Uproszczony i solidny protokół izolacji i długoterminowej ekspansji pierwotnych komórek nabłonka endometrium człowieka

Summary

Podstawowa hodowla ludzkich komórek nabłonkowych endometrium (HEEC) jest technicznie wymagająca. Protokół ten łączy trawienie mieszanych enzymów z inhibitorem ROCK (Y-27632), aby poprawić przeżywalność i ekspansję komórek, jednocześnie zachowując tożsamość nabłonka, zapewniając solidną platformę do badań endometrialnych i zastosowań regeneracyjnych.

Abstract

Badania nad zaburzeniami endometrialnymi, w tym hiperplazją endometrium związaną z tamoksifenem, były ograniczone przez brak solidnych modeli nabłonka in vitro . Tradycyjne metody izolowania ludzkich komórek nabłonka endometrium (HEEC) są często nieefektywne, technicznie wymagające i słabo skalowalne. Opisano tutaj uproszczony, bezkarmicielowy protokół integrujący trawienie mieszane enzymów, lizę erytrocytów oraz leczenie inhibitorem ROCK (Y-27632), umożliwiając efektywną izolację i rozszerzanie pierwotnych HEEC. Obecność Y-27632 jest kluczowa dla łagodzenia apoptozy wywołanej dysocjacją i poprawy adhezji komórek we wczesnym stadium. To podejście wspiera przejście seryjne przy zachowaniu tożsamości nabłonkowej dla co najmniej 3 przejść, przy zachowaniu morfologii powyżej 10 przejść. Charakterystyka metodą Western blot i immunofluorescencji potwierdza wysoką ekspresję cytokeratyny 18 i E-kadheryny, z postępującym spadkiem zanieczyszczeń stromalnych z wimentyną dodatnimi w warunkach selektywnej hodowli. Dzięki rozwiązaniu kluczowych ograniczeń technicznych, metoda ta zapewnia niezawodne, skalowalne źródło komórek nabłonkowych do badań mechanistycznych, modelowania chorób, badań lekowych oraz zastosowań regeneracyjnych w badaniach endometrialnych. Standaryzowany przepływ pracy stanowi alternatywę dla złożonych systemów kokultury, ułatwiając szerszy dostęp do wysokiej jakości modeli komórek pierwotnych.

Introduction

Wiarygodne modele in vitro są niezbędne do rozwoju badań nad zaburzeniami endometrialnymi, szczególnie tymi związanymi z tamoksifenem (TAM)¹. Chociaż TAM jest szeroko stosowany jako terapia endokrynna w leczeniu raka piersi, jego częściowa aktywność estrogen-agonistyczna w endometrium znacząco zwiększa częstość występowania przerostu endometrium (endometrial), polipów, a w niektórych przypadkach także przemiany złośliwej². Obecne kliniczne leczenie patologii endometrium związanej z tamoksifenem opiera się głównie na terapii progesteronową lub interwencji chirurgicznej, które mają istotne ograniczenia. Leczenie progesteronem często wiąże się z niepożądanymi skutkami, takimi jak przełomowe krwawienie i przyrost masy ciała, podczas gdy metody chirurgiczne mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia endometrium i zaburzać płodność³. Te ograniczenia podkreślają potrzebę solidnych modeli nabłonkowych, które mogą wspierać badania mechanistyczne i wspierać rozwój ulepszonych strategii terapeutycznych. Jednak postępy w tej dziedzinie były przede wszystkim ograniczone przez techniczne wyzwania związane z pozyskiwaniem ludzkich, rozszerzalnych komórek nabłonka endometrium ludzkiego (HEEC).

Podstawowe prace w tej dziedzinie przedstawili Arnold i in. (2001), którzy izolowali populacje komórek stromalnych i nabłonkowych poprzez trawienie kolagenazy oraz sekwencyjną filtrację sitową, osiągając ponad 98% czystości potwierdzoną immunobarwieniem⁴. Pomimo sukcesu, metoda opierała się na trawieniu pojedynczym enzymem, wymagała długotrwałego przetwarzania i opierała się na filtracji stopniowej do usuwania zanieczyszczeń stromalnych i erytrocytowych, co czyniło ten proces pracochłonnym i trudnym do^{standaryzacji} 4. Później Yokomizo i in. (2002) ustanowili podstawowy system hodowli HEEC z okazów histerektomii, wykorzystując trójwymiarową kokulturę z komórkami zasilającymi stromalnie⁵. Podczas gdy mikrośrodowisko oparte na dokarmniku częściowo wspierało wzrost nabłonka, system pozwalał jedynie na ograniczone przepuszczanie, zazwyczaj nie więcej niż pięć przejść, co ograniczało jego użyteczność w zastosowaniach wymagających wielkoskalowego, stabilnego rozszerzania nabłonka⁵.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano uproszczony i wysoce powtarzalny protokół izolacji HEEC oraz długoterminowej kultury. Kierując się wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że inhibitor ROCK Y-27632 znacząco poprawia wydajność hodowli pierwotnej dla ludzkich keratinocytów, komórek nabłonka dziąseł oraz komórek nabłonka mlecznego, ta sama zasada została zastosowana do tkanki endometrium ^6,7,8. Podejście to obejmuje trzy kluczowe cechy: trawienie mieszanymi enzymami wspierające efektywną dysocjację tkanek, kluczowy krok lizy erytrocytów mających na celu zmniejszenie wczesnego skażenia i ułatwienie przyczepienia nabłonka oraz ciągłe suplementowanie Y-27632 w celu hamowania apoptozy, wspierania adhezji i zwiększania zdolności proliferacyjnej. Dzięki tej strategii HEEC mogą być rozszerzane na wiele przejść, zachowując przy zachowaniu morfologii nabłonka i wysokiej ekspresji CK18 oraz E-kadheryny ^9,10. Co istotne, seryjne przekazywanie przez co najmniej 3 pokolenia nie skutkowało wykrywalnym dryfem fenotypowym, co świadczy o stabilności i skalowalności systemu hodowli.

Metoda ta bezpośrednio odpowiada na długoletnie problemy techniczne w pierwotnej hodowli HEEC, w tym wysokie wymagania dotyczące wkładu tkanek, złożone procesy pracy, niską powtarzalność oraz ograniczony potencjał ekspansji. Zachowując tożsamość nabłonka i cechy funkcjonalne przez cały okres przejścia, protokół zapewnia wiarygodną platformę do badań nad regeneracją endometrium endometrium (endometrial), patofizjologią, wysokoprzepustowością badań leków oraz interakcjami komórka–biomateriał. Integrując przetwarzanie tkanek z rozszerzaniem seryjnym, ten ustandaryzowany workflow rozwiązuje długoletni wąski gardło w biologii rozrodu i wspiera przyszłe zastosowania w inżynierii tkankowej, medycynie regeneracyjnej oraz terapii spersonalizowanej.

Protokół ten wymaga świeżych próbek tkanek, najlepiej przetworzonych w ciągu 24 godzin od pobrania. Wydajność komórek i charakterystyka wzrostu mogą się różnić w zależności od źródła tkanki, na przykład polipów endometrium w porównaniu do normalnego endometrium. Częste przyczyny niewydolności to niepełne trawienie tkanek, nadmierne zanieczyszczenie erytrocytów lub niewystarczająca suplementacja Y-27632. Chociaż system wspiera ekspansję przez wiele przejść, może być konieczna dalsza optymalizacja, aby utrzymać stabilność fenotypową podczas rozciągniętej hodowli.

Protocol

Świeże próbki tkanek endometrium pozyskano z polipów macicy chirurgicznie usuniętych od pacjentów w Pierwszym Szpitalu Afiliowanym Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Afiliowanego Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang (Protokół nr 2025-KLS-569-01; zatwierdzony 14 września 2025). Obsługa pierwotnych próbek ludzkich odbywała się w szafce biologicznej klasy II z wykorzystaniem odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym fartuchów laboratoryjnych, rękawiczek i ochrony oczu. Wszystkie odczynniki enzymatyczne były traktowane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami bezpieczeństwa oraz wytycznymi dotyczącymi kart bezpieczeństwa materiałów (MSDS).

1. Pozyskanie tkanek

1. Zbieraj świeżą tkankę endometrium z próbek chirurgicznych pobranych od dorosłych kobiet. Przenieś tkankę do jałowych probówek zawierających 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 3% penicyliny/streptomycyny (P/S).
   UWAGA: Wszystkie tkanki powinny być przetworzone w ciągu 24 godzin od pobrania operacji.

2. Wstępne traktowanie tkanek

1. Mieszaj tkankę w roztworze do płukania (Tabela 1) przez dwa kolejne płukania po 2 minuty, aby usunąć śluz i zakrzepy krwi.
2. Krótko opłucz tkankę w 5 ml etanolu 75% przez 5 sekund, aby zdezynfekować powierzchnię.
3. Natychmiast przełóż tkankę do 20 ml roztworu do płukania i przemyj przez dwa razy, po 5 minut każdy, aby usunąć resztki etanolu.
   UWAGA: Ponieważ etanol jest łatwopalny, należy odejść od otwartych ogniów i utylizować odpady zawierające etanol zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego instytucji.

3. Trawienie tkanek i pobieranie komórek

1. Mielenie tkanek
   1. Tkanie endometrium należy podrobnić dwoma sterylnymi ostrzami, aż fragmenty (~2 mm³) będą mogły być zasysane przez końcówkę pipety o pojemności 1 mL (około 10 min).
   2. Przełóż posiekaną tkankę do rurki wirówki o pojemności 50 mL.
2. Trawienie enzymatyczne
   1. Dodaj 10 ml roztworu trawiennego (Tabela 1) do probówki zawierającej fragmenty tkanki.
   2. Inkubuj rurkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Delikatnie potrząsaj rurką co 15 minut, aby ułatwić trawienie.
   3. Konduj inkubację, aż fragmenty tkanek będą widocznie rozłączone, a roztwór będzie mętny z powodu uwolnionych komórek.
3. Zakończenie trawienia
   1. Dodaj 10 ml roztworu neutralizującego, aby zakończyć trawienie enzymatyczne.
   2. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety P1000 ustawionej na 800 μL.
4. Filtracja i wirowanie
   1. Przefiltruj trawioną zawiesinę przez filtr siatkowy o średnicy 100 μm.
   2. Wirówka w 156 × g przez 5 minut w 25 °C.
5. Liza czerwonych krwinek (RBC)
   1. Ostrożnie zasysaj supernatant, nie poruszając granulatu.
   2. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 2 mL wcześniej schłodzonego buforu lizycznego RBC.
   3. Inkubuj na lodzie (około 4 °C) przez 3–5 minut z delikatnym poruszeniem.
6. Zakończenie lizy
   1. Dodaj ≥10 ml PBS lub kompletnego podłoża, aby zatrzymać reakcję lizy.
   2. Wirówka w 156 × g przez 5 minut w 25 °C.

4. Inicjacja kultury pierwotnej

1. Mycie i wirowanie
   1. Ostrożnie zasysaj supernatant, nie poruszając granulatu.
   2. Ponownie zawiesić granulkę w 20 mL roztworu neutralizującego.
   3. Mieszaj pipetując około 15 razy.
   4. Wirówka w 156 × g przez 5 minut w 25 °C.
2. Zawieszenie i rozsiew
   1. Aspiruj nadwysoka.
   2. Delikatnie ponownie zawiesij osad komórkę w 10 mL początkowego pożywki hodowlowej zawierającej 10 μM Y-27632, powoli pipetując 8–10 razy pipetując pipetą o pojemności 1 mL.
   3. Umieść zawiesinę komórkową w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalną gęstość początkowego siewu, wybierz naczynie hodowlane zgodnie z szacowaną wydajnością komórek. Jeśli oczekiwana wydajność wynosi >1 × 10⁶ ogniw, użyj talerza 100 mm, a dla niższych plonów użyj talerza 60 mm. Dostosuj odpowiednio średnią objętość (np. 10 mL dla naczynia 100 mm; 4 mL dla naczynia 60 mm).
3. Warunki hodowlane
   1. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5%_CO2.
   2. Co 3 dni wymieniaj medium na świeże podłoże nabłonkowe bez Y-27632.
      UWAGA: Monitorowanie przyczepności i morfologii komórek; Odświeżaj podłoże co 2 dni, gdy komórki zaczną się mnożyć.

5. Przechodzenie komórek

1. Przygotowanie do trypsynizacji
   1. Gdy hodowle osiągną 80%–90% zbiórki, usuń naczynie o średnicy 100 mm z inkubatora.
   2. Usuń zużyte medium.
   3. Płucz komórki dwa razy 2 mL PBS.
   4. Ostrożnie zasysaj i usuń resztki PBS.
2. Trypsynizacja
   1. Dodaj 2 mL trypsyny o stężeniu 0,05%.
   2. Delikatnie mieszaj, aby zapewnić równomierne pokrycie warstwy komórkowej.
   3. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
   4. Zbadaj komórki pod mikroskopem (40x obiektyw), aby potwierdzić odwarstwienie.
3. Neutralizacja i zbieranie
   1. Dodaj 8 ml roztworu neutralizującego, aby zatrzymać trawienie trypsyny.
   2. Przenieś zawiesinę ogniwa do rurki wirówki o pojemności 15 mL.
   3. Pipetuj około 15 razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
   4. Wirówka w 156 × g przez 5 minut w 25 °C.
4. Zawieszenie i ponowne siewnictwo
   1. Aspiruj supernatant bez zakłócania granulki.
   2. Delikatnie zawiesz pellet komórkowy w 10 mL medium nabłonkowego, pipetując w górę i w dół około 10 razy za pomocą pipety o pojemności 1 mL.
   3. Nasiono 1 × 10^{6 komórek} w 10 mL ośrodka nabłonkowego do nowej misy o średnicy 100 mm.
   4. Dostosuj gęstość siewu, aby następnego dnia promować izolowane, dobrze rozprzestrzenione pojedyncze komórki lub małe skupiska, unikając przeludnienia.
5. Konserwacja po przejściu
   1. Inkubować w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5%_CO2).
   2. Regularnie obserwuj hodowlę i wymieniaj podłoże nabłonkowe co 2 dni.
      UWAGA: Komórki są zazwyczaj gotowe do zastosowań w dalszej fazie po pierwszym lub drugim przejściu, gdy uzyska się zdrową, przylegającą monowarstwę o ≥80% zbiegu.
      UWAGA: Wszystkie materiały, które miały kontakt z pierwotnymi komórkami ludzkimi, traktowano jako potencjalne zagrożenia biologiczne. Przed utylizacją lub dalszym przetwarzaniem materiały te były dezynfekowano przy użyciu wybielacza 10% zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego.

Results

Pomyślne ustanowienie pierwotnego systemu hodowli HEEC zostało potwierdzone poprzez oceny morfologiczne, proliferacyjne i molekularne, jak przedstawiono na Rysunku 1. Łącząc trawienie mieszanymi enzymami, lizę erytrocytów oraz inhibitor ROCK, protokół ten umożliwił efektywną izolację i stabilną ekspansję komórek nabłonkowych z ludzkiej tkanki endometarialnej.

Obserwacje morfologiczne wykazały istotną rolę Y-27632 podczas wczesnej kultury. HEEC-y hodowane z 10 μM Y...

Discussion

Ustanowienie wiarygodnego modelu in vitro ludzkich komórek nabłonka endometrium (HEEC) jest niezbędne do badania biologii endometrium i patologii¹¹. Chociaż opracowano kilka metod izolacji HEEC, większość z nich pozostaje ograniczona przez złożoność techniczną, niską sprawność i ograniczony potencjał ekspansji ^4,5. Wiele protokołów opiera się również na warstwach zasilających, które wprowadzają zmienność i utrudniają skalowalność<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	Izolacja dla HEEC
Kolagenaza typu I	Merck	SKU:SCR103	Izolacja dla HEEC
100 &mikro; Filtr siatkowy m	Solarbio	431752	Dla filtracji HEEC
rabbit anty CK18	abcam	ab133263	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HEEC
rabbit anti CDH1	abcam	AB40772	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HEEC
rabbit anti VIM	abcam	AB16700	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HEEC
4% paraformaldehydu	solarbio	P0099	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HEEC
Inkubator CO2	Thermo Scientific	42820906	Dla inkubacji komórek
Wirówka	Eppendorf	5404HN133048	Wirówka komórkowa
Naczynie do hodowli komórek 100 mm	Corning	430167	Do hodowli komórkowych
Rurka do wirówki 50 ml	Corning	430829	Do wirowania komórek
Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml	NEST	081722CK01	Do trawienia komórek
Sietko komórkowe	Solarbio	431752	Filtracja komórek
Roztwór buforowany fosforanem	Tecono	20201033	Roztwór do mycia
DMEM	Gibco	8122622	Składnik ośrodka neutralizującego
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Scientific	15140-122	Antybiotyki
Serum bydlęce płodowe	Gibco	2556132P	Składnik ośrodka neutralizującego
0,05% trypsyny	Basalmedia	K431010	Dla HEEC  dysocjacja
Y-27632	Solarbio	IY0040	Inhibitor ROCK
Bufor lizy czerwonych krwinek	Solarbio	R1010	Liza krwinek czerwonych
1% Triton X-100	Thermo Scientific	HFH10	Przepuszczalność błon
Donkey anty-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A32790TR	Przeciwciało wtórne
DAPI	Thermo Scientific	62248	Barwienie DNA
1 x PBST	Solarbio	P1031	Bufor do prania
Dedykowane medium dla podstawowych HEEC	iCell	iCell-f004-002h	Dla kultury HEEC
Odwrócony mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM880	Wykorzystywany do pozyskiwania obrazów immunofluorescencyjnych; wyposażony w 40x
Linia komórkowa MRC-5	iCell	iCell-h146	Linia komórkowa ludzkiego gruczolakoraka endometrium u człowieka; Profil STR.
Linia komórkowa Ishikawa	iCell	iCell-h113	Linia komórkowa ludzkiego gruczolakoraka endometrium u człowieka; Profil STR.