Artykuł metodologiczny

Ocena aktywności metabolycznej całych regenerujących się komor danio pręgowanego ex vivo za pomocą testu strumienia zewnętrznego

535 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół ilościowego określania tempa zużycia tlenu i szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego komor dorosłych danio danio (ex vivo ), aby scharakteryzować ich zdolności metaboliczne oksydacyjne i glikolologiczne.

Streszczenie

Zdolność danio pręgowanego do regeneracji serca w dorosłym wieku częściowo przypisuje się adaptacjom metabolicznym. Chociaż przypuszczano, że serce ryb w znacznym stopniu zależy od glikolizy, najnowsze badania ujawniły bardziej złożony profil metaboliczny, w którym metabolizm oksydacyjny jest kluczowym elementem redyferencjacji kardiomiocytów i udanej późnej regeneracji serca. W 2025 roku wprowadziliśmy metodę wysokoprzepustową do oceny profilu metabolicznego całych komór danio pręgowanego ex vivo, wykorzystując test Seahorse (test przepływu zewnętrznego). Metoda ta umożliwia szybką, w czasie rzeczywistym ocenę podstawowego i maksymalnego zużycia tlenu (OCR) oraz szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) za pomocą testu stresowego XF Mito na analizatorze Seahorse XFe24. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania analizy strumienia zewnątrzkomórkowego na całych komorach danio pręgowanych. Możliwość ilościowego określenia OCR i ECAR w żywych całych sercach ex vivo da możliwość wyjaśnienia metabolizmu serca w kluczowych momentach rozwoju, postępu choroby i regeneracji.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do ludzi, danio pręgowane (Danio rerio) zachowują zdolność regeneracji utraconej tkanki sercowej przez całe dorosłe życie1. Po urazie serca kardiomiocyty w strefie granicznej rany ulegają odróżnicowaniu i ponownemu wchodzeniu do cyklukomórkowego 2,3, aby przywrócić kardiomiocytynumer 4 i ponownie zasiedlić ranę. Ostatnio uznano znaczenie redyferencjacji kardiomiocytów w procesie regeneracyjnym5. Oba te procesy są ściśle regulowane przez zmiany metaboliczne w sercu danio pręgowanego – glikoliza napędza proliferację 6,7, a fosforylacja oksydacyjny (OXPHOS) sprzyja redyferencjacji8. Chociaż farmakologiczne i genetyczne metody manipulacji metabolizmem są powszechne w dziedzinie regeneracji 6,7, weryfikacja metabolicznych skutków tych zaburzeń pozostaje trudna ze względu na niewielkie rozmiary serca danio pręgowanego, co wymaga złożonego, dostosowanego zestawu do kanowacji 9,10,11 lub łączenia wielu serc do spektrometriimasowej 12 lub spektroskopii NMR 8. 13.

Aby obejść te ograniczenia, niedawno opisaliśmy zastosowanie analizatora Seahorse XFe24 do wysokoprzepustowego profilowania metabolicznego całych komor danio pręgowanego ex vivo8. Badanie strumienia zewnętrznego zostało zaprojektowane do pomiaru szybkości zużycia tlenu (OCR) oraz szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) komórek, wysp trzustkowych i sferoidów. Osiąga się to za pomocą czujników w stanie stałym, które wykrywają zmiany stężenia tlenu i protonu (pH) w ośrodku wynikające z wykorzystania tlenu przez łańcuch transportu elektronów oddechowych oraz produkcji mleczanu zależnej od glikolizy (Rysunek 1A)14.

Analizę strumienia zewnątrzkomórkowego można przeprowadzić na układzie płyt 96-dołkowych (XFe96 i XF Pro), minipłytach 8-dołkowych lub różnych iteracjach płyt 24-dołkowych (XFe24). Chociaż płyty z 96 dołkami zapewniają wyższą przepustowość, odległość robocza między czujnikiem a dnem dołka nie jest odpowiednia, by pomieścić całą komorę danio pręgowanego. Dodatkowo, w formacie płyty 96-dołkowej nie ma możliwości zabezpieczenia komory na dnie dołka, aby zapobiec jej unoszeniu się w ośrodku i zakłócaniu sensorów. Z kolei mikropłytka do przechwytywania wysepek XFe24 została pierwotnie zaprojektowana do charakteryzacji metabolicznej pierwotnych wysetek trzustkowych i dzięki temu umożliwia osadzanie tkanki na dnie dołka, która jest następnie zabezpieczana przesiewką (siatką). Ze względu na niewielki rozmiar serca danio danio, udało nam się dostosować mikropłytę do chwytania wysepek do użycia na komorach danio pręgowanych, które pozostają zabezpieczone pod siatką przez cały czas trwania testu.

Aby ocenić zdolność oddechową mitochondriów, wykorzystaliśmy test Mito Stress, w którym użyto czterech inhibitorów łańcucha transportowego elektronów oraz syntazy trifosforanu adenozyny (ATP) (Rysunek 1A). Po pierwsze, pobierane są pomiary bazowe OCR (rysunek 1B, magenta). Następnie wstrzykuje się oligomycynę, inhibitor zespolonego V. Oligomycyna hamuje aktywność syntazy ATP, co prowadzi do zmniejszenia OCR, co jest możliwe do produkcji ATP (rysunek 1B, zielony). Pozostałe zużycie tlenu jest wynikiem oddychania niesprzężonego i niemitochondrialnego zużyciu tlenu (Rysunek 1B, odpowiednio pomarańczowy i szary)15. Po podaniu oligomycyny wstrzykuje się FCCP, który rozprasza gradient protonowy na błonie mitochondrialnej (rysunek 1A). W próbie przywrócenia gradientu protonów, mitochondria zwiększają zużycie tlenu do maksymalnej pojemności (Rysunek 1B, niebieski). Na koniec stosuje się mieszankę rotenonu i antymycyny A, która hamuje odpowiednio kompleksy I i III (Rysunek 1A). To połączenie leków prowadzi do całkowitego wyłączenia aktywności mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów oddechowych z powodu braku przepływu elektronów z kompleksów I i III do kompleksu IV15. Pozwala to na pomiar zużycia tlenu przez niemitochondrialne (rysunek 1B, szary).

Ogólnie ogólnie, korzystając z mikropłyty chwytania wysepek z testem Mito Stress, byliśmy w stanie szybko i powtarzalnie ocenić oksydacyjne i glikolityczne zdolności metaboliczne całych komór danio pręgowanego ex vivo. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół dotyczący tego zabiegu. Na koniec pokazujemy przeżywalność nieuszkodzonych, dzikich typu izolowanych komór ex vivo w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego oraz potwierdzamy test Mito Stress na 14 dniach po kriourazie (dpci) w komorach transgenicznych daniodanio 8.

Protokół

Wszystkie opisane poniżej procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie ze znowelizowaną ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986 w Wielkiej Brytanii oraz dyrektywą 2010/63/UE w Europie i zatwierdzone przez centralny Komitet ds. Opieki nad zwierzętami i Przeglądu Etycznego Uniwersytetu Oksfordzkiego.

UWAGA: Protokół ten został przeprowadzony przy użyciu analizatora Seahorse XFe24 oraz medium DMEM Seahorse bez czerwonego fenolu i wodorowęglanu.

1. Uraz serca danio pręgowanego (opcjonalnie)

  1. Uzyskaj odpowiednią zgodę etyczną od lokalnej instytucji i władz krajowych przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Wykonaj kriouraz serca danio dano jak wcześniej opisano16, 17, 18.

2. Nawadnianie wkładu sensora

  1. Otwórz zestaw do analizy strumienia zewnętrznego i załaduj 24-dołową płytę użytkową (Rysunek 2A), pipetując 500 μL roztworu kalibracyjnego na odwiert.
  2. Zamknąć płytę użytkową za pomocą wkładu czujnika i hydro boostera (Rysunek 2A).
  3. Inkubuj wkład i płytkę użytkową w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc (18–72 godziny). Trzymaj pokrywkę na kartridżu sensora przez cały czas inkubacji.

3. Przygotowanie rozwiązań lekowych i mediów

  1. Przygotować roztwory zapasowe leków: rozpuścić oligomycynę w dimetylosulfoksydzie (DMSO) do stężenia 10 mM, karbonylowy cyjaniek 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon (FCCP) w DMSO do stężenia 5 mM, rotenon w DMSO do stężenia 10 mM oraz antymycynę A w etanolu do stężenia 10 mM i przechowywać w -20 °C, jeśli nie jest natychmiast użyty.
    UWAGA: Zaleca się przygotowywanie świeżych roztworów oligomycyny, rotenonu i antymycyny co 2–3 miesiące oraz za każdym razem roztworu FCCP przed przeprowadzeniem testu.
  2. Przygotować stężenie robocze leków (500 μM oligomycyny, 300 μM FCCP, 450 μM po mieszankę rotenonu/antymycyny) poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w ośrodku DMEM. Upewnij się, że końcowa objętość dla stężenia roboczego wynosi 1,5 mL oligomycyny, 1,65 mL FCCP oraz 1,8 mL rotenonu/antymycyny A, co pozwala na załadowanie 30 portów (24 porty na inhibitor na wkładzie plus 6 dodatkowych portów na lek w celu korekty błędów pipetowania).
    UWAGA: W rotenonie/antymycynie A pojawi się pewne wytrącanie, ale po dokładnym wymieszaniu zostanie ono zminimalizowane. Należy zauważyć, że stężenia wymienione w 3.2 są 10 razy wyższe od końcowego stężenia leków w momencie wstrzykiwania do studni.
  3. Przygotuj podłoże DMEM (pH 7,4) zawierające 10 mM glukozy, 1 mM pirorurianu i 2 mM glutaminy, a następnie przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

4. Włączenie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Włącz analizator przez boczny przycisk na noc przed testem, aby zapewnić wyrównanie temperatury z otoczeniem.
  2. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie Wave.
  3. Wybierz test obciążenia Mito w oprogramowaniu.
  4. Wyłącz grzejnik w lewym dolnym rogu oprogramowania, aby temperatura w analizatorze spadła poniżej 37 °C i osiągnęła 28–29 °C, aby zbliżyć się do standardowej temperatury hodowli daniodano 19.
  5. Ustaw strategię iniekcji na stronie definicji grup (w zakładce strategii wstrzykiwania ), dodając związki, które zostaną zdeponowane w każdym porcie z katalogu związków. Do testu obciążeniowego Mito dodaj oligomycynę w porcie A, FCCP w porcie B oraz rotenon/antymycynę w porcie C. Istnieje możliwość dodania jeszcze jednego leku w porcie D, który nie jest używany w tym protokole.
  6. Usuń wszystkie pozostałe gotowe strategie istniejące pod zakładką strategii wstrzyknięć po zdefiniowaniu strategii eksperymentalnej. Określ grupy eksperymentalne (np. typ dziki i mutant) po stronie Grupy oraz określ strategię wstrzykiwania, którą otrzymają (tę, którą zdefiniują w kroku 4.5). Upewnij się, że strategie wstrzykiwania są zgodne między grupami oraz zgodne z zaprojektowaną strategią.
  7. Na stronie mapy płyt określ pozycję każdej próbki na płycie z 24 dołkami, klikając na każdą grupę, a następnie na doły, które będą zawierać próbki.
    1. Należy zauważyć, że cztery z tych studni nie nadają się do osadzania próbek (Rysunek 2B) i służą jako puste miejsca, które będą używane do korekcji tła. Upewnij się, że próbki w każdej grupie są równomiernie rozmieszczone na płycie, aby wyrównać potencjalne błędy pozycyjne w pomiarach lub warunkach środowiskowych.
  8. Na stronie protokołu usuń zakładkę Control lub Experimental, jeśli nie używa się dodatkowego inhibitora poza wymienionymi powyżej, i upewnij się, że porty programowe odpowiadają pozycjom leków na kartridżu.
  9. Oprogramowanie automatycznie ustawia 3 cykle mieszania, oczekiwania i mierzenia na każdy warunek. Zmodyfikuj liczbę cykli do 10 punktów bazowych (nieleczonych), 3 oligomycyny, 7 FCCP oraz 9 pomiarów rotenonu/antymycyny A, aby umożliwić stabilne ślady i działanie inhibitorów na tkankę 3D. Upewnij się, że każdy cykl składa się z 3 minut mieszania, 2 minut oczekiwania i 3 minut mierzenia.

5. Kalibracja analizatora

  1. Wyjmij wkład i płytkę użytkową z nawilżonego inkubatora (patrz kroki 2.1–2.3).
  2. Usuń hydro booster i pokrywę (rysunek 2A) z wkładu i umieść wkład czujnika na płytę użytkową zawierającą kaliber.
  3. Delikatnie pipetować inhibitory do odpowiednich portów, dotykając bocznej ścianki portu końcówką pipety, zapewniając płynny przepływ: 50 μL oligomycyny w porcie A, 55 μL FCCP w porcie B i 60 μL rotenonu/antymycyny A w porcie C (Rysunek 2C).
    1. Należy zauważyć, że ciecz jest utrzymywane na miejscu wyłącznie przez napięcie powierzchniowe w otworze otworu, dlatego od tego etapu unikaj gwałtownego pipetowania lub taśmowania wkładki. Upewnij się, że żadna ciecz nie dostaje się do portu czujnika (rysunek 2C), ponieważ mogłoby to uszkodzić analizator.
  4. Kliknij start run w programie, nazwij run i zapisz go na komputerze. W tym momencie tacka analizatora otwiera się, aby umieścić wkład i płytkę użytkową.
  5. Umieść wkład załadowany lekami oraz płytkę z kalibrem na tacce analizatora zgodnie z mapą płyty na tacce (studnia A1 w lewym górnym rogu) i upewnij się, że pasuje prawidłowo. Zdejmij booster hydrantu i pokrywę (Rysunek 2A) z płyty przed założeniem na tacę. Brak tego uszkodzi analizator.
  6. Gdy będziesz gotowy, polec programowi, aby rozpoczęło test, naciskając przycisk "uruchom test". W tym momencie analizator przyjmuje załadowaną tacę i rozpoczyna kalibrację.
  7. Rozpocznij izolację serca (patrz kroki 6.1–6.12). Kalibracja potrwa około 40 minut, ale płytka może być przechowywana w analizatorze tak długo, jak potrzeba na wyizolowanie serc i umieszczenie ich w mikropłycie do przechwytywania wysepek (rysunek 2B,D).

6. Izolowanie serc ryb i załadowanie ich na płytę wysepki z 24 dołkami

  1. Otwórz mikropłytę wycisku i załaduj płytkę wysepki z 24 dołkami 500 μL DMEM (10 mM glukozy, 1 mM pirosurowianu, 2 mM glutaminy) w temperaturze pokojowej.
  2. Wszystkie siatki umieść w 35 mm szalce Petriego zawierającej medium DMEM w temperaturze pokojowej, zapewniając pełne zanurzenie i wolność od dużych bąbelków.
  3. Przygotuj dodatkową 35 mm szalkę Petriego zawierającą DMEM (10 mM glukozy, 1 mM pirorurianu, 2 mM glutaminy) w temperaturze pokojowej. Służy to do płukania serc podczas pobierania i rozdzielania komory od przedsionków i bulbus arteriosus.
  4. Rozbij jedną rybę w 5 g/L MS-222 i sprawdź brak odruchów.
  5. Umieść rybę na gąbce przymocowanej do 92 mm szalki Petriego, otwórz jej jamę sercową i rozciń serce zgodnie z wcześniejszymi16,20.
  6. Przepłukaj serca w 35 mm szalce Petriego zawierającej DMEM (10 mM glukozy, 1 mM pirorurianu, 2 mM glutaminy) w temperaturze pokojowej.
  7. Usuń przedsionek przedsionkowy i bulbus arteriosus za pomocą kleszczy w szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  8. Delikatnie potrząśnij i ściśnij komorę, aby krew mogła odpłynąć z jej światła. Nie uszkadzaj ściany komory podczas mycia serca.
  9. Przenieś serce do wyznaczonej studni na mikropłycie przechwytującej wysepki i pozwól mu opaść do środka odpowiedniej studni zgodnie z mapą płytową. Utrzymuj talerz w temperaturze pokojowej. Włącz wszystkie komory do testu, nawet jeśli przestają bić widocznie.
  10. Powtórz ten proces dla wszystkich dostępnych ryb. Porównując aktywność metaboliczną różnych grup eksperymentalnych, zalecamy wyizolowanie jednego serca w każdej grupie, zamiast wszystkich serc z jednej grupy przed przejściem do kolejnej. Chociaż serca mogą przetrwać co najmniej 180 minut w analizatorze (rysunek 3A), proponujemy izolację po jednym sercu na grupę naraz, co jest najlepszą praktyką, aby zapewnić równomierny rozkład czasu w ośrodku między grupami.
  11. Po wyizolowaniu wszystkich serc (około 60 minut dla płyty z 20 sercami), połóż je na dnie mikropłyt wysepek (rysunek 2B) i umieść w centrum studni za pomocą cienkich kleszczy (rysunek 2D,E).
  12. Użyj kleszczy, aby przykryć je siatką (około 20 minut) (Rysunek 2D). Upewnij się, że siatka jest w odpowiedniej orientacji (siatka skierowana w dół w stronę serca) i nie zawiera dużych pęcherzyków, ponieważ mogłoby to zakłócać pomiary (rysunek 2E).
    1. Gdy krata jest na miejscu, użyj kleszczy, aby wcisnąć ją na miejsce od krawędzi, aż usłyszysz ciche kliknięcie. Uważaj, żeby nie rozbić serca kleszczami przez kratkę.

7. Załadowanie próbek na analizator i pobieranie pomiarów

  1. Gdy serca zostaną zamknięte w mikropłytce przechwytującej wysepki, sprawdź w oprogramowaniu, czy wszystkie studnie zostały pomyślnie skalibrowane, co potwierdzają zielone znaczniki na ekranie komputera. Teraz wysuń płytkę użytkową, naciskając otwartą tacę.
    UWAGA: W tym momencie nabój nie zostanie wyrzucony, pojawi się jedynie płytka użytkowa zawierająca kaliber.
  2. Wymień płytkę użytkową na mikropłytę wysepki zawierającą próbki na tacce analizatora. Upewnij się, że mikropłytka wysepki jest prawidłowo umieszczona (A1 w lewym górnym rogu) oraz że pokrywa została zdjęta. Nieusunięcie pokrywki uszkodzi analizator.
  3. Po ustawieniu płytki wysepki poleć oprogramowanie do rozpoczęcia eksperymentu, naciskając płytkę komórki obciążenia. Przez około pierwsze 10 minut czujniki wykonują krok równoważenia, a następnie rozpoczynają pomiary.
  4. Po zakończeniu eksperymentu (około 4 godziny) należy nacisnąć wkład wyrzutowy , aby otworzyć tacę i wyrzucić mikropłytę oraz wkład wysepki.
  5. Zdejmij mikropłytkę i wkład z wysepki i naciśnij gotowe , aby taca się zamknęła. W tym momencie kliknij wynik wyników , aby zobaczyć zebrane dane.
  6. Zapisz pomiary, wyeksportuj je z komputera analizującego i przesłaj do interfejsu analitycznego do dalszej analizy i przetwarzania. To wywoła wycięcie płytki wysewkowej i wkładu z analizatora.
  7. Usuń płytkę wyspy i wkład z analizatora i zamknij wkład za pomocą pokrywki.
  8. Zamroz płytkę wysewki na suchym lodzie lub usuń serca z dołków (patrz krok 8.2) i przechowuj w -20 °C, jeśli izolacja białka dla normalizacji (krok 8) nie zostanie natychmiast wykonana.
  9. Po zapisaniu danych wyłącz oprogramowanie, analizator i komputer.
  10. Prześlij dane do interfejsu analitycznego i zwizualizuj je, wybierając wykres OCR w opcji standardowych widoków . Na interfejsie można zobaczyć dane jako poziom OCR i ECAR lub szybkość, poprawić tło na podstawie pustych odwiertów i wybrać odwierty do wizualizacji, klikając na mapę płyt, aby się pojawiły lub zniknęły.

8. Izolacja białek i ilościowa identyfikacja dla normalizacji

  1. Przygotuj bufor radioimmunoprecipitacyjny zawierający inhibitor proteazy (RIPA), rozpuszczając jedną tabletkę inhibitora proteazy w 10 mL buforu RIPA i dobrze mieszając.
  2. Jeśli jeszcze nie zrobiono (krok 7.8), używając narzędzia do wstawiania ekranu do przechwytywania wysepek (rysunek 2F), usuń siatki z płyty wysepki, aby uwolnić serca. Ostrożnie usuwaj serca, bo mogą utknąć na siatce. Jeśli tak jest, użyj kleszczy, aby je rozluźnić. Jeśli siatki nie da się usunąć narzędziem do wkładania ekranu, przesuń płytkę pod stereoscope i, używając nożyczek do mikrosekcji, ostrożnie przetnij kratę, aby uwolnić serce.
  3. Umieść każdą komorę w probówce o pojemności 1,5 mL zawierającej 200 μL buforu RIPA wzbogaconego inhibitorem proteazy na lodzie.
  4. Homogenizuj serce za pomocą homogenizatora z jednorazowymi tłuczkami na lodzie.
  5. Przygotować standardy poprzez rozcieńczenie dostarczonej albuminy surowicy bydłej (BSA) w buforze RIPA w następujących stężeniach: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Przygotuj roztwór roboczy Pierce BCA (50:1, odczynnik A: odczynnik B, zgodnie z instrukcjami producenta). Oblicz objętość potrzebnego odczynnika roboczego według następującego wzoru:
    (liczba standardów + liczba próbek) × 2 × 200 μL
    UWAGA: Ta objętość pozwala na użycie 200 μL roztworu roboczego na próbkę i standard oraz umożliwia uzyskanie powtórzonych pomiarów na próbkę i standard.
  7. W płytce z 96 dołkami dodaj 25 μL każdego standardu i każdą próbkę na dołek w duplikatach.
  8. Dodaj 200 μL roztworu roboczego na dołek.
  9. Inkubuj płytkę w 37 °C przez 30 minut.
  10. Pozwól płytce ostygnąć do temperatury pokojowej przez 10 minut i uszczelnij ją za pomocą uszczelniacza do płyt. Upewnij się, że w otworach nie ma pęcherzyków, bo mogą one zablokować czytnik płyt. Jeśli powstaje ograniczona liczba pęcherzyków, użyj końcówki lub cienkich kleszczy, aby je przebić.
  11. Zmierz absorpcję przy 562 nm za pomocą czytnika płyt.
  12. Generuj krzywą standardową opartą na absorpcji standardów i obliczaj stężenie białek w próbkach.
  13. Loguj stężenie białka na zakładce normalizacyjnej (rysunek 2G) interfejsu analitycznego dla każdego dołka.

9. Analiza danych

  1. Po normalizacji względem zawartości białka, eksportuj dane z interfejsu analitycznego jako pliki Excel lub Prism do dalszej analizy za pomocą przycisku chmury w prawym górnym rogu wykresu.
  2. Korzystając z danych znormalizowanych, oblicz bazowy OCR i ECAR jako średnią pomiarów bazowych, z wyłączeniem pierwszych trzech pomiarów, ponieważ sygnał może być niestabilny przy pierwszych pomiarach.
  3. Korzystając z danych znormalizowanych, aby określić maksymalny OCR i ECAR, oblicz średnie pomiary trzech najważniejszych akwizycji leczenia FCCP.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia ilościowe oznaczenie OCR i ECAR całych komór mózgu danio pręgowanego. Przeżywalność komór w warunkach ex vivo potwierdzono poprzez inkubację nieuszkodzonych komór typu dzikiego KCL w analizatorze bez zastosowania jakiejkolwiek terapii lekowej (Rysunek 3A). Dane wskazują, że komory wykazują stabilny poziom OCR i ECAR, które są znacząco podwyższone w stosunku do pomiarów bazowych pustych studzienek przez co najmniej 180 min (Rysunek 3A). Dane te sugerują, że komory wykazują prawidłową funkcję oddechową i przeżywalność w tych warunkach ex vivo.

Przeprowadziliśmy kilka pomiarów OCR z użyciem różnych stężeń leków i składów pożywek, aby zidentyfikować optymalną dawkę dla komór (Rysunek 3B). Zaobserwowaliśmy niewielki wzrost krotności zmiany OCR (FCCP/podstawowy) przy zastosowaniu kombinacji [oligomycyna] 10 µM, [FCCP] 8 µM i [rotenon/antymycyna] 25 µM oraz nieco większy wzrost przy [oligomycyna] 50 µM, [FCCP] 30 µM i [rotenon/antymycyna] 45 µM (Rysunek 3B). W związku z tym w naszych eksperymentach zastosowaliśmy te drugie stężenia. Ponieważ komora jest strukturą 3D, istnieje możliwość, że leki silnie oddziałują na zewnętrzne komórki tkanki, nie docierając do komórek po stronie światła komory. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadziliśmy etap permeabilizacji, w którym traktowaliśmy serca saponiną 0,5% przez 30 min przed inkubacją w DMEM (10 mM galaktozy, 1 mM pirogronianu, 4 mM glutaminy). Skutkowało to trwałym obniżeniem OCR i brakiem oczekiwanego wzrostu OCR po wstrzyknięciu FCCP (Rysunek 3C), co sugeruje niewydolność metaboliczną serc. W konsekwencji nie przeprowadzaliśmy permeabilizacji komór w naszych eksperymentach.

Ponadto przedstawiamy tutaj znormalizowane ślady z naszego pierwotnego eksperymentu8. Wykorzystując naturalną zmienność potencjału regeneracyjnego siedmiu szczepów dzikiego typu danio pręgowanego, zidentyfikowaliśmy mdh1ab, cytosolową dehydrogenazę jabłczanową 1Ab, jako czynnik wywierający korzystny wpływ na regenerację poprzez redyferencjację kardiomiocytów. Aby zweryfikować to odkrycie, stworzyliśmy transgeniczne ryby danio pręgowane nadekspresujące mdh1ab w sposób specyficzny dla kardiomiocytów (mdh1ab cOE) oraz ryby kontrolne nadekspresujące zielone białko fluorescencyjne (GFP cOE). Wykonaliśmy kriourazy ich komór, pobraliśmy je w 14 dpci i zbadaliśmy ich metabolizm za pomocą testu Mito Stress (Ryc. 3D). Leczenie oligomycyną nie zmieniło znacząco OCR, choć zaobserwowano niewielki wzrost ECAR. Iniekcja FCCP do medium spowodowała oczekiwany wzrost OCR i ECAR, przy czym próbki mdh1ab cOE utrzymały najwyższą maksymalną wydolność oddechową (Ryc. 3D). Ostatecznie rotenon/antymycyna doprowadziły do całkowitego zahamowania metabolizmu w obu grupach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta pozwoliła nam zidentyfikować istotne różnice w wydolności metabolicznej komór nadekspresujących mdh1ab oraz pomiędzy siedmioma różnymi szczepami dzikiego typu danio pręgowanego8.

Schemat oddychania mitochondrialnego, proces łańcucha transportu elektronów, wykres OCR w funkcji czasu.
Rysunek 1: Metabolizm glukozy podczas testu Mito Stress. (A) Schematyczny przedstawienie metabolizmu glukozy. Glukoza dostaje się do komórki poprzez transportery GLUT i zostaje przekształcona w pirogronian w procesie glikolizy. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) przekształca pirogronian w mleczan, a powstałe protony są wydzielane z komórki. Pirogronian zostaje przekształcony w acetylo-CoA, po czym trafia do mitochondriów i cyklu TCA, aby zasilić oddechowy łańcuch transportu elektronów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Inhibitory kompleksów I, III i V, a także odsprzęgacz FCCP, są zaznaczone na czerwono. Elektrony przemieszczające się przez oddechowy łańcuch transportu elektronów są oznaczone niebieskimi strzałkami, co ostatecznie prowadzi do przekształcenia tlenu i protonów w wodę. (B) Schemat wyników testu Mito Stress. Oddychanie podstawowe zaznaczono na kolor magenta. Po wstrzyknięciu oligomycyny wartość OCR spada, co pozwala na obliczenie oddychania powiązanego z ATP (zielony) oraz przecieku protonów (pomarańczowy). FCCP zwiększa OCR do maksymalnej wydajności oddechowej komórek (niebieski). Wstrzyknięcie rotenonu i antymycyny A prowadzi do zahamowania oddychania mitochondrialnego i umożliwia jedynie zachodzenie oddychania pozamitochondrialnego (szary). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja wielodołkowej kasety sensorycznej; mikropłytka do wychwytywania wysepek; schemat; aparat eksperymentalny.
Rysunek 2: Układ kasety sensorycznej i mikropłytki do wychwytywania wysepek. (A) Zdjęcie kompleksu pokrywka-kaseta sensoryczna-hydro booster-płyta narzędziowa (góra) oraz odwróconej kasety sensorycznej (dół). Pasek skali: 1cm. (B) Zdjęcie mikropłytki do wychwytywania wysepek załadowanej komorami danseba z rybek zebrafish. Czerwone okręgi oznaczają puste dołki, które nie zawierają komór i będą służyć do korekcji tła podczas analizy. Pasek skali: 1cm. (C) Schematyczne przedstawienie układu portów w kasecie sensorycznej XFe24. Port A zawiera oligomycynę, B zawiera FCCP, a C zawiera mieszaninę rotenonu/antymycyny. Port D może pozostać pusty lub można do niego dodać dodatkowy lek. S oznacza port sensoryczny, który nie powinien zawierać żadnego płynu, aby nie uszkodzić analizatora. (D) Reprezentatywne zdjęcie komory danseba z rybki zebrafish na dnie dołka, zamkniętej siatką (lewo) i bez siatki (prawo). Pasek skali: 5mm. (E) Schematyczny przekrój poprzeczny mikropłytki do wychwytywania wysepek zawierającej komorę, siatkę (żółta) i kasetę sensoryczną (zielona). P oznacza porty, a S sensor. Linia falista reprezentuje medium. (F) Narzędzie do wkładania sitka do wychwytywania wysepek. Pasek skali: 1 cm. (G) Ikona karty normalizacji w interfejsie analitycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Szybkość metabolizmu serca danio pręgowanego; wykresy OCR i ECAR; efekty leków; badanie przepuszczalności saponiną.
Rycina 3: Reprezentatywne pomiary OCR i ECAR komór komór serca danio pręgowanego. (A) Reprezentatywne przebiegi OCR i ECAR w nieuszkodzonych komorach serca danio pręgowanego typu dzikiego (szczep KCL), które nie zostały poddane działaniu inhibitorów użytych w analizie (n = 2, linia czerwona). Przebiegi z pustych dołków, które nie zawierają materiału biologicznego, przedstawiono w kolorze szarym (n = 4); OCR, dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, czynnik czas P = 0,0200, interakcja czas × dołek P = 0,0196, czynnik dołek P < 0,0001, czynnik grupa P < 0,0001; ECAR dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, czynnik czas P = 0,1323, interakcja czas × dołek P = 0,0216, czynnik dołek P = 0,0009, czynnik grupa P < 0,0001; dane przedstawione jako średnia ± SEM. (B) Zmiana krotności OCR w zależności od zastosowanych stężeń leków i pożywek. Jednoczynnikowa ANOVA (P = 0,0032) z testem wielokrotnych porównań Tukeya. [O] 5 µM, [F] 4 µM, [RA] 2 µM, n = 6; [O] 10 µM, [F] 8 µM, [RA] 25 µM, n = 8; [O] 25 µM, [F] 16 µM, [RA] 45 µM, n = 8; [O] 50 µM, [F] 30 µM, [RA] 45 µM, n = 8; [O] 100 µM, [F] 60 µM, [RA] 90 µM, n = 8. O, oligomycyna; F, FCCP; RA, rotenon/antymycyna. (C) Przebieg dla komór przepuszczalnionych saponiną (czerwony, n = 4) w porównaniu do komór niepoddanych działaniu saponiny (szary, n = 4); dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, czynnik czas P < 0,0001, interakcja czas × próbka P < 0,0001, czynnik traktowanie P < 0,0001, czynnik próbka P = 0,824; dane przedstawione jako średnia ± SEM. OCRmax komór traktowanych saponiną w porównaniu do komór nietraktowanych; nieparzysty test t Studenta (P = 0,0850). (D) Reprezentatywne przebiegi OCR i ECAR z komór 14dpci mdh1ab cOE (czerwony, n = 8) i GFP cOE (szary, n = 8). OCR, dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, czynnik czas P < 0,0001, interakcja czas × próbka P < 0,0001, czynnik genotyp P < 0,0001, czynnik próbka P = 0,1098; ECAR, dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, czynnik czas P < 0,0001, interakcja czas × próbka P = 0,7507, czynnik próbka P = 0,2154, czynnik genotyp P < 0,0001. Dane zaadaptowane z Lekkos et al., 20258 i przedstawione jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół analizy OCR i ECAR komor per vihño danio ryb za pomocą analizatora Seahorse XFe24 oraz testu obciążenia Mito. Metabolizm kardiomiocytów odgrywa kluczową rolę w regeneracji serca 21,22,23,24. Jednak potwierdzenie fenotypu metabolicznego regenerującego się danio było trudne i często brakuje w publikacjach 6,7. Ze względu na niewielki rozmiar serca danio pręgowanego techniki takie jak spektroskopia NMR czy spektrometria mas wymagają połączenia kilku komór, aby uzyskać odpowiedni sygnał 8,12,13. Natomiast opisana tutaj metoda pozwala na pobieranie pomiarów OCR i ECAR z wielu pojedynczych komór, co zwiększa moc statystyczną.

Klasyczne metody profilowania metabolicznego, takie jak metabolomika, dostarczają obrazu profilu metabolicznego tkanki w momencie jej pobrania. Dzięki testowi stresu Mito mogliśmy zebrać dane na żywo w czasie rzeczywistym o tym, jak komory adaptują się do różnych wyzwań metabolicznych, w tym do maksymalnej pojemności oddechowej, co nie jest widoczne przy stosowaniu innych metod. Aby uzyskać żywe fenotypowanie komór danio pręgowanego, próbowano perfuzję serca danio pręgowanego 9,10,11. Wymaga to skomplikowanego, dostosowanego sprzętu i wysoko wykwalifikowanych techników, aby osiągnąć kaniulację przy zachowaniu metody o niskiej przepustowości. Analizator oferuje prostszą alternatywę, wykorzystując komercyjnie dostępny sprzęt do fenotypowania komór o wysokiej przepustowości (20 komór jednocześnie). Z naszej wiedzy nie przeprowadzono bezpośredniego porównania opisanej w tym artykule z innymi technikami oksymetrii na żywo, takimi jak elektroda typu Clark.

Co ważne, opisana przez nas metoda jest adaptowalna w zależności od pytania badawczego. Test ten był wcześniej używany do charakteryzacji całych zarodków danio dano25,26. Oprócz testu Mito Stress opisanego tutaj, test Mito Fuel Flex został zoptymalizowany do oceny wykorzystania paliwa metabolicznego przez ludzkie plasterki serca27. Ponadto test fenotypu energii komórkowej został dostosowany do charakteryzowania zdolności glikolitycznej regenerujących serca Astyanax mexicanus 28. Przewidujemy, że protokół ten będzie stosowany także w innych strukturach 3D, takich jak organoidy sercowe, i będzie przydatny do walidacji genetycznych zaburzeń szlaków metabolicznych w sercach nieuszkodzonych danio wniesionych.

Zdajemy sobie sprawę, że ta technika ma pewne ograniczenia. Jeśli chodzi o wyzwania techniczne, po izolacji serca były traktowane w medium DMEM w temperaturze pokojowej i nie utrzymywanym w temperaturze 28 °C, co jest maksymalną temperaturą dla daniopranielanka 19. Obniżenie temperatury wody do 18 °C może mieć istotny wpływ na funkcjonowanie serca danio pręgowanego in situ 29,30. Nie spodziewamy się jednak, że krótkotrwała ekspozycja na temperaturę pokojową będzie miała istotny wpływ na fizjologię izolowanych komór, ponieważ komory szybko wracają do analizatora 28 °C. W naszych rękach większość komór przestała bić widocznie podczas rozwarstwiania przedsionka, co wskazuje na brak stymulacji rozrusznika jako etiologię niekurczów. Co więcej, podczas okresu izolacji ośrodek nie był natleniony, co potencjalnie prowadziło do łagodnej hipoksji, która po wymieszaniu w analizatorze przed pierwszym pomiarem wraca do normalnego poziomu tlenu.

Dodatkowym praktycznym aspektem dotyczącym temperatury serc jest wyłączenie grzejnika w analizatorze, co prowadzi do obniżenia temperatury z 37 °C do 28–29 °C. Analizator nie pozwala na obniżenie mocy grzejnika do pożądanej temperatury. Niemniej jednak, gdy analizator pracuje, temperatura wewnątrz tacy jest o 6–7 °C wyższa niż temperatura pokojowa. Ten zakres temperatur pokrywa się z optymalną temperaturą hodowli danio danio19.

Test ten przeprowadza się na komorach mięsa danio masowego. W konsekwencji niemożliwe jest wyróżnienie wkładu poszczególnych typów komórek w zmiany obserwowane w OCR i ECAR. Może to okazać się istotne przy badaniu tempa metabolizmu wczesnych punktów regeneracji, gdy wysoki napływkomórek odpornościowych może maskować zmiany OCR kardiomiocytów. Dodatkowo, pozostała krew pozostała w świetle komory może wpływać na odczyty metaboliczne. Pozwolenie na krwawienie serca w obecności heparyny7 może dodatkowo zmniejszyć wpływ krzepnięcia krwinek w sercu. Ponadto, aby zwiększyć dyfuzję inhibitorów stosowanych w kierunku komórek wewnętrznych komory, podjęliśmy krok permeabilizacji z użyciem saponiny. Permeabilizacja saponiny spowodowała utrzymujący się spadek OCR podczas badania, prowadząc do niewydolności oddechowej komór. Te ograniczenia można by uniknąć poprzez izolację, hodowlę i analizę izolowanych kardiomiocytów, choć takie podejście wymaga długotrwałej hodowli komórek32 , co może nie być optymalne dla warunków regeneracyjnych.

Uszkodzona tkanka może wpływać na zastosowaną metodę normalizacji. W tym badaniu normalizujemy OCR przez μg białka/mL za pomocą testu BCA. Chociaż test BCA nie reaguje silnie z białkami kolagenowymi ze względu na ich bogaty w hydroksyprolinę i prolinę, które są słabo wykrywane za pomocą coper, obecność innych składników ran bez komórek może wpływać na normalizację. Przyszłe badania mogłyby rozważyć wykorzystanie całkowitego DNA33 jako dokładnego odzwierciedlenia żywych komórek w komorze.

Ponadto nie udało się odtworzyć przewidywanego zmniejszenia OCR spowodowanego inhibicją złożonej V15 zależną od oligomicyny. Chociaż niektóre badania wykazują zmniejszenie OCR w leczeniu oligomycyną u izolowanych kardiomiocytów32,34,35, dane tutaj przypominają brak odpowiedzi zgłoszony w niedawnym badaniu na izolowanych dorosłych kardiomiocytach myszy36. Ponieważ stężenie oligomycyny, którego używamy, jest znacząco wyższe niż opisane w wyżej wymienionych badaniach, nie jest jasne, czy zwiększenie końcowego stężenia do ponad 50 μM miałoby wpływ.

Wreszcie, chociaż zużycie powietrza zależy głównie od oddychania, zakwaszanie zewnątrzkomórkowe nie jest wyłącznie napędzane przez mleczan produkowany przez glikolizę, ale także przez przekształcenie dwutlenku węgla w kwas węglowy. Zgłoszono, że w mioblastach zasilanych glukozą jedna trzecia zakwaszenia zewnątrzkomórkowego wynika z dwutlenku węgla w warunkach wyjściowych37. W związku z tym zalecamy ostrożność przy interpretacji pomiarów ECAR uzyskanych przez analizator Seahorse, jeśli nie przeprowadzono korekty proporcji zakwaszenia wywołanego przez oddychanie,38.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Nickowi Howe'owi (Agilent Technologies) oraz Thomasowi Nicolowi (Uniwersytet Oksfordzki) za ich wsparcie i krytyczną dyskusję podczas opracowywania tej metody. Chcielibyśmy podziękować personelowi naszego ośrodka zwierzęcego na poziomie 1 (Uniwersytet Oksfordzki, Jednostka Usług Biomedycznych) oraz w Instytucie Medycyny Rozwojowej i Regeneracyjnej (Uniwersytet Oksfordzki) za utrzymanie i przenoszenie danio danio. Prace te były wspierane przez Medical Research Council (MR/W006731/1 do KL), King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (stypendium podoktorskie w RA), Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z dla JSOM), British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 do LCH), European Research Council (ERC) w ramach programu badawczo-innowacyjnych Unii Europejskiej Horizon 2020 (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG do MTMM), granty projektowe British Heart Foundation (PG/15/111/31939 oraz PG/23/11189 dla MTMM), MTMM podziękuje wsparciu BHF Oxford Centre of Research Excellence, University of Oxford (RE/24/130024) oraz BHF Centre of Regenerative Medicine (RM/13/3/30159).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml tubek Eppendorf StarlabS1615-5550
96-dołkowa płyta ThermoFisherAB-0800
Antymycyna AChemCruz sc-202467A
Medium DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Suchy lód 
EtanolSupelco1.00983.2500
Zestaw do testów strumienia zewnątrzkomórkowego  Agilent103518-100Pakiet zawiera płytę użytkową, hydro booster, wkład czujnikowy, pokrywę (dołączona do płyt wyspy)
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlukozaAgilent103577-100
GlutaminaAgilent103579-100
Inkubator
Mikropłytka przechwytująca wysepkiAgilent101122-100W zestawie znajduje się 25 rotek
Narzędzie do przechwytywania ekranu wyspekAgilent101135-100
Kleszcze mikrosekcyjneideal-tek3131760Rozmiar 5-S (2x potrzebne będą do odizolowania komory od tęczy bulbus arteriosus i przedsionka)
nożyce do mikrosekcjiFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomicynaMP 151786
Mottor do homogenizatora tłuczka VWR431-0100
TłuczkiVWR431-0094
Szalka Petriego 35mmGreiner Bio-One627102
Szalka Petriego 92mmStarstedt82.1473
Zestaw do testów BCA PierceThermo Scientific23227
Mini tabletki inhibitorów proteazy i inhibitora fosfatazy, wolne od EDTAThermo ScientificA32961
PirowinianAgilent103578-100
Bufor lizy RIPASanta-CrusSC-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Interfaza Seahorse Analytics AgilentAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Analizator Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
UszczelniaczThermo ScientificAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
GąbkaWykonaj nacięcie na tyle długie i głębokie, by ryby dopasowało brzuszną stronę do góry
Wave (wersja 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
Kaliber XF Agilent100840-000

Bibliografia

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja serca rybiego zebrafishtest Seahorsemetabolizm oksydacyjnyglikolizaszybko zu ycia tlenuszybko zakwaszenia zewn trzkom rkowegoredyferencjacj kardiomiocyt wmetabolizm serca
Ocena aktywności metabolycznej całych regenerujących się komor danio pręgowanego ex vivo za pomocą testu strumienia zewnętrznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.