL dla górnej i dolnej połowy układu pochodzą z Pliku Uzupełniającego 1 i Pliku Uzupełniającego 2 tego artykułu. Górna forma daje 5 mm głęboką wiórową półkę, dolna forma 3 mm; Obie połowy chipu mają komory hodowlane o głębokości 1 mm. Alternatywnie, można stworzyć projekt układu za pomocą odpowiedniego oprogramowania CAD.
- Przygotuj pilnik do druku 3D lub ścieżkę do mikrofrezowania form do wiórów. Formy mikrofrezowane będą gotowe do użycia; Formy z nadrukiem żywicznym wymagają dwóch 24-godzinnych myć 99,9% etanolem przed sieciowaniem UV, aby odpowiednio przygotować je do użycia jako forma PDMS.
- Produkcja połowy układu PDMS (Rysunek 1)
- Dokładnie wymieszaj bazę ciekłego PDMS z utwardzającym środkiem w proporcji 10:1 i odgazuj w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte.
- Napełnij formy strzykawką z szeroką dyszą, odgazuj przez ~10 minut w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Umieść formy w suchym piekarniku, aż będą się pekły przez 2 godziny w 65 °C.
- Usuń solidne połówki wiórów z form skalpelem i wytnij obróbkę z krawędzi. Dodaj cztery wloty do górnej połowy na każdym końcu komory oraz dwa sąsiadujące pierścienie wskazujące lokalizację wlotów dolnej komory za pomocą wyciskacza biopsyjnego.
UWAGA: Do przedstawionych wyników użyto dziurkarza do biopsji o średnicy 2 mm oraz włożono silikonową rurkę o średnicy 2 mm dla medium i przepływu powietrza podczas hodowli. Wloty o średnicy 1 mm i 2 mm umożliwiają siew komórek pipetą, odpowiadając odpowiednio końcówkom 200 i 1000 μm. Inne rozmiary dziurków mogą być stosowane do różnych systemów rur lub pomp.
- Przygotowanie błony (Rysunek 2)
- Pobierz . Pliki projektowe STL dla szablonu membranowego z Pliku Uzupełniającego 3 w tym artykule. Przygotuj szablon za pomocą druku 3D lub równoważnej metody wytwarzania, aby zapewnić jednolity kształt membrany.
- Umieść szablon na membranie PET lub PC, trzymając ją mocno, gdy membrana jest wycięta skalpelem.
UWAGA: W tym momencie błony mogą być pokryte białkami matrycowymi do hodowli komórek w szalce Petriego bez zakłócania wiązania błony. Zapewni to, że funkcjonalizacja tylko błony będzie funkcjonalizowana do wzrostu komórek, pozostawiając ściany PDMS wolne od komórek, jak opisano wcześniej8.
2. Wiązanie błonowe
- Przygotowanie moździerzy PDMS
- Wymieszaj płynny PDMS (krok 1.2.1) z toluenem w proporcji 7:5 i dokładnie wymieszaj, strzykawając strzykawką z szeroką dyszą, jak opisano wcześniej14. Na każdy chip potrzebne jest tylko 8 dropów; Zaleca się 1,4 mL PDMS z 1 mL toluenem na partię zaprawy i wystarczy na 8 chipów tej skali. Równomierne mieszanie zaprawy jest ważne dla niezawodnego wiązania membran.
UWAGA: Toluen jest lotny i wysoce łatwopalny. Ekspozycja może powodować uszkodzenia układu nerwowego i oddechowego. Używaj wyłącznie w okapie spalinowym, z dala od źródła zapłonu, a wycieki radzą sobie za pomocą materiału chłonnego i wentylacji. Podczas manipulacji należy nosić gogle ochronne, aby chronić przed chlapaniem i nieprzepuszczalnymi (nitrylowymi) rękawicami. Wszystkie materiały laboratoryjne (końcówki pipety, pojemniki itp.) przebywają 24 godziny na godzinę w okapie oparowym, po czym toluen wyparuje, a wszystkie materiały można utylizować w zatwierdzonych, oznaczonych pojemnikach za pośrednictwem specjalistycznych usług odpadów. Nigdy nie wyrzucaj toluenu do zlewu. Więcej informacji można znaleźć w Kartce Danych Bezpieczeństwa (SDS).
UWAGA: Przygotuj zaprawę w miejscu użycia, aby zapobiec przedwczesnemu odparowaniu toluenu i zanieczyszczeniu plastiku, w pojemniku nieszklanym, najlepiej jednorazowym, i wyrzuć bezpośrednio po użyciu. PDMS utwardza powierzchnię szkła i jest częściowo nieusuwalna; Toluen rozpuszcza i uszkadza większość plastików powszechnie stosowanych w laboratorium.
- Wymieszaj płynny PDMS (krok 1.2.1) z toluenem w proporcji 7:5 i dokładnie wymieszaj, strzykawając strzykawką z szeroką dyszą, jak opisano wcześniej14. Na każdy chip potrzebne jest tylko 8 dropów; Zaleca się 1,4 mL PDMS z 1 mL toluenem na partię zaprawy i wystarczy na 8 chipów tej skali. Równomierne mieszanie zaprawy jest ważne dla niezawodnego wiązania membran.
- Mocowanie membrany PET/PC (Rysunek 2)
- Szybko nałóż zaprawę na powierzchnię połowy chipu PDMS, gdzie zostanie umieszczona membrana, za pomocą końcówki pipety.
UWAGA: Cały obszar pod membraną musi być zwilżony zaprawą. Należy nałożyć mocne ułożenie końcówką, aby uzyskać jak najcieńszą warstwę. Mikroskopia wskazuje, że warstwy mają od 3 do 5 μm. - Trzymaj przygotowaną membranę (krok 1.3) na jednym końcu czystą parą kleszczy, umieść końcówkę na mokrej zaprawie w odpowiednim miejscu dla wióra i pozwól, by membrana opadła na miejsce.
UWAGA: Nie pozwól, by błona przesuwała się po tym punkcie; mokre PDMS wchodzące do komory powodują nieregularne, nieużyteczne ściany błony. Jeśli nastąpi przesunięcie, silikon pokryje obszar hodowli, co zakłóci potencjał hodowli komórkowej po obu stronach błony, odrzuci ją i powtórzy poprzedni krok. - Delikatnie przytrzymaj membranę na miejscu kleszczemi i ponownie nałóż zaprawę PDMS na wierzch membrany, delikatnie oddalając się od komory przy każdym ruchu, aby usunąć pęcherzyki i zabezpieczyć membranę bez przesuwania jej z pierwotnej pozycji.
UWAGA: Uważaj, aby nie stosować PDMS w wewnętrznym obszarze hodowli błony; Jest to niezbędne, ponieważ silikon zapobiega przyczepności komórek i zakłóca naturalną powierzchnię błony hodowlanej. - Umieść połówki wiórów z membranami bezpośrednio po mokrym przymocowaniu zaprawy do komory próżniowej i utwardzaj je w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 25 mBar przez 72 godziny.
UWAGA: Połówki wióra z przymocowanymi membranami muszą być utwardzane w temperaturze pokojowej. PET/PC i PDMS doświadczają różnych stopni rozszerzalności cieplnej, a utwardzanie termiczne powoduje rozszerzanie się silikonu, a następnie kurczenie się podczas schładzania, tworząc naprężoną membranę (Rysunek 3).
- Szybko nałóż zaprawę na powierzchnię połowy chipu PDMS, gdzie zostanie umieszczona membrana, za pomocą końcówki pipety.
- Kompletna konstrukcja układu scalonego
- Do drugiej połowy układu można teraz przymocować połówki chipu związane z membraną. Aby uzyskać najbardziej spójne efekty, poddaj obie połówki zabiegowi plazmyO2 (320 mBar, 30 s) i szybko je dociskaj ręcznie pod lekkim naciskiem.
UWAGA: Piekarniki plazmowe tlenu wytwarzają środowiska nasycone tlenem, niebezpieczne tlenki, takie jak ozon, oraz intensywne promieniowanie UV. Piekarniki powinny być zainstalowane w dobrze wentylowanym miejscu lub w okapach spalinowych. Okno piekarnika powinno blokować promieniowanie UV, ale zaleca się noszenie gogli. Materiały łatwłatwopalne i metale powinny być trzymane z dala od obszaru plazmy tlenowej, aby zapobiec przyspieszeniu spalania lub uwolnieniu toksycznych oparów. Odwołanie się do dokumentu SDS plazmy tlenowej jest niezbędne do stosowania z innymi materiałami niż te wymienione w tym protokole.
UWAGA: Jeśli nie ma dostępnego piekarnika plazmowego, podobne wiązanie można osiągnąć za pomocą rurki plazmowej lub przez nałożenie zaprawy PDMS na drugą połowę i utwardzanie połówek w temperaturze pokojowej pod lekkim sprężaniem przez 72 godzinyi 13 godzin. Chociaż są mniej skuteczne w porównaniu do pełnego piekarnika plazmowegoO2 , te opcje mogą być stosowane, gdy piekarniki nie są dostępne.
- Do drugiej połowy układu można teraz przymocować połówki chipu związane z membraną. Aby uzyskać najbardziej spójne efekty, poddaj obie połówki zabiegowi plazmyO2 (320 mBar, 30 s) i szybko je dociskaj ręcznie pod lekkim naciskiem.
Wyniki
Test integralności uszczelnienia membranowego
Aby sprawdzić integralność szczelnego odłamku, górna komora hodowla jest wypełniana półwodą demi-wodą z niebieskim barwnikiem, a dolna czystą półwodą. Odpryski zostawia się na noc, aby ocenić możliwy przeciek niebieskiego barwnika z górnej komory wokół membrany do dolnej komory.
W pełni wykonane silikonowe chipy przygotowane naszą metodą mogą być deformowane wzdłuż do 35° bez zakłócania integralności membrany, teraz otoczone i połączone z górną połową elastycznym zaprawą PDMS po obu stronach. Odkształcenie chipów PDMS jest normalną częścią użycia, na przykład gdy połowy lub chipy przyklejają się do szalki Petriego.
Układy były podłączane do dwukierunkowego systemu pompy strzykawkowej, aby przetestować ich wydajność przy ciśnieniu indukowanym przepływem. Układy z membranami PET i PC mogą być uruchamiane bez nieszczelności między komorami lub pęknięć układów do 30 kPa (maksymalnego ciśnienia zapewnianego przez pompy). W poprzednich badaniach układy standardowo pracowały z prędkością 150 μL/h, co wywiera nacisk 0,7 Pa na komory każdego urządzenia8.
Wizualizacja wiązania błony
Aby zobrazować wnikanie ciekłej zaprawy PDMS do 0,4 μm porów membrany pod mikroskopem w wyniku próżniowego uszczelniania RT, zaprawa PDMS została zabarwiona czerwienią nilową. Wybrano Nile Red, ponieważ jest to barwnik hydrofobowy i dobrze łączy się z PDMS w stanie ciekłym. Bejcę przygotowywano przez dokładne wymieszanie 1% Nile Red z płynnym PDMS, aby uzyskać czerwony kolor pod mikroskopią świetlną. Procedura utwardzania RT została powtórzona zgodnie z opisaniem powyżej. Membrany z barwioną zaprawą osadzono w parafinie i przecięto mikrotomem. Plastry membrany montowano na szkiełkach szklanych i obrazowano za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 4). Aby zweryfikować konieczność rozcieńczania PDMS do zaprawy za pomocą toluenu oraz zastosowania próżni do penetracji PDMS do porów błon, porównanie membran z i bez tych metod można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym 3.
Test żywotności komórek
W poprzednim badaniu testowano potencjalną toksyczność chemiczną wynikającą z użycia toluenu w konstrukcji urządzeń. Chipy zostały przygotowane z toluenem i bez niego w moździerzu PDMS, komórki nabłonka nabłonka płuc u człowieka Calu-3 zostały wyhodowane do połączenia przez 2 dni, a następnie hodowane przez 1 dzień w chipach, jak opisano wcześniej8. Śmierć komórek oceniano za pomocą barwienia Trypana na niebiesko, usuwania wszystkich komórek z urządzenia oraz liczenia martwych komórek (niebieskich) na niezabarwionych żywotnych komórkach. Proliferację oceniano poprzez inkubację odczynników w ośrodku chipowym przed wykonaniem testu AlamarBlue, odczytując absorpcję fluorescencyjną za pomocą czytnika płytowego, co odzwierciedla proliferację (Rysunek 5)8.
Przyczep membrany podstawowej ECM
Aby pokazać ogólną przydatność tej procedury w wytwarzaniu silnego i elastycznego wiązania z różnymi błonami, protokół powtórzono z w pełni opartą na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (Rysunek 6). Podstawna błona zawierająca rusztowania ECM została przygotowana z pęcherzy moczowych wieprz, jak opisano wcześniej17. W skrócie, pęcherze moczowe wieprząt od samic w wieku od 4 do 8 miesięcy pozyskano z lokalnej rzeźni (Kroon Vlees b.v., Groningen, Holandia) i przetwarzano w ciągu 3 godzin po pobraniu. Tkanka łączna i tłuszcz zostały usunięte z pęcherza, pęcherz odwrócono na lewą stronę, a warstwę nabłonka rozcięto tępo, przy jednoczesnym zachowaniu tkanki w PBS w temperaturze pokojowej. Rusztowania ECM były odwodnione w ramach procedury przymocowania błony17. Przygotowane rusztowania były cięte i przywiązywane do połow układów PDMS, jak opisano w powyższym protokole. Wykonano nową formę z dodatkowymi komorami do rozciągania membran wewnątrz urządzenia, aby wykazać, że próżniowe wiązania silikonowe mogą również wytrzymać poziome naprężenia mechaniczne (Plik uzupełniający 2).
Test integralności membrany ECM
Test integralności uszczelnienia membranowego przeprowadzono w sposób wyżej. Następnie chip rozciągający był podłączany do pomp strzykawkowych, które wyciągały próżnię z bocznych komór urządzenia, tworząc 1 mm poziomego rozciągnięcia membrany ECM przez noc (rysunek 7).
Różnicowanie komórek nabłonkowych i współhodowla fibroblastów w standardowej dróg oddechowych na chipie z membraną PET
Aby zweryfikować wydajność dostarczonego układu jako drogi powietrznej na chipie dla komórki ALI, komórki Calu-3 z gruczolakiem płuca u człowieka (ATCC, Manassas, VA, USA) zostały wyhodowane do zbiegu i wystawione na powietrze w urządzeniu, w poprzednim badaniu8. Po 10 dniach ekspozycji na powietrze wierzchołkowe komórki nabłonkowe Calu-3 mogą się różnicować w komórki produkujące śluz, co potwierdza produkcja śluzu, mierzona barwieniem błękitu alcjańskim (Rysunek 8)8.
Aby zweryfikować naszą procedurę długotrwałego przepływu bez przecieków i współkultury, można zobaczyć przykład z wcześniejszej publikacji; Pełną metodologię hodowli komórkowej można znaleźć w tym artykule8. Komórki nabłonka dróg oddechowych u człowieka były hodowane w komore hodowli wierzchołkowej chipa pod stałym przepływem powietrza przez 21 dni, a pierwotne fibroblasty dróg oddechowych hodowane były do góry nogami po przeciwnej stronie błony. Krótko mówiąc, komórki nabłonka pierwotnych dróg oddechowych zostały wyizolowane za pomocą leczenia proteazą (0,2 mg/mL w HBSS, 2 godziny, 37 °C), zeskrobania komórek oraz kriokonserwacji komórek pobranych z pozostałej tkanki tchawicowej od 3 zdrowych dawców płuc, od których nie było dostępnych dalszych informacji. Fibroblasty ludzkich dróg oddechowych (AF) zostały wyizolowane w ten sam sposób z tkanki oskrzeli przeszczepionego tkanki płuc POChP, od jednego dawcy.
Na Rysunku 9 można zobaczyć grafikę chipu oraz to, jak wymienione komórki wyglądają zarówno przez, jak i wzdłuż komór urządzenia.
Hodowla komórek nabłonkowych w współhodowli z fibroblastami na błonie ECM
Rusztowanie zawierające błonę podstawną ułatwia hodowlę komórek nabłonkowych i mezenchymalnych. Uwiecznione ludzkie keratynocyty (komórki HaCaT) zostały zasiane z gęstością 60 x 103 komórek /cm 2 po stronie nabłonkowej (wewnętrznej) błony, a żywotność wynosiła 95% po 24 godzinach w porównaniu do 91% w kolbie do hodowli komórek plastikowych (Rysunek 10A). Następnie prawidłowe fibroblasty MRC-5 w ludzkim płucu zostały zasiane z gęstością 60 x 103 komórek /cm 2 na stronę stromalną (zewnętrzną) i hodowane w kokulturze z komórkami HaCat przez 14 dni, aby ocenić długoterminową żywotność nabłonkową i mezenchymalną dla współhodowli na rodzimej błonie ECM (Rysunek 10D). Komórki nabłonkowe tworzyły zbieg monowarstwy po wewnętrznej stronie błony, podczas gdy fibroblasty rozmieszczone były rzadziej na zewnętrznej powierzchni błony ECM, ale zachowały charakterystyczną morfologię przypominającą wrzeciona (rysunek 10C). Wideo z rekonstrukcją 3D można zobaczyć w Pliku Uzupełniającym 417.
Obecne badanie przedstawiło ulepszoną procedurę uszczelniania membrany, która zapewnia silne połączenie PDMS z membraną, zdolne do odporności na zakłócenia spowodowane ręcznym handlem chipem oraz umożliwiające długotrwałą hodowlę pod przepływem przy ciśnieniu do 0,7 Pa. Wykazaliśmy, że te membrany są związane silikonem, który przeniknął przez ich pory do błon hodowlanych, ułatwiając kowalencyjne wiązania silanowe między dwiema połówkami chipu a próżniowym zaprawem PDMS. Dodatkowo, przedstawiona procedura nie powoduje cytotoksyczności, pod warunkiem prawidłowego zastosowania zaprawy. Ponadto powstałe chipy umożliwiły długotrwałe współkultury nabłonkowe mono- i nabłonkowo-mezenchymalne. Chociaż procedura ta dotyczy wyłącznie błon porowatych, pozostaje metodą o niskim poziomie wejścia do produkcji niezawodnych i gotowych do hodowli komórek układów ALI.
Rysunek 1. Grafika produkcji połowy układu PDMS i przygotowania membran . W produkcji połowy chipów PDMS (krok 1.2) formy do wiórów wypełnia się płynnym PDMS za pomocą szerokiej dyszy strzykawki, 4,4 mL w górnej formie i 2,4 mL w dolnej formie. Połówki PDMS są utwardzane przez 2 godziny w temperaturze 65 °C, po czym 4 wloty w górnej połowie wióra są wybijane na końcach komory i wskazanych w formie. Do przygotowania membrany (krok 1.3) szablon błony drukowanej jest mocno przymocowany do powierzchni membrany. Za pomocą nowego ostrza przecina się szablon i usuwa membranę wiórową z otaczającego materiału. Błony mogą być powlekane do hodowli komórkowej lub używane bezpośrednio w kroku 2. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2. Procedura wiązania błony. Moździerz PDMS jest mieszany zgodnie z opisaniem powyżej bezpośrednio przed użyciem. Zaprawa kapie na cztery narożniki komory hodowlanej i delikatnie rozprowadza się wokół miejsca wiązania błony za pomocą skośnego końca pipety. Jeden koniec membrany kładzie się na zaprawie, a następnie, gdy jest wyrównany z komorą hodowlą, delikatnie pozwala, by opadła na miejsce. Zaprawa jest ponownie nakładana kroplami i malowana na krawędziach membrany, z dużą ostrożnością, aby silikon nie dotknął powierzchni membrany wewnątrz miejsca hodowli. Błony związane z połową odłamku są natychmiast umieszczane w komorze próżniowej, aby usunąć mikropęcherzyki, zapewnić przenikanie silikonu w powierzchnię i pory oraz usunąć toluen, aby zminimalizować atak chemiczny na membranę. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3. Przykłady umieszczania membran.(A) Pomyślne założenie membrany, utwardzanie w RT. (B) Wiązanie błony utwardzone w piecu (65 °C zamiast przy RT), membrana może być widoczna jako rozszerzająca się w komorze podczas kurczenia się silikonu po podgrzewaniu. (C) Kompletne układy z prawidłowym ułożeniem membran PET i PC. (D) Nieprawidłowe umieszczenie membrany spowoduje zmianę objętości każdej strony układu wraz z ruchem membrany, powodując zmienny przepływ i wywierając napięcie na komórki wewnątrz układu oraz pompy przymocowane do chipu. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 4. Obrazy mikroskopem świetlnym przeciętych i zamontowanych membran PET i PC. Pokazujemy inwazję silikonu w pory błonowe w wyniku naszej procedury utwardzania RT w próżni. (A) Obrazy tej samej błony bez zastosowanego PDMS, widoczne są przezroczyste pory oraz czysta powierzchnia na zdjęciu spolaryzowanym. (B) Zaprawa PDMS została zabarwiona czerwienią nilową, a silikon w barwach magenta skutecznie wniknął w pory i cienko pokrywał powierzchnię pod próżnią. Podkreślone białymi/magentowymi kształtami. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 5. Żywotność komórek w urządzeniach chipowych nie została zmieniona przez konstrukcję, niezależnie od tego, czy toluen jako środek rozrzedzający w moździerzu PDMS, czy bez niego. Komórki Calu-3 zostały zasiane w ilości 6,5 × 10 komórek4 na chip i po osiągnięciu połączenia były inkubowane przez noc, zanim przeprowadzono test AlamarBlue na supernatancie i TrypanBlue na komórkach. Różnice między grupami (n=4) przygotowanymi z toluenem i bez niego zostały zbadane testem t Studenta bez pary, p > 0,05 = ns (nieistotne)8. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 6. Chipy membranowe bazalne. (A) Integralność membrany zawiodła, ponieważ zaprawa PDMS/toluenowa nie została wystarczająco szybko odkurzona; To uszkodziło białka matrycy i zakłóciło uszczelnianie chipów. (B) Uszczelnianie membranowe i odłamkowe zakończyło się sukcesem, ale membrana została uszczelniona w luźnym stanie. (C) Udane uszczelnienie membranowe i chipowe, układ jest funkcjonalny do przepływu i rozciągania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 7. Dwa zdjęcia układu ECM w trakcie rozciągania. (A) Ołądek w spoczynku. (B) Odprysk poniżej 1,2 mm poziomego rozciągnięcia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 8. Alcjan Blue (jądra w magentie, śluz w niebieskim) barwienie komórek nabłonkowych Calu-3 w ludzkim płucach wyhodowanych w chipach po ekspozycji na powietrze w urządzeniu. Komórki Calu-3 zostały wyhodowane do zbicia i hodowane przez 10 dni przy ciągłym przepływie 150 μL/h w przedziale podstawowym, wystawione na średnie lub powietrzne działanie od strony wierzchołkowej. Przepływ był wytwarzany za pomocą pompy perystaltycznej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Po zakończeniu uprawy membrany zostały usunięte i pofarbowane. Widok poprzeczny barwienia komórek Calu-3 hodowanych przez 10 dni pod wodą (A) i wystawionych na powietrze (B)8. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 9. Wizualizacja pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych i fibroblastów w rozszerzonej kokulturze w urządzeniu. Fibroblasty dróg oddechowych zostały zasiatne do urządzenia i pozostawione do przyczepienia przez noc, zanim urządzenie zostało odwrócone i zasiewano komórki nabłonkowe po drugiej stronie błony. Komórki były hodowane do konfluentności, wystawione na powietrze i hodowane przez 21 dni przy ciągłym przepływie 150 μL/h, uzyskanym za pomocą pompy perystaltycznej w inkubatorze przy temperaturze 37 °C i 5%CO2. Błony zostały usunięte po hodowli, utrwalane, osadzone i zamontowane na szkiełkach przed zabarwieniem. Komórki nabłonkowe zostały zabarwione na Mucin 5AC (MUC5AC)18, składnik śluzu, oraz białko Forkhead box J1 (FOXJ1)19, czynnik transkrypcyjny zaangażowany w sygnalizację produkcji rzęsek. Fibroblasty były barwione aglutininą zarodków pszenicy (WGA), aby zobrazować dwuwarstwy fosfolipidów komórkowych. Komórki inkubowano z 5 μg/mL w HBSS przez 15 minut i trzykrotnie myto PBS przed wykonaniem obrazowania. Wszystkie jądra komórkowe zostały zwizualizowane za pomocą DAPI. (A) Widok przekroju: uzyskany z rzutu stosu Z obrazów (B) i (C). (B) Barwnik nabłonkowy MUC5AC/FOXJ1/DAPI na membranie chipowej. (C) Kompletna zewnętrzna struktura warstwy fibroblastów w komorze podstawnej8. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 10. Żywotność komórek i kohodowla na rusztowaniu błony podstawnej. (A) żywotność komórek HaCaT zasianych po stronie nabłonkowej, przebadano 3 niezależne próbki, z każdej próbki pobrano 3 losowe pola (n = 3). Wykonano zwykły jednokierunkowy test ANOVA z korektą Tukeya. Wykres pokazuje średnią z odchyleniem standardowym. Kokultura komórek (B) HaCaT po stronie nabłonkowej oraz (C) fibroblastów płuc MRC-5 po stronie stromalnej rusztowań zawierających błonę podstawową otoczoną włóknami kolagenowymi, paski skalowe mają 50 μm. (D) widok 3D kokultury z widoku izometrycznego u góry i dołu, paski skali mają 100 μm, animowaną wizualizację można znaleźć na Rysunku Uzupełniającym 4. (E) Grubość rusztowania błony podstawnej przed i po decelularyzacji, zmierzono 14 błon śluzowych, z których pobrano 6 (reprezentowanych przez trójkąty) do decelularyzacji. Na każdej z próbek skanowano trzy losowe pola, a co najmniej 10 punktów na pole było mierzone w miarę17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek uzupełniający 1. Wzory form chipowych dla górnej i dolnej części standardowego układu PET/PC. (A) Obraz dolnej formy chipu, którą można uzyskać z . STL w Pliku Uzupełniającym 1. (B) Obraz górnej formy chipu, którą można uzyskać z . STL w Pliku Uzupełniającym 2. (C) Obraz szablonu membranowego do cięcia membran dla chipu, który można uzyskać z . STL w Pliku Uzupełniającym 3. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 2. Wzory form wiórowych dla górnej i dolnej połowy rozciągniętego układu membranowego ECM. (A) Obraz dolnej formy chipu, którą można uzyskać z . STL w Pliku Uzupełniającym 4. (B) Obraz górnej formy chipu, którą można uzyskać z . STL w Pliku Uzupełniającym 5. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek dodatkowy 3. Walidacja procedury uszczelniania: porównanie wnikania PDMS do porów bez toluenu w celu obniżenia lepkości zaprawy oraz utwardzania w RT bez próżni. Wszystkie warunki występują przy użyciu membran PET (pory 0,4 μm), po leczeniu PDMS (Nile Red 1%) membrany były osadzane w parafinie przed montażem i wykonaniem obrazowania mikroskopem świetlnym. (A) Nierozcieńczone PDMS odkurzane na membranę PET. Na powierzchni błony widoczna jest gruba warstwa PDMS, podczas gdy PDMS nie przedostał się do porów (oznaczonych białymi ramkami). (B) Rozcieńczona zaprawa PDMS odkurzana na membranę PET. Na powierzchni błony widoczna jest warstwa PDMS, podczas gdy PDMS nie przedostał się do porów (podświetlone białymi ramkami). (C) Rozcieńczona zaprawa PDMS odkurzona na membranę PET. Na powierzchni błony widoczna jest cienka warstwa PDMS, a także wnikanie w pory wzdłuż błony (podświetlone białymi ramkami). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Ilustracja uzupełniająca 4. 3D współkultury komórek HaCat (nabłonkowa) i MRC-5 (stromalna) na rusztowaniu ECM u wieprz. Animowany widok 3D kokultury z góry i dołu izometryczny, którego obrazy można zobaczyć na Rysunku 10D, paski skali mają 100 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1. 3D . Plik STL dolnej formy. Forma może być użyta do produkcji dolnej części standardowego chipu za pomocą druku 3D lub równoważnej metody produkcji. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2. 3D . Plik STL z górnej formy. Forma może być użyta do produkcji górnej połowy standardowego chipu za pomocą druku 3D lub równoważnej metody wytwarzania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 3. 3D. STL szablonu membranowego. Szablon może być używany do produkcji membran o odpowiednim rozmiarze do dostarczonego układu i może być wytwarzany za pomocą druku 3D lub równoważnej metody wytwarzania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 4. 3D . Plik STL dolnej formy odciska rozciągającego. Forma może być użyta do produkcji dolnej części odcinka rozciągniętego za pomocą druku 3D lub równoważnej metody wytwarzania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 5. 3D. Plik STL z górnej formy układu stretch. Forma może być użyta do produkcji górnej połowy odłamka rozciągniętego za pomocą druku 3D lub równoważnej metody wytwarzania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Protokół uszczelniania chipów, który tutaj przedstawiamy, stanowi nowy sposób wytwarzania wodoodpornych uszczelnień membranowych PDMS, które są skuteczne do długotrwałej hodowli pod przepływem, mogą być produkowane przy użyciu ograniczonego sprzętu i nie wymagają specjalistycznych umiejętności. Pokazujemy procedurę produkcji płytek chipowych z membranami (PET, PC, ECM) przywiązanymi do powierzchni za pomocą zaprawy silikonowej oraz pokazujemy, że szybkie zastosowanie próżni ułatwia penetrację PDMS do porów i powierzchni plastikowych membran. Pokazujemy również, że powstałe odłamki są dobrze szczelne i zdolne do szerokiego zakresu zastosowań hodowlanych.
Istnieje kilka różnych sposobów podejścia do wiązania PDMS z plastikiem, co jest powszechną strategią wiązania ze względu na korzystne właściwości hodowli komórkowych PDMS, takie jak przepuszczalność gazów lub wzorcowość, oraz błony plastikowe dla żywotności hodowli komórkowej7. Należą do nich aktywacja powierzchniowa za pomocą plazmyO2 , korony lub ozonu, co ułatwia tworzenie wiązań kowalencyjnech między silikonem a szkłem20. W przeciwnym razie stosuje się techniki chemicznego klejenia z wykorzystaniem organosilanów, takich jak APTES ((3-aminopropyl)trietoksisilan) lub MPTMS ((3-merkaptopropyl)trimometoksysilan), aby funkcjonalnizować powierzchnię obu materiałów poprzez dodanie grupreaktywnych 21. Alternatywnie, podłoża z PDMS i plastiku można klejić metodą klejącą z użyciem epoksydu lub innych klejów22. Przedstawiamy hybrydę między aktywacją powierzchniową a chemicznym klejeniem, z wykorzystaniem porowatych membran i próżni, aby uzyskać fizyczne połączenie przez membranę, które może być połączone wyłącznie poprzez aktywację powierzchni plazmyO2 . Poprzez przerzedzenie PDMS toluenem pozwala na inwazję PDMS przez pory membrany pod próżnią, co pozwala na kowalenencyjne wiązanie różnych membran poprzez wiązania PDMS-PDMS na połówkach układu scalonego i błonie osadzonej w moździe. Tworząc fizyczną sieć silikonową przez te pory, unikamy potrzeby obróbki chemicznej powierzchni lub ciepła i ciśnienia zapewnianego przez gorącą maszynę tłoczącą, która często wspomaga te techniki23.
W obecnym badaniu dostępny jest duży, dwukomorowy układ scalony (Plik Uzupełniający 1), który może pełnić różne funkcje. Po drugie, układ zdolny do cyklicznego rozciągnięcia poziomego (Plik Uzupełniający 2). Urządzenia te działają jako kanały powietrzne na chipie, a model może być również używany jako gut-on-chip, jak pokazanowcześniej 13. Przede wszystkim dostępny jest przewodnik krok po kroku z różnymi opcjami produkcji form, przygotowania membran i konstrukcji wiórów, które można zastosować do kolejnych, nowatorskich platform chipowych zgodnie z oczekiwanymi zastosowaniami badaczy. Zaleca się użycie piekarnika plazmowegoO2 do ostatecznego uszczelnienia. Niemniej jednak, ręczne urządzenie plazmowe lub ręczna kompresja moździerzem PDMS również okazały się skuteczne w tym etapie24. W tym protokole dotyczącym procedury uszczelniania podkreślono kluczowe przeszkody i specyfikacje na każdym punkcie. Należą do nich możliwość wstępnego pokrycia membran, znaczenie natychmiastowego użycia zaprawy PDMS/toluenowej, zaprawa, aby zaprawa nie trafiła do obszaru hodowli oraz jak istotne jest, aby membrana nie ruszała się po połączeniu z zaprawą.
Odtwarzanie tej procedury pieczęciowej było wielokrotnie wykonywane przez badaczy na podstawie pisemnego protokołu; Do pomyślnego zapieczętowania przy drugiej próbie konieczne były tylko następujące wyjaśnienia. W przypadku wystąpienia wycieków podczas testów obciążeniowych lub przedłużonej hodowli komórkowej można rozważyć kilka opcji. Po pierwsze, badacz powinien upewnić się, że zaprawa jest świeżo wykonana z cieczy PDMS, która nie zaczęła się utwardzać i jest dokładnie wymieszana z toluenem. Niska lepkość zaprawy pozwala na powstanie cienkiej, gładkiej warstwy, która może przenikać do porów membrany podczas odkurzania powietrza. Po drugie, należy nałożyć tyle zaprawy, aby pokryć cały dół, a górę membrany – zbyt duża ilość powoduje jej przeciek do miejsca hodowli podczas kompresji, natomiast zbyt mała ilość pozostawi szczeliny umożliwiające przeciek między komorami. Po trzecie, membrany muszą być płaskie przed i w trakcie mocowania. Wreszcie, mimo ręcznego wysiłku, odpryski muszą pozostać w dużej mierze wolne od brudu, aby zapewnić całkowite połączenie końcowe, dlatego szybka i czysta praca jest niezbędna.
Chociaż w tym artykule pokazano przyczepność trzech różnych typów błon porowatych, nie można przewidzieć funkcji tej metody dla innych błon. Wynika to z faktu, że różne odporności chemiczne na toluen, a także inne gęstości i rozmiary porów, wpływają na efekt tego procesu uszczelniania. Pokazamy jednak pierwsze w pełni rozciągliwe wiązanie błonowe oparte na ECM, co sugeruje dużą wszechstronność protokołu. Jednak spójność wydajności rozciągania nie została wiarygodnie sprawdzona, ponieważ różne obszary błony podstawnej, narządy i źródła powodują różnice mechaniczne. Dodatkowo, żywotność komórek w błonach ECM również jest podatna na zmiany w czasie, zarówno w hodowli, jak i w magazynowaniu19. Chociaż ta procedura działa dla różnych membran i układów chipów, wymaga ręcznego malowania zaprawy, aby była skuteczna, co zajmuje stosunkowo mało czasu, ale jest skuteczniejsze w przypadku modeli na większą skalę, takich jak te, które dostarczamy. Wreszcie, podczas gdy proces wiązania membrany wymaga jedynie PDMS, toluenu, membrany i komory próżniowej, ostateczne uszczelnienie chipu zależy od zastosowania plazmyO2 , która nie jest powszechnie dostępna.
Pomimo ograniczeń, dostarczony protokół jest nowatorski i nie wymaga specjalistycznych umiejętności, by do niego podejść. Z naszej wiedzy, produkcja sieci silikonowych przez pory membrany poprzez odkurzanie zaprawy PDMS o niskiej lepkości jest pierwszym tego typu. W przeciwieństwie do innych chemicznych lub mechanicznych mostów funkcjonalnych między różnymi materiałami leżącymi u podstaw układu funkcjonalnego, to rozwiązanie jest możliwe w większości środowisk laboratoryjnych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez konsorcjum Precision Medicine for More Oxygen (P4O2) oraz fundusze ze strony Stichting Proefdiervrij. Najgłębsze podziękowania dla Isadory Kraguljac za pomysł użycia barwnika Nile Red, który mieszałby się z PDMS do wizualizacji silikonowych sieci, oraz dla Marjan Reinders-Luinge za jej utalentowane cięcie i montaż błon. Autorzy wyrażają najgłębsze podziękowania działowi analizy farmaceutycznej oraz Sabeth Verpoorte za udostępnienie ich piekarnika plazmowego z tlenem, bez którego proces nie byłby możliwy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2mL strzykawka o szerokim nosze | BD Emereld | 307727 | |
| Dziurcz biopsyjne 2 mm | KAI medical | BP-20F | |
| Linia komórkowa Calu-3 | ATCC | HTB-55 | RRID: CVCL_0609 |
| HBSS (Zrównoważony Roztwór Soli Hanksa) | Gibco | 14170112 | |
| O2 Piekarnik plazmowy | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Membrany hodowli komórek z trawionym śladem PC | ipCELLCULTURE | 1000M25/620N403/47 | |
| Membrany hodowli komórek trawionych przez tor PET | ipCELLCULTURE | 2000M23/610N403/47 | |
| Polidimetylosiloksan/Sylgard 184 Eslastomer krzemowy i środek utwardzający | Dow Corning | DOWC25100445 | |
| Polimetakrylan metylometylowy (8mm) | Colltec | Nie ma | |
| Standardowa żywica fotopolimerowa (szara)(1kg) | Elegoo | Nie ma | |
| Toluen | Merck | 1,08,325 | |
| Komora próżniowa | FisherScientific | 12080253 |
Bibliografia
- Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
- Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
- Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
- Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
- Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
- Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
- Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
- Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
- Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
- Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
- Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
- Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
- Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
- van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
- Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
- Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
- Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
- Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
- Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
- Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
- Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
- Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
- Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).
Przedruki i uprawnienia
