Artykuł metodologiczny

Wzmocnienie wchłaniania wirusów adeno-związanych z jelitami rekombinowanym przez tradycyjną formułę medycyny chińskiej

128 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70413

⸱

24 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający ustanowienie modelu wertowanego worka jelitowego do oceny interakcji między Tradycyjną Medycyną Chińską (TCM) a rekombinowanym wirusem adeno-adekoliozowym (rAAV) podczas wchłaniania jelitowego, zapewniając platformę ex vivo do optymalizacji strategii dostarczania genów doustnych.

Streszczenie

Doustny rekombinowany wirus adeno-związany z adeno-adekognizacją (rAAV) ma istotny potencjał terapeutyczny, ale jest ograniczony przez nieefektywne wchłanianie jelit. Tradycyjna medycyna chińska (TCM), szeroko stosowana w recepturach doustnych, stanowi obiecujące źródło środków wspomagających wchłanianie. Jednak jego potencjalne wpływy na pobieranie i transdukcję rAAV pozostają w dużej mierze niezbadane. Model everted sack jelitowy zapewnia ilościową platformę ex vivo do badania tych interakcji. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół wykorzystujący model wysuniętego worka jelitowego do ilościowej oceny translokacji wirusa adeno-powiązanego (rAAV) przez nabłonek jelit oraz późniejszej transdukcji genów w tkankach jelitowych w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Kluczowe kroki obejmują pobranie segmentów jelita cienkiego od gryzoni laboratoryjnych, wyrzucenie tych segmentów w celu utworzenia worków oraz napełnienie każdego worka buforem natlenionym. Usunięte worki są zanurzone w natlenowanym buforze zawierającym cząstki rAAV i inkubowane w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspozycję świetlną i transport wektorowy. Analizy końcowe obejmują pobieranie próbek płynu wewnętrznego (serosalnego) w celu pomiaru cząstek rAAV, które przekroczyły nabłonek, a także analizę tkanki pęcherzyka pod kątem ekspresji transgenów w celu określenia efektywności transdukcji. Poprzez badanie wielu obszarów jelit, protokół dostarcza wglądu w specyficzne dla segmentów różnice w pobieraniu rAAV. Ponadto włączenie GZNG, klasycznego wzoru TCM, podczas inkubacji umożliwia ocenę jego wpływu na pobór i transdukcję wektorów. Podejście z wyrzuconym workiem jelitowym stanowi cenną platformę do badania serotypów rAAV, wzmacniaczy dostarczania oraz interakcji między wektorami rAAV a komponentami TCM. Jego prosty i równoległy projekt umożliwia również wysokoprzepustowe badania przesiewowe w badaniach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Rekombinowany wirus adeno-związany (rAAV) stanowi obiecującą platformę dla ogólnoustrojowej terapii genowej, a obecnie badane są trzy główne drogi podawania: dożylne1, dootrzewnowe2 oraz doustne3. Chociaż drogi dożylnych i dootrzewnowych są szeroko badane, podawanie doustne, podejście nieinwazyjne, pozostaje stosunkowo niedostatecznie zbadane. Wykonalność doustnego podawania rAAV została po raz pierwszy udowodniona przez Xin i in.4, którzy odnotowali pomyślne przekształcenie błony śluzowej jelit oraz wywołanie odpowiedzi immunologicznej przeciw HIV po doustnym podaniu rAAV2. Podobnie Hara i in.3,5 wykazali, że doustne rAAV/Aβ może przekształcać błonę śluzową w przewodzie pokarmowym i zmniejszać odkładanie amyloidu w mózgu, podczas gdy Steel i in.6 stwierdzili, że szczepienie doustne wykazało lepsze przeżycie i odporność przeciwnowotworową w porównaniu z iniekcją domięśniową. To samo badanie wykazało, że rAAV6 wykazywał silniejszy tropizm jelitowy niż rAAV5. Poza zastosowaniami szczepionkowymi, potencjał terapeutyczny został osiągnięty także w innych modelach chorób. Ma i in.7 oraz Hao i in.8 udowodnili, że doustny rAAV prowadzi do supresji nowotworów i terapii przeciwfibrotycznej odpowiednio w wątrobie i żołądku po transdukcji przewodu pokarmowego. Huang i in.9 zidentyfikowali inżynieryjny serotyp Rec2 jako selektywnie przenoszący brązową tkankę tłuszczową po podaniu doustnym, w przeciwieństwie do dominującego tropizmu wątrobowego obserwowanego przy podaniu dożylnym10. Pomimo tych pionierskich odkryć, badania nad doustnym podawaniem rAAV pozostają ograniczone, częściowo z powodu braku systemów in vitro screeningowych do szeroko zakrojonej ewaluacji.

Model wysuniętego worka jelitowego, opracowany przez Wilsona i Wisemana w 1954roku, pozostaje cenną platformą in vitro do badania mechanizmów wchłaniania leków jelitowych. W przeciwieństwie do innych symulatorów absorpcji, ten system unikalnie uwzględnia wiele procesów fizjologicznych wykraczających poza prostą pasywną dyfuzję12. Ta cecha czyni go szczególnie korzystnym do studiowania TCM13. Dzięki temu systemowi udokumentowano, że związki TCM często wykazują wzorce wchłaniania zależne od segmentów jelitowych w całym przewodzie pokarmowym. Na przykład jedno badanie wykazało, że wiele alkaloidów z Wuwei Qingzhuo San jest selektywnie wchłanianych w różnych segmentach jelit, przy czym najaktywniejsze wchłanianie14 są w jedźunum i jelicie nieruchowym. Dodatkowo, współpodawanie składników TCM może modulować wchłanianie jelitowe. Liao i in.15 poinformowali, że współpodawanie z ekstraktem Radix Angelicae dahuricae znacząco poprawiło wchłanianie puerarynu jelitowego, podkreślając wpływ interakcji TCM na segmentalne wchłanianie. Dlatego model wychwyconego worka jelitowego stanowi idealne narzędzie do wyjaśnienia złożonych zachowań absorpcyjnych i synergicznych interakcji charakterystycznych dla formuł TCM i innych leków.

Wybór odpowiedniego modelu do badań nad absorpcją rAAV wymaga dogłębnego zrozumienia kompromisów między dokładnością fizjologiczną, złożonością techniczną i przepustowością. Poniższa tabela podsumowuje podstawowe modele eksperymentalne używane do badania wchłaniania jelitowego.

Badanie to stanowi dowód na to, że model wertowanego worka jelitowego może być wykorzystany do badania wchłaniania jelitowego wektorów rekombinowanych adeno-związanych z wirusem (rAAV). Dostarcza cennych informacji na temat tego, jak współpodawanie TCM wpływa na wchłanianie wektorów rAAV jelitowych, podkreślając potrzebę dalszej charakterystyki ich mechanistycznych interakcji w warunkach fizjologicznie istotnych. Optymalizacja strategii leczenia doustnego wspieranego przez TCM w tym podejściu może ułatwić rozwój nieinwazyjnych terapii rAAV, poprawiając tym samym zgodność pacjentów i dostępność leczenia.

Naukowcy powinni ocenić model odwróconego worka jelitowego na podstawie następujących kryteriów, aby upewnić się, że jest on zgodny z ich celami eksperymentalnymi. Odpowiednie zastosowania obejmują szybkie badania serotypów, ocenę adiuwantów/wzmacniaczy oraz kinetykę regionalną, natomiast nieodpowiednie zastosowania i ograniczenia obejmują badania długoterminowej ekspresji (>48 h) oraz farmakologię układową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane ściśle zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Naval Medical University Animal Ethics Committee (zatwierdzone CHEC (A.E)-2025011).

1. Przygotowanie rozwiązania Tyrode i wirusowych rozwiązań

  1. Wstępne kondycjonowanie rozwiązania Tyrode'a:
    1. Przygotuj dwie alikwoty po 500 ml roztworu Tyrode (pH 7,4) (patrz Tabela materiałów).
    2. Jedną aliquot schłodzić do 4 °C, a drugą do 37 °C.
    3. Każdą aliquot wybańcz 95% O₂/5% CO₂.
  2. Przygotowanie roztworu wirusowego:
    1. Dodaj rekombinowany AAV9-CMV-EGFP do roztworu Tyrode 37 °C, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 1011 vg/mL (stan kontrolny).
    2. W warunkach eksperymentalnych uzupełnij przygotowanie AAV9-CMV-EGFP formułą TCM GZNG (Tabela 2) rozpuszczoną w pokładzie do końcowego stężenia 200 mg/mL.
    3. Dla kontroli wyłącznie GZNG, dodaj GZNG (200 mg/mL) do roztworu Tyrode bez AAV9 CMV-EGFP.
      UWAGA: Przygotowuj rozcieńczenia wirusowe tuż przed użyciem, aby zachować zakaźność. pH roztworu GZNG wynosi około 5,0–6,0.

2. Przygotowanie zwierząt i pobieranie tkanek jelit

  1. Na czczo: Pościć 8-tygodniowego szczura Sprague–Dawley przez 24 godziny przed operacją. Zapewnij sobie swobodny dostęp do wody w tym okresie, aby utrzymać nawodnienie.
    UWAGA: Post pomaga zminimalizować zawartość jelitową i zapewnia dokładny pomiar wchłaniania jelitowego podczas eksperymentów ex vivo .
  2. Sprawdź stan zdrowia zwierząt przed rozpoczęciem postu i upewnij się, że są w dobrym stanie. Wyklucz z badania zwierzęta wykazujące oznaki stresu lub choroby.
  3. Podaj pentobarbital sodu (200 mg/kg, dootrzewnowkowo), aby wywołać głęboką anestezję. Sprawdź, czy zwierzę jest całkowicie znieczulone, sprawdzając brak refleksów i równy oddech.
    UWAGA: Pentobarbital to niebezpieczna substancja kontrolowana; Obchodzić się z nimi rękawiczkami i OOP w okapie wyparowym, aby uniknąć kontaktu ze skórą/wdychania, oraz stosować się do wytycznych instytucji dotyczących bezpiecznej utylizacji i reagowania w nagłych wypadkach.
  4. Przeprowadz eutanazję przez zwichnięcie szyjki po potwierdzeniu głębokiego znieczulenia.
  5. Wymazuj obszary brzucha i klatki piersiowej 75% etanolem, aby zdezynfekować skórę i zmniejszyć zanieczyszczenie drobnoustrojami podczas operacji.
  6. Wykonaj nacięcie środkowe wzdłuż okolicy brzucha, używając sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić jamę otrzewną.
  7. Delikatnie oddziel i odsłoń żołądek oraz jelita. Podczas zabiegu używaj sterylnej zasłony, aby chronić otaczające tkanki i narządy.
  8. Ostrożnie przeciąć zwieracz odźwiernika, aby oddzielić żołądek od bliższego dwunastnicy. Upewnij się, że dwunastnica pozostanie nienaruszona na potrzeby kolejnych zabiegów.
  9. Rozciąć dystalne jelito grube na styku odbytu odbytu i odbytu, unikając uszkodzeń otaczających tkanek.
  10. Delikatnie uwolnij przyczepy krezkowe z jelita cienkiego za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek. Uważaj, aby nie rozciągnąć lub nie narwać krezki.
  11. Natychmiast przenieś nienaruszone jelito cienkie do lodowatego roztworu natlenowanego buforu Krebsa-Ringera (roztwór Tyrode'a, 4 °C).

3. Przygotowanie wtorowanego pęcherza jelitowego ex vivo

  1. Wybierz segmenty jelit w następujący sposób: segment o długości 8 cm położony 10 cm dalej od odźwiernika został oznaczony jako segment dwunastnicy.
  2. Pobierz 8 cm segment cztuchni, zaczynając 16 cm dalej od segmentu dwunastnicy.
  3. Uzyskaj 8 cm segment jelita brzęgowego, zaczynając dalej 16 cm dalej od segmentu czczego.
  4. Dla jelita grubego pobierz segment o długości 8 cm znajdujący się 5 cm blisko ślepego końca cecalu.
    UWAGA: Upewnij się, że tkanka jest elastyczna i nienaruszona, odpowiednia do odwrócenia podczas przygotowań.
  5. Przepłucz światło jelit strzykawką o pojemności 2 mL wypełnioną lodowatym, natlenionym roztworem Tyrode'a.
  6. Utylizacja ścieków zgodnie z procedurami instytucjonalnych dotyczących odpadów biologicznych, aby zachować sterylność i zapobiec skażeniu.
    UWAGA: Obchodz się z odpadami biologicznymi w rękawiczkach i odpowiednim sprzęcie ochronnym, aby uniknąć narażenia na potencjalnie zakaźne materiały. Utylizacja wszystkich odpadów biologicznych i ścieków zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego w celu zapobiegania zanieczyszczeniu środowiska.
  7. Umieść bliższy koniec segmentu jelit na 4 mm polerowany szklany pręt. Upewnij się, że powierzchnia pręcika jest gładka, aby zapobiec pęknięciu błony śluzowej.
  8. Zwiąż dalszy koniec segmentu jedwabnym szwem 2-0, aby zabezpieczyć tkankę na prętze. Potwierdź, że tkanka pozostaje stabilna podczas inwersji.
  9. Delikatnie przesuwaj tkankę wzdłuż pręcika, aż błona śluzowa będzie całkowicie odsłonięta. Unikaj nadmiernego rozciągania lub skręcania, aby zachować integralność tkanek.
  10. Włóż 2 ml lodowatego roztworu Tyrode do lumenu, aby sprawdzić wycieki. Dopuszczalny przeciek powinien wynosić <5% w ciągu 1 minuty. Jeśli wykryje się przeciek, należy dostosować szwy i potwierdzić całkowitą inwersję powierzchni błony śluzowej.
    UWAGA: Przeprowadzić ewersję w zimnym środowisku, aby zminimalizować degradację enzymatyczną i zachować żywotność tkanek.
  11. Do otwartego końca wysuniętego segmentu włóż 5 cm szklaną kapilarę o średnicy 3 mm, aby służyć jako wlot do przelewu. Delikatnie przesuwaj kaniulę, aby uniknąć pęknięć błony śluzowej.
  12. Zabezpiecz kaniulę szwami jedwabnymi 2-0. Upewnij się, że kanyła pozostaje nieruchoma na miejscu, nie zapadając się ani nie blokując przepływu płynów.
  13. Delikatnie napręż szwy, aby utrzymać prawidłowy kształt pęcherza jelitowego. Zapobiegaj zginaniu lub skręceniu, ponieważ mogą one zakłócać przekręcanie i wpłynąć na efekty wchłaniania.
  14. Unikaj nadmiernego zaciskania, ponieważ może to uszkodzić tkankę lub zdeformować pęcherzyk. Utrzymuj równomierne napięcie przez cały eksperyment. Regularnie sprawdzaj wysunięty worek jelitowy pod kątem przecieków lub uszkodzeń konstrukcyjnych. Jeśli przecieki przekraczają 5%, napraw lub wymień segment przed kontynuacją.

4. Transdukcja i inkubacja AAV

  1. Umieść każdy wywrócony worek do stożkowej rurki o pojemności 7 mL zawierającej 4 mL tlenowego roztworu Tyrode'a o stężeniu 37 °C.
  2. Dodaj roztwór wirusowy w następujący sposób: Kontrola: AAV9-CMV-EGFP samodzielnie; Eksperymentalne: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. Inkubuj statycznie w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, podczas których mieszanina gazowa zawierająca 95% O2/5%CO2 była nieustannie wpuszczana do roztworu.

5. Próbkowanie, przetwarzanie i analiza punktów końcowych

  1. Próbkowanie czasowo-biegowe
    1. Pobieraj 50 μL płynu surowiczego z każdego worka jelitowego w ciągu 0, 30, 60, 90 i 120 minut za pomocą skalibrowanej mikrostrzykawki. Zapewnij dokładne pobieranie próbek bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    2. Natychmiast zastąpić pobraną ciecz 50 μL roztworu Tyrode o temperaturze wstępnie podgrzanej (37 °C), aby utrzymać równowagę osmotyczną i objętość wewnętrzną. Minimalizuj czas między wycofaniem a wymianą, aby zachować spójne warunki eksperymentalne.
      UWAGA: Podczas używania mikrostrzykawki (np. strzykawki Hamilton) zachowaj sterylność i delikatnie obchodzisz się z nią, aby zapobiec uszkodzeniu błony woreczka jelitowego.
    3. Pobieranie próbek wykonuj punktowo w każdym momencie, aby zminimalizować zakłócenia środowiska inkubacji.
  2. Określanie miana wirusa
    1. Ekstrakt całkowitego DNA z płynu serozalnego należy wyodrębnić za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu do ekstrakcji DNA genomowej zwierzęcej, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wykonaj bezwzględną ilościową ilościowość kopii genomu wektora rAAV za pomocą qPCR. Użyj zestawu SYBR Green z podkładami ITR. Wykonaj wzmocnienie qPCR na standardowej płycie z 96 dołkami za pomocą cyklera termicznego przy następujących warunkach cyklicznych: denaturacja początkowa: 95°C przez 10 minut; Denaturacja: 95°C przez 15 s; Wyżarzanie i rozciąganie: 60°C przez 1 minutę; Łącznie 40 cykli
    3. Aby określić liczbę kopii genomu, wygeneruj standardową krzywą za pomocą szeregowych rozcieńczeń plazmidów rAAV-CMVp-gfp (1 ng, 0,1 ng i 0,01 ng). Użyj tych rozcieńczeń do obliczenia liczby kopii genomu wirusa na podstawie odpowiadających im wartości progu cyklu (Ct).
    4. Określ liczbę kopii genomu wektora w zebranym płynie surowiczym, używając krzywej standardowej. Wyniki przedstawiono jako kopie genomu na 100 ng wyodrębnionego DNA.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt są sterylne, aby zapobiec skażeniu podczas ekstrakcji DNA i analizy qPCR. Stosuj odpowiednie kontrole, aby zweryfikować dokładność qPCR, w tym standardy bez szablonu (NTC) oraz plazmidów.
    5. Wykonaj qPCR w trzech egzemplarzach dla każdej próbki, aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność wyników.
  3. Przetwarzanie tkanek końcowych
    1. Aspiruj cały pozostały płyn świetlny z każdego worka jelitowego za pomocą sterylnej pipety. Delikatnie obchodzić, aby nie pęknąć tkanki.
    2. Każdy woreczek przepłucz trzykrotnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) zawierającą 1% penicyliny–streptomycyny (P/S), aby usunąć pozostałości, bakterie i zanieczyszczenia. Dbaj o dokładne mycie, aby zachować sterylność do dalszych zastosowań.
    3. Pokrój tkankę jelitową na fragmenty o wymiarach 2mm 3 (2 mm * 2 mm * 0,5 mm) za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych lub ostrzy. Utrzymuj fragmenty w równomiernym rozmiarze, aby zapewnić stałą inkubację.
    4. Inkubuj fragmenty tkanek w 10 mL DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% (v/v) P/S w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂. Podłoże hodowlane powinno być odnawiane co 12 godzin podczas inkubacji.
      UWAGA: Ten etap utrzymuje żywotność tkanek i umożliwia odzyskiwanie komórek po eksperymencie. Upewnij się, że błona śluzowa pozostaje nienaruszona podczas cięcia i mycia. Wykonaj trzy pełne mycia PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i zanieczyszczenia mikrobiologiczne. Utrzymuj stałą temperaturę (37 °C) i wysoką wilgotność, aby wspierać aktywność metaboliczną i zdrowie tkanek.
      UWAGA: Obchodzić się z fragmentami tkanek sterylnymi narzędziami i unikać naprężeń mechanicznych, aby zachować integralność nabłonka.
  4. Analizy po inkubacji
    1. Aliquot A (analiza histologiczna):
      1. Utrwalić próbki tkanek w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, aby zachować architekturę komórkową.
      2. Po utrwaleniu osadz tkanki w związku OCT i wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu oceny integralności i morfologii tkanek.
        UWAGA: Paraformaldehyd jest niebezpiecznym utrwalaczem; Postępuj w okapie wyparowczym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego
    2. Aliquot B (Analiza fluorescencyjna i ilościowa ilościowość genomu):
      1. Zamroz pozostałe tkanki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania.
      2. Wykorzystaj zamrożone próbki do mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania ekspresji EGFP, oceniając efektywność transfekcji lub pobieranie wirusa.
      3. Wykonaj ekstrakcję DNA, a następnie qPCR w celu określenia liczby kopii genomu wirusa lub ekspresji transgenów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ten został wykorzystany do oceny efektywności dostarczania genów pośredniczonych przez AAV9 w różnych segmentach jelita cienkiego, a także wpływu leczenia GZNG na poprawę transferu i ekspresji genów. Zaobserwowano kilka kluczowych wyników, które pokazują zarówno skuteczne zastosowanie protokołu, jak i pewną zmienność, która może wystąpić w określonych warunkach.

Ocena ekspresji EGFP pośredniczonego przez AAV9 poprzez analizę histologiczną (barwienie H&E) oraz fluorescencję (EGFP) w je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opracowano nowatorskie podejście in vitro do oceny wchłaniania rAAV przez jelitowe poprzez adaptację klasycznego modelu everted sak jelitowy. Metoda ta umożliwia segmentową analizę efektywności transdukcji AAV w jelicie cienkim w warunkach kontrolowanych oraz ocenę synergicznych efektów między TCM a rAAV. Tutaj omawiane są kluczowe kroki, rozwiązywanie problemów i modyfikacje, ograniczenia oraz ich szerokie zastosowania w terapii genowej i dostarczaniu leków.

Klu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować wszystkim kolegom i współpracownikom, którzy zapewnili cenne dyskusje i wsparcie techniczne podczas całego tego badania. Doceniamy również wsparcie instytucjonalne, które umożliwiło tę pracę. Prace te zostały finansowo wsparte grantem #82474349 od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (dla CL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMWISENT319-005-CLPłynne, z 4,5 g/L D-glukozy, z L-glutaminą, fenolem czerwonym i pirogrowinianem sodu
Primery qPCR regionu CDS EGFPTSINGKEN: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Serum bydlęce płodoweWISENT086-550Wysoka jakość, pierwotna hodowla komórkowa
Penicylina-Streptomycyna (P/S)WISENT450-201-ELRoztwór ten zawiera 10 000 jednostek/mL penicyliny oraz 10 000 mikro; G/mL streptomycyny.
PrimeScript RT Master Mix (Idealny czas rzeczywisty)TaKaRaRR036A
Uniwersalny zestaw do ekstrakcji RNA TaKaRa MiniBESTTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Produkt ten nadaje się do eksperymentów ilościowych fluorescencji z wykorzystością metodą barwnika SYBR Green i jest kompatybilny z różnymi ilościowymi instrumentami PCR do fluorescencji w czasie rzeczywistym.
TSINGKE TSP202-200 Trelief  Hi-Pure Animal Genomic DNA KitTSINGKETSP202-200
Rozwiązanie Tyrode'aYuan YeR20268-500mlSkłada się głównie z chlorku sodu, chlorku potasu, chlorku magnezu, fosforanów, chlorku wapnia, glukozy oraz HEPES.

Bibliografia

  1. Wang, J. H., et al. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  2. Durbacz, M. Z., et al. Optimized genomic editing of a common Duchenne muscular dystrophy mutation in patient-derived muscle cells and a new humanized mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102569(2025).
  3. Hara, H., et al. An oral Aβ vaccine using a recombinant adeno-associated virus vector in aged monkeys: reduction in plaque amyloid and increase in Aβ oligomers. J Alzheimers Dis. 54 (3), 1047-1059 (2016).
  4. Xin, K. Q., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus elicits human immunodeficiency virus-specific immune responses. Hum Gene Ther. 13 (13), 1571-1581 (2002).
  5. Hara, H., et al. Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 6 (5), 483-488 (2004).
  6. Steel, J. C., et al. Oral vaccination with adeno-associated virus vectors expressing the neu oncogene inhibits the growth of murine breast cancer. Mol Ther. 21 (3), 680-687 (2013).
  7. Ma, H., et al. Oral adeno-associated virus-sTRAIL gene therapy suppresses human hepatocellular carcinoma growth in mice. Hepatology. 42 (6), 1355-1363 (2005).
  8. Hao, Z. M., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-7 suppresses CCl4-induced hepatic fibrosis in mice. Mol Ther. 20 (11), 2043-2051 (2012).
  9. Huang, W., et al. Genetic manipulation of brown fat via oral administration of an engineered recombinant adeno-associated viral serotype vector. Mol Ther. 24 (6), 1062-1069 (2016).
  10. Liu, X., et al. Adipose tissue insulin receptor knockdown via a new primate-derived hybrid recombinant AAV serotype. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 8(2014).
  11. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  12. Lassoued, M. A., Khemiss, F., Sfar, S. Comparative study of two in vitro methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus everted gut sac. J Pharm Pharm Sci. 14 (1), 117-127 (2011).
  13. Yang, Y. N., Zhan, J. G., Cao, Y., Wu, C. M. From ancient wisdom to modern science: Gut microbiota sheds light on property theory of traditional Chinese medicine. J. Integr. Med. 22 (4), 413-444 (2024).
  14. Liao, C. P., et al. Intestinal absorption components and absorption characteristics of Wuwei Qingzhuo San by everted intestinal sac models. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 49 (2), 509-517 (2024).
  15. Liao, Z. G., et al. Transport properties of puerarin and effect of extract of Radix Angelicae Dahuricae on puerarin intestinal absorption using in situ and in vitro models. Phytother Res. 28 (9), 1288-1294 (2014).
  16. During, M. J., Xu, R., Young, D., Kaplitt, M. G., Sherwin, R. S., et al. Peroral gene therapy of lactose intolerance using an adeno-associated virus vector. Nat. Med. 4 (10), 1131-1135 (1998).
  17. Hao, Z., Yang, X., Lv, Y., Li, S., Purbey, B. K., et al. Intracolonically administered adeno-associated virus-bone morphogenetic protein-7 ameliorates dextran sulphate sodium-induced acute colitis in rats. J. Gene Med. 14 (7), 482-490 (2012).
  18. Meng, J. S., et al. Melittin analog p5RHH enhances recombinant adeno-associated virus transduction efficiency. J. Integr. Med. 22 (1), 72-82 (2024).
  19. Sun, H., et al. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4 (4), 395-411 (2008).
  20. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids—current and future applications. Vet Sci. 3 (4), 31(2016).
  21. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  22. Caldeira, T. G., et al. Determination of intestinal permeability using in situ perfusion model in rats: challenges and advantages to BCS classification applied to digoxin. Int J Pharm. 551 (1-2), 148-157 (2018).
  23. Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411(2019).
  24. Mateer, S. W., et al. Ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease. J Vis Exp. (108), e53250(2016).
  25. Liu, W., et al. Developments in methods for measuring the intestinal absorption of nanoparticle-bound drugs. Int J Mol Sci. 17 (7), 1171(2016).
  26. Lengler, J., et al. Crucial aspects for maintaining rAAV stability. Sci Rep. 14, 27923(2024).
  27. Benskey, M. J., et al. Targeted gene delivery to the enteric nervous system using AAV: a comparison across serotypes and capsid mutants. Mol Ther. 23 (3), 488-500 (2015).
  28. Polyak, S., et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2, and 5. Dig Dis Sci. 53 (5), 1261-1270 (2008).
  29. Dudhatra, G. B., et al. A comprehensive review on pharmacotherapeutics of herbal bioenhancers. Scientific World Journal. 2012, 637953(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wch anianie jelitowewyewerowany woreczek jelitowydoustne podawanie rAAVtransdukcja gen wnab onek jelitowypobieranie wektoraekspresja transgenuwzmacniacze dostarczania

Powiązane artykuły