Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Podsumowanie

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę SCE w celu wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki Xenopus laevis.

Streszczenie

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. Wyraźną zaletą tej metody jest możliwość przeprowadzania manipulacji eksperymentalnych na pojedynczych komórkach przy jednoczesnym pozostawieniu otaczającej tkanki niezmienionej, co pozwala odróżnić efekty autonomiczne komórkowo od tych wynikających z zabiegów ogólnoustrojowych. W połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania in vivo, SCE markerów fluorescencyjnych pozwala na bezpośrednią wizualizację morfologii komórkowej, wzrostu komórek oraz zdarzeń wewnątrzkomórkowych w skalach czasowych od sekund do dni. Chociaż technika ta jest stosowana w różnych preparatach in vivo i ex vivo, zoptymalizowaliśmy ją pod kątem zastosowania u kijank *Xenopus laevis*. W tym artykule wideo szczegółowo opisujemy procedurę SCE barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki *Xenopus* albino. Omawiamy również metody optymalizacji wydajności oraz przedstawiamy przykłady obrazowania dwufotonowego fluorescencji żywych neuronów znakowanych fluorescencyjnie metodą SCE.

Protokół

Przygotowanie sprzętu:

1. Sprzęt elektryczny wymagany do wykonania tej techniki to stymulator, oscyloskop oraz uchwyt do mikropipety wyposażony w srebrny drut, który należy wprowadzić do mikropipety. Zazwyczaj używamy stymulatora Axoporator 800A firmy Axon Instruments, jednak inne popularne stymulatory, takie jak SD9 firmy Grass Instruments, są również odpowiednie do elektroporacji pojedynczych komórek. Stymulator jest połączony z przedwzmacniaczem (headstage), który łączy się z elektrodą z srebrnego drutu umieszczoną wewnątrz szklanej mikropipety zawierającej wewnętrzny roztwór przewodzący. Drugi przewód ze stymulatora jest podłączony do wejścia oscyloskopu, do którego doprowadzony jest również sygnał z zewnętrznej uziemionej elektrody w kijance. Zewnętrzne uziemienie kijanki to po prostu srebrny drut, który pozostaje w kontakcie elektrotonicznym z kijanką podczas elektroporacji. Obwód zostaje zamknięty w momencie zetknięcia mikropipety z kijanką.
   
   
2. Elektroporacja pojedynczych komórek wymaga mikroskopu o dobrej odległości roboczej (co najmniej 5 cm), ponieważ zapewnia to przestrzeń do manewrowania i pozwala na wprowadzenie mikropipety pod kątem około 30-45 stopni.

Wytwarzanie mikropipet:

Przygotowanie odpowiednich mikropipet jest krytycznym krokiem w tym protokole. Trudność polega na znalezieniu równowagi między wąską końcówką (o średnicy mniejszej niż 1μm) a taką, która nie złamie się łatwo podczas nakłuwania tkanki. Stwierdziliśmy również, że preferowane są końcówki o kącie zwężenia większym niż 10 stopni.

1. Przygotować szklaną mikropipetę wyciąganą o średnicy końcówki mniejszej niż 1μm i kącie zwężenia końcówki większym niż 10 stopni.
   1. Do tego celu odpowiednie jest szkło borokrzemianowe z wewnętrznym włóknem o średnicy zewnętrznej 1,5mm i średnicy wewnętrznej 0,75mm.
      1. Stosunkowo grube szkło zapewnia odpowiednią sztywność końcówki.
      2. Wewnętrzne włókno jest istotne dla wciągania fluidu wypełnionego od tyłu w kierunku końcówki mikropipety.
2. Wytwarzanie odpowiednich końcówek często wymaga kilku modyfikacji w zależności od zaobserwowanych wyników. Różne tkanki mogą wymagać końcówki o nieco innym kształcie lub średnicy.

Protokół elektroporacji pojedynczych komórek:

Nowym użytkownikom zaleca się rozpoczęcie pracy z fluorescencyjnymi barwnikami dekstranowymi, ponieważ w przeciwieństwie do genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, są one natychmiast widoczne w mikroskopii epifluorescencyjnej. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych pozwala użytkownikowi bezpośrednio dostrzec położenie końcówki mikropipety w tkance, a po przeprowadzeniu elektroporacji daje natychmiastową informację zwrotną dotyczącą prawidłowej konfiguracji sprzętu oraz odpowiedniości końcówki mikropipety.

1. Napełnij mikropipetę roztworem związku do elektroporacji, używając strzykawki ładującej lub metodą wypełniania wstecznego.
   1. W przypadku użycia plazmidowego DNA należy upewnić się, że próbki są wolne od endotoksyn i mają stężenie od 1-2µg/ml, przygotowane w wodzie.
   2. Stężenie fluorescencyjnych barwników dekstranowych należy określić empirycznie. Często stosujemy barwniki fluorescencyjne rozcieńczone w wodzie do stężenia około 300µM.
   3. Zazwyczaj wystarczające są objętości 0.5-1µl.
   4. Przed napełnieniem roztwory należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń cząsteczkowych zasysanych do mikropipety, co mogłoby prowadzić do jej zapchania.
   5. Pęcherzyki powietrza w końcówce często wpływają na przepływ prądu i powinny zostać usunięte poprzez energiczne potrząśnięcie mikropipetą przed zamontowaniem jej na głowicy.
2. Wsuń mikropipetę do uchwytu lub głowicy zamontowanej na 3-osiowym mikromanipulatorze. Upewnij się, że srebrna elektroda drutowa jest włożona do mikropipety i znajduje się w kontakcie elektrotonicznym z roztworem wewnętrznym.
3. Zanurz kijanki w 0.02% roztworze MS-222 (estru etylowego kwasu 3-aminobenzoenowego) przygotowanym w pożywce do hodowli kijanek (roztwór Steinberga, pH 7.4), aby je znieczulić.
   1. W naszych eksperymentach zazwyczaj używamy kijanek albinos Xenopus laevis w stadium 44-48.
   2. Kijanki są zazwyczaj całkowicie znieczulone po około 5 minutach.
   3. Aby skrócić czas oczekiwania, można znieczulić kilka kijanek jednocześnie, jednak należy unikać ekspozycji na MS-222 przez okres przekraczający 1 godzinę.
4. Przenieś pojedynczą znieczuloną kijankę do komory elektroporacyjnej za pomocą plastikowej mikropipety transferowej.
   1. Komorę elektroporacyjną można łatwo wykonać we własnym zakresie, wycinając otwór w kształcie kijanki w małym bloku silikonowym Sylgard® i wkładając do niego srebrny drut uziemiający w taki sposób, aby znajdował się on w kontakcie elektrotonicznym z kijanką w komorze.
5. Ustaw kijankę grzbietem do góry, używając zwilżonego pędzla.
6. Obniżaj mikropipetę, aż znajdzie się ona w kontakcie ze skórą, bezpośrednio przy obszarze zainteresowania.
   1. Celowanie w obszary o gęstym upakowaniu ciał komórkowych znacznie zwiększy szanse na udaną elektroporację. Zazwyczaj celujemy w tectum opticum kijanki.
   2. Wprowadzaj mikropipetę pod kątem od 30 do 45 stopni. Płytsze trajektorie utrudniają przebicie skóry, natomiast zbyt strome kąty często ograniczają widoczność.
7. Dalsze obniżanie mikropipety spowoduje początkowo wgłębienie skóry, a następnie przebicie do leżącej poniżej tkanki.
   1. Do obrazowania in vivo preferowane są komórki powierzchowne; można je wycelować, obniżając końcówkę mikropipety powoli w momencie wgłębienia skóry.
8. Należy stale monitorować oporność mikropipety po wprowadzeniu jej do tkanki. Przy użyciu Axoporatora 800A (Axon Instruments) optymalna oporność wynosi około 10-40MΩ. Oporność jest dobrym wskaźnikiem tego, czy średnica końcówki jest odpowiednia do elektroporacji pojedynczych komórek.
   1. Wysoka oporność mikropipety (>100MΩ) wskazuje na zapchanie końcówek lub mikropipety z końcówkami, które są zbyt wąskie.
   2. Niska oporność mikropipety (<10MΩ) wskazuje na zbyt dużą średnicę końcówki, co często jest wynikiem jej pęknięcia.
   3. W przypadku użycia stymulatora, który nie zapewnia bezpośredniego pomiaru oporności, można ją zmierzyć pośrednio, obserwując amplitudę impulsów napięcia na oscyloskopie (omówiono poniżej).
9. Zastosuj serię impulsów napięcia.
   1. W przypadku plazmidowego DNA najskuteczniejsze okazały się serie impulsów w postaci ujemnych fal prostokątnych o czasie trwania 1ms, dostarczanych z częstotliwością 300Hz przy całkowitym czasie trwania serii 500ms.
      1. Napięcie impulsu określa się empirycznie tak, aby amplituda impulsów mierzona na oscyloskopie wynosiła od 0.75 do 1.5μA.
   2. W przypadku fluorescencyjnych barwników dekstranowych stosuje się dodatnie impulsy fal prostokątnych o czasie trwania 300μs z częstotliwością 300Hz i całkowitym czasem trwania serii 10ms.
      1. Podobnie jak w protokole dla DNA, napięcie impulsu określa się empirycznie tak, aby amplituda impulsów mierzona na oscyloskopie wynosiła od 0.75 do 1.5μA.
      2. Dodatkowe korekty parametrów stymulacji można wprowadzić na podstawie obserwacji wyników elektroporacji w mikroskopie epifluorescencyjnym.
         1. Jeśli elektroporowane komórki wydają się ciemne, parametry impulsów należy stopniowo zwiększać, aż komórki staną się jaśniejsze.
         2. Z kolei jeśli znakowane są skupiska komórek, parametry impulsów należy zmniejszyć, aż do uzyskania znakowania pojedynczych komórek.
10. Wycofaj mikropipetę, wprowadź ją ponownie w inne miejsce w tkance i zastosuj serię impulsów napięcia.
    1. Aby zwiększyć wydajność, zazwyczaj przeprowadzamy elektroporację w wielu miejscach w każdej półkuli tectum opticum kijanki, zachowując odpowiednie odstępy, aby znakowane komórki na siebie nie nachodziły.
11. Przenieś elektroporowaną kijankę do pojemnika z roztworem hodowlanym Steinberga.
    1. Kijanki szybko wybudzą się z narkozy w ciągu kilku minut.
12. Tę samą mikropipetę można wykorzystać dla wielu kijanek. Ważne jest stałe monitorowanie amplitudy impulsów na oscyloskopie.
    1. Jeśli amplituda impulsu pozostaje niska po znacznym zwiększeniu intensywności impulsu, prawdopodobnie jest to wynik zapchania końcówki, co często zdarza się przy elektroporacji wielu kijanek w jednej sesji.
       1. Metodą udrażniania niewielkich zatorów w końcówce jest przyłożenie pojedynczego dodatniego impulsu po wprowadzeniu mikropipety do tkanki.
       2. Jeśli zatoru nie można usunąć lub zapchania powtarza się często, należy wymienić mikropipetę.
    2. Jeśli amplituda impulsu pozostaje bardzo wysoka po znacznym zmniejszeniu parametrów impulsu, jest to znak, że końcówka pękła i musi zostać wymieniona.

Przesiewanie komórek poddanych skutecznej elektroporacji:

1. Po elektroporacji kijanki są poddawane przesiewowi w celu wykrycia znakowanych komórek przy użyciu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.
2. W przypadku zastosowania barwników fluorescencyjnych, przesiew kijanek może być przeprowadzony już 30 minut po elektroporacji.
   1. Stwierdziliśmy jednak, że dłuższe odstępy czasowe wiążą się z niższym poziomem fluorescencji tła.
3. W przypadku genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, przesiew jest zazwyczaj przeprowadzany co najmniej 12 godzin po elektroporacji.
   1. Komórki ekspresjonujące białka fluorescencyjne będą z czasem stawać się jaśniejsze, dlatego komórki o słabej fluorescencji mogą zostać ponownie sprawdzone po dodatkowym odstępie 12-24 godzin.
4. Kijanki są znieczulane zgodnie z powyższym opisem, umieszczane w komorze Sylgard® i przykrywane szkiełkiem nakrywnym. Następnie poszczególne kijanki są badane pod kątem epifluorescencji.
   1. Należy pamiętać, że nadmierna ekspozycja na światło epifluorescencyjne spowoduje fototoksyczność, która może doprowadzić do śmierci znakowanej komórki. Należy zatem zminimalizować czas ekspozycji komórek na światło fluorescencyjne.
5. Kijanki należy przenieść z powrotem do naczynia z roztworem hodowlanym Steinberga.

Dyskusja

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) jest potężnym narzędziem służącym do określania funkcji genów oraz przeprowadzania celowanych manipulacji genetycznych. Przezroczystość kijanek albinotycznych oraz dostępność mózgu sprawiają, że ten model badawczy jest idealny do wizualizacji wzrostu neuronów i zdarzeń wewnątrzkomórkowych w żywym organizmie. SCE umożliwia wizualizację wzrostu pojedynczego neuronu oraz przeprowadzanie manipulacji autonomicznych komórkowo w mózgu, który w pozostałym zakresie pozostaje niezmieniony....