Artykuł metodologiczny

Izolacja kardiomiocytów komorowych z mysiego modelu kardiotoksyczności doksorubicyny

DOI:

10.3791/70411

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  , 
1Advanced Institute for Medical Sciences, Dalian Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 3East China Normal University Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje powtarzalną, wolną od Langendorffa metodę izolowania żywotnych dorosłych kardiomiocytów komorowych myszy z modelu kardiotoksyczności indukowanej doksorubicyną. Stosuje bezpośrednią perfuzję antegradową lewej komory, po której następuje kontrolowane trawienie enzymatyczne, aby uzyskać odporne na wapń miocyty odpowiednie do analiz strukturalnych, molekularnych i funkcjonalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doksarubicyna (DOX) to skuteczny lek chemioterapeutyczny, którego zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez postępującą, zależną od dawki kardiotoksyczność, która głównie dotyka mięśnia sercowego komory. Badanie mechanizmów uszkodzeń komórkowych w tym kontekście wymaga niezawodnej izolacji dorosłych kardiomiocytów, co jest technicznie wymagające w chorych lub strukturalnie kruchych sercach. Tutaj opisujemy uproszczony i powtarzalny protokół bez Langendorffa do izolowania funkcjonalnych kardiomiocytów komorowych u myszy z kardiotoksycznością indukowaną przez DOX. Po ustaleniu modelu DOX u myszy C57BL/6 serce jest szybko usuwane, a aorta zaciskana ex vivo. Nierecyrkulująca perfuzja antegradowa przeprowadza się bezpośrednio przez lewą komorę przy użyciu buforów bezwapniowych i zawierających enzymy. Delikatna mechaniczna dysocjacja strawionej tkanki komorowej prowadzi do powstania pojedynczych kardiomiocytów, po czym następuje kontrolowane ponowne wprowadzenie wapnia w celu przywrócenia tolerancji na wapń. Metoda ta zapewnia wysokiej jakości, żywotne, pręcikowate kardiomiocyty kompatybilne z dalszymi testami, w tym z badaniami immunofluorescencji, organizacją sarkomerów, wykrywaniem apoptozy oraz badaniami sygnalizacji molekularnej. Eliminując potrzebę specjalistycznego sprzętu do perfuzji Langendorffa, protokół ten oferuje dostępne i wysokowydajne rozwiązanie dla laboratoriów badających mechanizmy urazów serca wywołanych DOX.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doksorubicyna (DOX) jest silnym chemioterapeutykiem antracyklinowym, jednak jej zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez kumulatywną kardiotoksyczność, która może przechodzić w kardiomiopatię rozszerzającą i niewydolność serca 1,2. Apoptoza kardiomiocytów jest kluczowym procesem patogennym w tej toksyczności 3,4,5, a badanie tych zdarzeń komórkowych wymaga niezawodnego dostępu do funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów pochodzących z serc uszkodzonych DOX. Jednak ekspozycja na DOX sprawia, że kardiomiocyty są strukturalnie kruche i metabolicznie osłabione,co znacznie zwiększa ich podatność na stres enzymatyczny i mechaniczny podczas izolacji oraz prowadzi do niskiej żywotności. W szerszej literaturze perfuzja Langendorffa pozostaje dominującą metodą izolacji kardiomiocytów u dorosłych7. Jednak ma istotne ograniczenia stosowane do uszkodzonego mięśnia sercowego. Metoda wymaga specjalistycznego sprzętu, precyzyjnej kaniulacji aortalnej oraz znacznej biegłości technicznej; w sercach leczonych DOX dodatkowe obciążenie mechaniczne wprowadzone podczas perfuzji Langendorffa może dodatkowo pogłębiać uszkodzenia komórek, prowadząc do nieregularnych i często nieoptymalnych rezultatów8.

Aby pokonać te wyzwania, opracowaliśmy uprośony i dostępny protokół izolowania wapniowo-tolerujących dorosłych kardiomiocytów komorowych na podstawie mysiego modelu o ostrej kardiotoksyczności indukowanej DOX9. Eliminując potrzebę konwencjonalnej perfuzji Langendorffa i zamiast tego stosując kontrolowaną perfuzję antegradową ex vivo bezpośrednio przez lewą komorę, metoda ta minimalizuje ekspozycję na choroby niedokrwienne i ogranicza mechaniczną manipulację mięśniem sercowym. Oczekuje się, że te cechy poprawią spójność procedur i zwiększą przeżywalność wrażliwych kardiomiocytów pochodzących z uszkodzonych serc 7,10.

Obecne podejście opiera się na nowych postępach w izolacji kardiomiocytów bez Langendorffa, rozszerzając te koncepcje na dorosłe komórki komorowe, które wymagają zachowania dojrzałej architektury kurczliwej i właściwości wapniowych, cech, które nie są odpowiednio poparte uproszczonymi metodami trawienia opracowanymi głównie dla serc noworodków11,12. Protokół ten stanowi zatem praktyczną i powtarzalną alternatywę dla laboratoriów nieposiadających specjalistycznych systemów perfuzji. Izolowane kardiomiocyty zachowują integralność strukturalną i są dobrze przystosowane do różnorodnych zastosowań w dalszej fazie, w tym analizy sarkomerów, obrazowania immunofluorescencji oraz badań sygnalizacji apoptozy, umożliwiając bezpośrednie mechanistyczne badania urazów serca wywołanych DOX w kontekście fizjologicznie istotnym. Łącznie protokół ten odpowiada na krytyczną, niezaspokojoną potrzebę izolacji żywotnych kardiomiocytów z serc uszkodzonych DOX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zostały poddane przeglądowi i zatwierdzaniu przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Xi'an Jiaotong (Nr Zatwierdzenia XJTUAE2022-1441). Materiały zużywalne, odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ustanowienie modelu ostrej kardiotoksyczności indukowanej DOX u myszy C57BL/6

  1. Przygotowanie zwierząt: Używaj 8-12-tygodniowych samców myszy C57BL/6 (24-28 g). Zwierzęta domowe w standardowych warunkach z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz improwizowanym dostępem do jedzenia i wody. Losowo przypisać myszy do grup kontrolnych leczonych DOX lub soli fizjologicznej (n = 3 na grupę).
  2. Administracja DOX
    1. Przygotuj świeży roztwór DOX w stężeniu 1,5 mg/ml w bezpłodnej soli fizjologicznej. Chroń roztwór przed światłem, owijając pojemnik folią aluminiową.
    2. Zważ każdą mysz i oblicz objętość zastrzyku dla pojedynczej dawki dootrzewnej (i.p.) 15 mg/kg13,14.
    3. Delikatnie unieruchom mysz i podaj roztwór DOX za pomocą zastrzyku otrzewnego. Wróć mysz do klatki i kontynuuj według harmonogramu eksperymentalnego.
      UWAGA: DOX jest czynnikiem cytotoksycznym. Noszę odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, ochronę oczu) i obchodz się z odczynnikiem w wyznaczonym miejscu bezpieczeństwa chemicznego.
  3. Harmonogram i monitorowanie: Codziennie monitoruj myszy pod kątem ogólnego stanu zdrowia i zachowania. Rejestruj masę ciała co drugi dzień. Przeprowadz izolację kardiomiocytów 7 dni po podaniu DOX.

2. Przygotowanie roztworów i narzędzi chirurgicznych do izolacji kardiomiocytów

  1. Przygotowanie buforu: Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1 , aby poznać szczegółowe metody przygotowania tych roztworów.
    1. Przygotuj bufor perfuzji i bufor EDTA. Dostosuj pH wszystkich roztworów do 7,4 za pomocą NaOH.
    2. Przygotuj roztwór trawienia enzymów zawierający kolagenazę typu II, kolagenazę typu IV oraz proteazę XIV z buforem perfuzyjnym.
    3. Przygotuj bufor zatrzymujący, uzupełniając bufor perfuzji o 5% surowicę bydła płodu (FBS).
    4. Przygotuj kompletne medium hodowlane, dodając 0,1% surowicową albuminę bydłą (BSA), insulinotransferynę-selenę (ITS), 10 mM 2,3-butandionu monoksim (BDM), koncentrat lipidów oraz penicylinę/streptomycynę (P/S) do pożywki M199.
    5. Przygotuj bufory reintrodukcji wapnia, dodając kompletne podłoże hodowlane do buforu perfuzyjnego odpowiednio w końcowych stężeniach wapnia wynoszących odpowiednio 0,34 mM, 0,68 mM i 1,02 mM.
      UWAGA: Przygotować wszystkie roztwory w warunkach sterylnych przy użyciu filtracji 0,22 μm. Przechowuj roztwory w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem, do dwóch tygodni. Do izolacji jednego serca myszy przygotować 50 mL buforu EDTA, 100 mL buforu perfuzyjnego (60 mL do roztworu kolagenazy, 10 mL do buforu zatrzymnego, resztę do perfuzji i sedymentacji grawitacyjnej), 60 mL buforu kolagenazy oraz 10 mL buforu zatrzymywającego.
  2. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych: Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie przed zabiegiem. Ułóż następujące narzędzia kolejno w obszarze chirurgicznym: nożyczki cienkie, nożyczki zakrzywione, kleszcze, zakrzywione kleszcze hemostatyczne (rysunek 1A) oraz pompkę strzykawkową (rysunek 1B).

3. Izolacja kardiomiocytów z serc leczonych DOX

UWAGA: Schematyczny przegląd procedury izolacji kardiomiocytów przedstawiono na Rysunku 2. Po potwierdzeniu, że wszystkie instrumenty chirurgiczne, sprzęt i rozwiązania są gotowe, rozpocznij izolację.

  1. Zaciskanie aorty i wycięcie serca
    1. Znieczulaj mysz 3% izofluranem i potwierdź znieczulenie, sprawdzając brak reakcji na uszczypnięcie palca15.
    2. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na desce do sekcji.
    3. Wykonaj nacięcie środkowe przez skórę i ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić serce, i przeciąć aortę zstępującą.
    4. Przekręć 7 ml buforu EDTA w kontrolowanym, stałym tempie do podstawy prawej komory przez około 1 minutę, aby szybko usunąć krew z komór, minimalizując narażenie na choroby niedokrwienne i zachowując integralność strukturalną serca, szczególnie w sercach uszkodzonych przez DOX (Rysunek 2A).
    5. Szybko zacisnąć aortę wstępującą (rysunek 2B), wyciąć serce i natychmiast przenieść je do naczynia o średnicy 100 mm zawierającego lodowato zimny bufor EDTA.
      UWAGA: Całkowity czas od torakotomii do przeniesienia serca powinien być idealnie ograniczony do 2 minut, aby zminimalizować niedokrwienie.
  2. Układ perfuzji
    1. Ostrożnie usuń otaczającą tkankę.
    2. Umieść serce w misce do sekcji zawierającej lodowato zimny bufor perfuzji.
    3. Przepłucz 10 ml EDTA stopniowo bufor przez wierzchołek lewej komory za pomocą igły wewnętrznej przez 6 minut, aby destabilizować połączenia zewnątrzkomórkowe.
    4. Przenieś serce do innej miseczki o średnicy 100 mm i usunąć pozostałości EDTA z komór serca, perfuzując 3 mL buforu perfuzyjnego przez ten sam cewnik przez 2 minuty.
      UWAGA: Obserwuj obrzęk serca podczas perfuzji i zabezpiecz aortę zakrzywionymi kleszczemi hemostatycznymi, aby ustanowić zamknięty system perfuzji. Ostrożnie kontroluj tempo perfuzji i ciśnienie, aby uniknąć nadmiernej siły hydrostatycznej i zminimalizować ryzyko pęknięcia lewego przedsionka.
  3. Trawienie enzymatyczne
    1. Przełóż wycięte serce do naczynia o średnicy 100 mm zawierającego 5 ml roztworu enzymatycznego trawienia.
    2. Podłącz igłę zatrzymującą do strzykawki 20 mL wypełnionej roztworem enzymu do trawienia i mocno przymocuj igłę do powierzchni roboczej szafki biosafety za pomocą taśmy wskaźnikowej sterylizacji.
    3. Włóż strzykawkę do pompy mikroiniekcyjnej i rozpocznij perfuzję w kontrolowanej dawce 3 min/mL (Rysunek 2C).
    4. Przeprowadź serce przez lewą komorę roztworem enzymatycznym przez 60-90 minut, aż do osiągnięcia pełnego trawienia, co wskazuje całkowita utrata elastyczności tkanek i jasne zabarwienie powierzchni komory (rysunek 2D). Jeśli po początkowej perfuzji zaobserwowane jest niepełne trawienie, należy podać dodatkowe 15-20 ml roztworu enzymatycznego dla dalszego trawienia.
      UWAGA: Zapobiegaj wysuwaniu igły podczas wymiany strzykawki; jeśli zostanie wysunięta, należy ponownie włożyć ją do pierwotnego miejsca lewej komory, aby zachować ścieżkę perfuzyjną.
  4. Dysocjacja tkanek
    1. Przelej strawione serce do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego 5 ml bufora zatrzymywającego.
    2. Rozerwij tkankę komorową na małe kawałki za pomocą cienkich kleszczy (rysunek 2E).
    3. Delikatnie trituturuj zawiesiny tkanki komorowej pipetą o pojemności 5 mL, aby rozdzielić poszczególne kardiomiocyty (Rysunek 2F).
    4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 μm, aby usunąć duże fragmenty tkanki.
    5. Przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml bufora zatrzymującego filtr, aby zmaksymalizować wydajność ogniwa.
      UWAGA: Wszystkie etapy tryturacji wykonuj delikatnie i ogranicz pipetowanie do maksymalnie 50 powtórzeń, aby uniknąć mechanicznych uszkodzeń kardiomiocytów.
  5. Ponowne wprowadzenie wapnia
    UWAGA: Pozwól kardiomiocytom przejść 3-4 kolejne 15-minutowe okresy sedymentacji grawitacyjnej w rurkach wirówek o pojemności 15 mL (Rysunek 2G). Po każdej sedymentacji ostrożnie usuń 80% supernatantu i ponownie zawiesij pellet w 3 mL buforu reintrodukcyjnego wapnia. Stopniowo zwiększ stężenie wapnia, stosując przygotowane roztwory gradientowe na każdym kroku16.
  6. Liczenie komórek i płytowanie
    1. Ilościowo określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru i oblicz proporcję pręcikowatych i zaokrąglonych kardiomiocytów 1,9 (Rysunek 2H).
    2. Płytka 1-5 × 105 komórek w medium powłokowym do płytek 6-dołkownych, wstępnie powlekłych lamininą (10 μg/mL) przez 1 godzinę w 37 °C i płukanych solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Przygotuj talerze dzień wcześniej i przechowuj w temperaturze 4 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba. Zmień podłoże na świeże, podgrzane podłoże po 1 godzinie i co 48 godzin później.
      UWAGA: Protokół można wstrzymać po kroku 3.6. Komórki można utrzymywać w hodowli krótkoterminowej do 6 godzin w celu natychmiastowych eksperymentów.

4. Ocena integralności strukturalnej kardiomiocytów poprzez immunobarwienie

  1. Utrwalaj komórki 4% paradehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Płucz komórki trzy razy PBS, po 5 minut każda.
  3. Przepuszczać komórki 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i płukać trzy razy PBS, po 5 minut każda.
  4. Blokuj wiązanie niespecyficzne z 1% BSA w PBS przez 1 godzinę.
  5. Inkubować komórki z pierwotnym przeciwciałem przeciwko sarkomerycznej α-aktyninie przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Delikatnie przemyj trzy razy PBS, a następnie inkubuj odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Delikatnie umyj trzy razy PBS, a następnie nałóż kontrbarwę na jądra DAPI przez 5 minut.
  8. Nakładaj pokrywy na szklanych slajdach za pomocą medium antyfade.
  9. Zrób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobaczyć wzory barwienia.

5. Analiza sygnalizacji apoptotycznej w izolowanych kardiomiocytach

  1. Ekstrakcja białek i ilościowa
    1. Liz kardiomiocytów w buforze opartym na RIPA uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy.
    2. Wiruj homogenanty w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zbieraj supernatant do dalszej analizy.
    3. Określ stężenie białka za pomocą kolorymetrycznego testu kwasu bicynchoninowego (cca ocierany).
  2. Analiza zachodniej plamy
    1. Oddziel 30 μg białka na żelach SDS-poliakrylamidowych i przenieś rozdzielone białka na błony PVDF.
    2. Zablokować błony krwi 5% mlekiem beztłuszczowym w TBS zawierającym 1% Tween-20, a następnie inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko Bax, Bcl-2 i rozszczepionym kaspazie-3, kluczowym markerom białkowym powszechnie ocenianym w badaniach DOX – kardiotoksyczności17.
    3. Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z nadoksydazą chrzanu. Wykrywaj sygnały za pomocą odczynnika o zwiększonej chemiluminescencji i wykonuj obrazy za pomocą cyfrowego systemu obrazowania18.
  3. Analiza danych
    1. Przedstawić dane ilościowe jako średnią ± SEM z trzech niezależnych biologicznych replikacji.
    2. Wykonaj analizy statystyczne za pomocą GraphPad Prism, stosując dwukierunkowy ANOVA do porównań między wieloma grupami i punktami czasowymi lub nieparowany dwustronny test t do porównań między dwiema grupami. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena wydajności i żywotności komórek

Myszy otrzymujące DOX wykazały wyraźny spadek masy ciała w porównaniu do grupy leczonej solą fizjologiczną (Rysunek uzupełniający 1A). Skuteczne ustanowienie ostrego modelu kardiotoksyczności indukowanej DOX zostało dodatkowo potwierdzone przez wyraźny wzrost markerów urazów serca w surowicy, w tym cTnT i CK (Ilustracja uzupełniająca 1B,C), a także wyraźne podwyższenie apoptozy kardiomiocytów, co wykazano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna izolacja wysokiej jakości, wapniowo-tolerujących kardiomiocytów dorosłych jest niezbędna do badań patofizjologii serca na poziomie komórkowym. Ten protokół niezawodnie dostarcza funkcjonalne kardiomiocyty zarówno z zdrowych, jak i patologicznych serc myszy, przy czym dwa kroki są szczególnie istotne dla zachowania żywotności komórek. Po pierwsze, starannie optymalizuj i monitoruj czas trwania perfuzji enzymatycznej. Niewystarczające trawienie powoduje słabą dysocjację tkanek i niską wydajność wydajności, podcza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 82230012 i 81830015 dla N. Wanga, grant 82570478 dla L. Xiao).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia o średnicy 100 mm komórekBiofiltracja Jet TCD000100
100 μ Sitnik komórek MCorning431752
Rurki wirówkowe 15 mLBiofiltracja Jet CFT011150
Rurki wirówkowe 50 mLBiofiltracja Jet CFT011500
Naczynia hodowlane komórek o średnicy 60 mmBiofiltracja Jet TCD100060
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA1470 
Kolagenaza IISigma-AldrichC6885
Kolagenaza IVSigma-AldrichC5138
Zakrzywione kleszcze hemostatyczneNauki o życiu z napędem na tylne kołaF22003-10
Nożyczki z zakrzywionym końcemNauki o życiu z napędem na tylne kołaS12001-09
Nożyczki cienkieNauki o życiu z napędem na tylne kołaS12000-09
KleszczeNauki o życiu z napędem na tylne kołaF13014-12
Kanyula mieszkająca (26G)Becton, Dickinson and Company381312
Insulina-transferyna-selen (ITS)MedChemExpressHY-150287
Izofluran    Nauki o życiu z napędem na tylne kołaR510-22-10
Laminin (myszy)Thermo Scientific23017015
Koncentrat lipidów (chemicznie zdefiniowany)MedChemExpressHY-K3019
M199 MediumSigma-AldrichM4530
Penicylina-StreptomycynaMedChemExpress  HY-K1006
Proteaza XIVSigma-AldrichP5147
Taśma wskaźnikowa sterylizacjiMinnesota Mining and Manufacturing (3 mln)CT060934701
Pompa strzykawkowa (ISPLab01)Pompa precyzyjna Baoding ShenchenSC-49464A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  2. Zamorano, J. L., et al. ESC Position paper on cancer treatments and cardiovascular toxicity developed under the auspices of the ESC Committee for practice guidelines: task force for cancer treatments and cardiovascular toxicity of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J. 37 (36), 2768-2801 (2016).
  3. Xu, C., et al. Usp38 promotes oxidative stress and inflammation and aggravates doxorubicin-induced cardiotoxicity by deubiquitinating and stabilizing pten. Int Immunopharmacol. 167, 115750(2025).
  4. Yue, M. Y., et al. Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity: A systematic review. Phytomedicine. 148, 157244(2025).
  5. Kong, C. Y., et al. Underlying the mechanisms of doxorubicin-induced acute cardiotoxicity: Oxidative stress and cell death. Int J Biol Sci. 18 (2), 760-770 (2022).
  6. Domínguez Romero, Y., Ortiz Montoya, G., NovoaHerrán, S., Osorio Mendez, J., Gomez Grosso, L. A. Mirna expression profiles in isolated ventricular cardiomyocytes: Insights into doxorubicin-induced cardiotoxicity. Int J Mol Sci. 25 (10), 5272(2024).
  7. Li, H., et al. Optimized Langendorff perfusion system for cardiomyocyte isolation in adult mouse heart. J Cell Mol Med. 24 (24), 14619-14625 (2020).
  8. Gharanei, M., Hussain, A., Janneh, O., Maddock, H. L. Doxorubicin-induced myocardial injury is exacerbated following ischaemic stress via opening of the mitochondrial permeability transition pore. Toxicol Appl Pharmacol. 268 (2), 149-156 (2013).
  9. O'connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 357, 271-296 (2007).
  10. Liu, Y., Dostal, D. E., Tong, C. W. Isolation of adult mouse cardiomyocytes using Langendorff perfusion apparatus. Methods Mol Biol. 2319, 143-152 (2021).
  11. Bongiovanni, C., et al. Protocol for isolating and culturing neonatal murine cardiomyocytes. STAR Protoc. 5 (4), 103461(2024).
  12. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. Eur J Cell Biol. 94 (10), 444-452 (2015).
  13. Li, L., et al. Preventive effect of erythropoietin on cardiac dysfunction in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Circulation. 113 (4), 535-543 (2006).
  14. Zhang, X., et al. Rosmarinic acid alleviates cardiomyocyte apoptosis via cardiac fibroblast in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Int J Biol Sci. 15 (3), 556-567 (2019).
  15. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  16. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circ Res. 119 (8), 909-920 (2016).
  17. Zhang, X., et al. Fndc5 alleviates oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis in doxorubicin-induced cardiotoxicity via activating Akt. Cell Death Differ. 27 (2), 540-555 (2020).
  18. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  19. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. J Transl Med. 16 (1), 288(2018).
  20. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture, and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (114), e54012(2016).
  21. Łoboda, A., Zieliński, T., Dulak, J. Cell-free strategies for cardiomyocyte proliferation and heart repair. Pharmacol Rep. , 00805-00807 (2025).
  22. Alam, P., et al. Cardiac remodeling and repair: Recent approaches, advancements, and future perspectives. Int J Mol Sci. 22 (23), 13104(2021).
  23. Seibertz, F., et al. A modern automated patch-clamp approach for high-throughput electrophysiology recordings in native cardiomyocytes. Commun Biol. 5 (1), 969(2022).
  24. Gorski, P. A., Kho, C., Oh, J. G. Measuring cardiomyocyte contractility and calcium handling in vitro. Methods Mol Biol. 1816, 93-104 (2018).
  25. Li, A., Gao, M., Jiang, W., Qin, Y., Gong, G. Mitochondrial dynamics in adult cardiomyocytes and heart diseases. Front Cell Dev Biol. 8, 584800(2020).
  26. Woodcock, E. A., Matkovich, S. J. Cardiomyocytes structure, function and associated pathologies. Int J Biochem Cell Biol. 37 (9), 1746-1751 (2005).
  27. Gan, P., et al. Rbpms is an RNA-binding protein that mediates cardiomyocyte binucleation and cardiovascular development. Dev Cell. 57 (8), 959-973.e7 (2022).
  28. Jia, K., et al. RNA helicase ddx5 maintains cardiac function by regulating camkiiδ alternative splicing. Circulation. 150 (14), 1121-1139 (2024).
  29. Zhuang, L., et al. Dyrk1b-stat3 drives cardiac hypertrophy and heart failure by impairing mitochondrial bioenergetics. Circulation. 145 (11), 829-846 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kardiomiocyt wmodel serca myszybufor wolny od wapniadysocjacja mechanicznamechanizmy uszkodze sercadetekcja apoptozyorganizacja sarkomer wtest immunofluorescencyjny

Powiązane artykuły