Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

822 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70582

⸱

28 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine/Advanced Institute for Brain and Intelligence, School of Medicine, Guangxi University, 2Brain Research Center and State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Third Military Medical University, 3Department of Neurology, Gansu Provincial Central Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Streszczenie

Uczenie się i pamięć zależą krytycznie od koordynacji między neuronami i astrocytami w różnych obszarach mózgu. Astrocyty modulują transmisję synaptyczną i pobudliwość neuronów, przyczyniając się tym samym do kodowania i konsolidacji informacji w obwodach związanych z pamięcią. Wewnątrz- i międzyregionalne korelacje między astrocytami a neuronami są kluczowe dla zrozumienia zaburzeń pamięci i poznawczych. Jednak jednoczesne monitorowanie aktywności astrocytów i neuronów w wielu regionach podczas zachowania związanego z pamięcią pozostaje technicznie wyzwaniem. Przedstawiono tu metodę, która umożliwia jednoczesne rejestrowanie tych sygnałów wapniowych od astrocytów i neuronów w kilku obszarach związanych z pamięcią. Ta strategia łączy komórkowo-specyficzne dwukolorowe, genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia (GECI), wielokanałowy system fotometrii światłowodowej i zsynchronizowane śledzenie zachowań, aby osiągnąć monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronowej i astrocytowej w środkowym przedczołowym korze (mPFC), obszarze CA1 hipokampu i środkowym korze zakrętu sklepieniowego (MEC). Wyniki reprezentatywne wykazują skoordynowane dynamiki wapnia między regionami i typami komórek podczas zadania rozpoznawania obiektów. Ta metoda zapewnia powtarzalny i wydajny eksperymentalny рамка dla badania interakcji astrocyt–neuron leżących u podstaw procesów uczenia się i pamięci.

Wprowadzenie

Uczenie się i pamięć to fundamentalne procesy poznawcze, które obejmują zdobywanie, przechowywanie i odzyskiwanie informacji, które są niezbędne do tworzenia adaptacyjnych zachowań. Procesy te leżą u podstaw wielu złożonych funkcji, takich jak nawigacja przestrzenna, rozpoznawanie obiektów, asocjacja kontekstowa i podejmowanie decyzji. Ponadto choroby dysfunkcji poznawczych, w tym choroba Alzheimera, choroba poznawcza związana z wiekiem i urazy mózgu, wykazują nieprawidłowości w tworzeniu pamięci1,2,3. Dlatego też, pełne zrozumienie podstawy neuronowej uczenia się i pamięci wymaga wyjaśnienia dynamicznej interakcji między różnymi typami komórek. Interakcja ta ma miejsce w obrębie i między tymi regionami podczas kodowania i odzyskiwania informacji.

Tradycyjnie uważano, że tworzenie pamięci jest przede wszystkim określone przez aktywność neuronów. Jednak rozległe badania wykazały, że komórki gleju znacząco regulują kodowanie, konsolidację i odzyskiwanie informacji. Osiągają to poprzez modulacje transmisji synaptycznej, regulację pobudliwości neuronów, uwalnianie gliotransmiterów i zapewnienie wsparcia metabolicznego4,5,6,7,8. Komórki gleju dynamicznie współdziałają z neuronami, a dwukierunkowa komunikacja jest na ogół nazywana "siecią komórek glejowych i neuronowych"9,10,11. Dlatego zrozumienie zsynchronizowanych interakcji między komórkami gleju a neuronami jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów komórkowych i sieciowych uczenia się i pamięci.

Uczenie się i pamięć opierają się na dynamicznej integracji informacji w wielu regionach mózgu. Interakcje między komórkami gleju a neuronami nie ograniczają się do lokalnych mikroobwodów, ale rozciągają się na rozproszone regiony mózgu zaangażowane w pamięć, w tym środkową korę przedczołową (mPFC), obszar CA1 hipokampu i środkową korę przedczołową (MEC). mPFC jest zaangażowana w konsolidację pamięci i regulację długotrwałej pamięci; CA1 jest kluczowe dla kodowania i reaktywacji pamięci epizodycznej; a MEC służy jako centrum integracji informacji przestrzennych i multimodalnych, dostarczając istotnych wejść do obwodu hipokampalno-korowego12,13,14,15,16. Rosnące dowody sugerują, że komórki gleju w tych regionach uczestniczą w zsynchronizowanych dynamicznych procesach między regionami wraz z neuronami, odgrywając kluczowe role w przepływie informacji i przejściach stanowych podczas uczenia się i zapamiętywania17,18.

Chociaż zwiększono rozpoznanie synergetycznej funkcji komórek gleju i neuronów w przetwarzaniu pamięci, nadal istnieje znaczny wyzwanie techniczne w jednoczesnym monitorowaniu aktywności wapniowej zarówno w komórkach gleju, jak i w neuronach w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią podczas zachowania wolno poruszających się zwierząt. Obrazowanie dwufotonowe oferuje wysoką rozdzielczość przestrzenną, ale jest ograniczone przez głębokość i fiksację głowy19,20; wielokanałowa elektrofizjologia umożliwia rejestrację z wysoką rozdzielczością czasową, ale brakuje specyficzności typu komórki i nie może rozróżnić sygnałów wapniowych komórek gleju. Dlatego opracowano metodę, która umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów wapniowych komórek gleju i neuronów w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią u myszy poruszających się swobodnie. Genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia (GECI) raportują dynamikę Ca2+ wewnątrzkomórkową poprzez Ca2+-zależne zmiany konformacyjne w CaM/M13, które modulują fluorescencje genetycznie zakodowanych fluoroforów. Dwukolorowe podejścia GECI wykorzystują spektralnie rozdzielne wskaźniki, takie jak zielone i czerwone czujniki wapnia, wraz z promotorami specyficznymi dla typu komórek, aby umożliwić jednoczesne rejestrowanie aktywności Ca2+ komórek gleju i neuronów w tej samej okolicy mózgu. Łącząc dwukolorowych wskaźników GECI specyficznych dla typu komórki (GCaMP6f i jRGECO1a) oraz wielokanałowy system fotometrii światłowodowej, osiągnięto monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności wapniowej w neuronach i komórkach gleju w mPFC, CA1 i MEC. Co więcej, biorąc jako przykład zadanie nowej rozpoznawalności obiektów (NOR), wykazano zsynchronizowaną dynamikę wapniową w różnych regionach mózgu i typach komórek podczas zadań uczenia się. Ta metoda jest rozmnażalnym, niezawodnym i skalowalnym protokołem do badania aktywności zespołów komórek glejowych i neuronowych w różnych regionach mózgu podczas uczenia się i zapamiętywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania Uniwersytetu Trzeciej Akademii Medycznej Wojskowej (Numer zgody etycznej na eksperymenty na zwierzętach: AMUWEC20230126) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Uniwersytetu Trzeciej Akademii Medycznej Wojskowej ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, aby zapewnić etyczne traktowanie zwierząt. Stosowany sprzęt i reagenty są wymienione w Tabeli Materiałów.

Aby zapewnić bezpieczeństwo eksperymentatora, wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem żywych zwierząt i wektorów wirusowych były wykonywane przy użyciu odzieży ochronnej, sterylnych rękawic i maseczki. Wszystkie instrumenty były dokładnie sterylizowane przed użyciem, a powierzchnie eksperymentalne były czyszczone 70% etanolem przed i po każdym eksperymencie. Pozostałe materiały były usuwane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów. Wszystkie reagenty i sprzęt były obsługiwane tak, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą lub oczami.

1. Przygotowanie zwierząt i manipulacja wirusami

  1. Hodowla 4-miesięcznych myszy C57BL/6 (obu płci) w cyklu 12 h światło/ciemność z ad libitum dostępem do pokarmu i wody.
  2. Roztapianie alikwotów AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f lub AAV9-hSyn-jRGECO1a na lodzie w temperaturze 0–4 °C bezpośrednio przed użyciem.
  3. Podłączenie ściągniętej szklanej mikropipety (średnica końcówki 15–25 μm) do strzykawki i zamontowanie jej na pompie mikroiniekcyjnej.
  4. Umieszczenie myszy na sterylnej platformie chirurgicznej i dezynfekcja wszystkich instrumentów 70% etanolem.

2. Sterylotaktyczne wstrzyknięcie wirusa

UWAGA: W tym badaniu zastosowano dwuetapową strategię wstrzyknięcia wirusa. W obecnych warunkach eksperymentalnych strategia ta może być niezawodnie i stabilnie wdrożona, a wynikający wzorzec ekspresji jest zgodny z oczekiwanym profilem promotora specyficznego dla typu komórek.

  1. Pierwsze zabieganie chirurgiczne: Wstrzyknięcie AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f (Tytuł: 7 × 1012 vg/mL) dla astrocytów
    1. Wprowadzenie znieczulenia za pomocą 3% izofluranu w komorze, a następnie utrzymanie znieczulenia za pomocą 0,8–1,2% izofluranu przez nos (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    2. Utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37–38 °C za pomocą podgrzewanego podkładu i zastosowanie maści okulistycznej w celu zapobiegnięcia wysychaniu rogówki.
    3. Usunięcie włosów ze skóry głowy i dokładne zdezynfekowanie skóry. Wykonanie nacięcia środkowego, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
    4. Umieszczenie głowy w sterylotaktycznym instrumencie, dostosowanie szwu bregma i lambda do tej samej płaszczyzny poziomej, a następnie dalsze dostosowanie ramy, aby upewnić się, że punkty 2 mm bocznie od bregma po obu stronach są na jednej wysokości.
    5. Identyfikacja współrzędnych stereotaktycznych za pomocą atlasu mózgu myszy, przy czym bregma jest punktem odniesienia.
      mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV –3,0 mm
      CA1: AP –2,1 mm, ML +1,6 mm, DV –1,2 mm
      MEC: AP –4,5 mm, ML –2,9 mm, DV –2,0 mm
    6. Wykonanie otworu w czaszce o średnicy 0,6 mm powyżej każdego miejsca, utrzymanie otoczenia rdzeniowego wilgotne i nienaruszone po otwarciu czaszki.
    7. Wypełnienie wirusa GCaMP6f do strzykawki z prędkością 5 nL/s i zainstalowanie strzykawki w ramieniu stereotaktycznym.
    8. Powolne obniżanie pipety, wstrzyknięcie 150 nL z prędkością 0,6 nL/s, utrzymanie przez 8 min, a następnie wycofanie z prędkością 0,1 mm/s. Powtórzenie tej procedury dla wszystkich regionów.
    9. Zamknięcie nacięcia klejem tkankowym i pozostawienie na 2 tygodnie w celu wystąpienia ekspresji wirusa.
  2. Drugie zabieganie chirurgiczne: Wstrzyknięcie AAV9-hSyn-jRGECO1a (Tytuł: 1 × 1013 vg/mL) dla neuronów.
    ​UWAGA: Zabieg przeprowadzono 14 dni po pierwszym wstrzyknięciu wirusa.
    1. Wprowadzenie i utrzymanie znieczulenia zgodnie z opisem powyżej (Krok 2.1.1).
    2. Utrzymanie temperatury ciała i ochrona oczu.
    3. Ponowne otwarcie skóry głowy wzdłuż linii środkowej i wyrównanie czaszki.
      UWAGA: Czaszka została wyrówniana przez wyrównanie bregma i lambda na tej samej płaszczyźnie poziomej.
    4. Oczyszczenie gruzu tkankowego w tych samych miejscach, w których znajdowały się otwory w czaszce z pierwszego zabiegu, aby odsłonić otoczony rdzeniowym otoczeniami.
      5. <

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na podstawie opisanej powyżej procedury, wykonano podwójne wielo-stanowiskowe rejestrowanie włókien u myszy C57 w wieku 4 miesięcy, skierowane na mPFC, CA1 i MEC. W niniejszym badaniu zastosowaliśmy dwuetapową strategię wstrzyknięć wirusowych w celu sekwencyjnego wprowadzenia dwóch wskaźników. W naszych warunkach eksperymentalnych, ta strategia może być niezawodnie i stabilnie wdrożona, a wynikający wzorzec ekspresji jest zgodny z oczekiwanym profilem promotora specyficznego dla typu komórki.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej pracy opracowano metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności wapniowej komórek astrocytowych i neuronów w wielu obszarach mózgu myszy związanych z pamięcią podczas nauki i zachowań związanych z pamięcią. W odróżnieniu od pojedynczej rejestracji obrazowej regionu28 lub technik elektrofizjologicznych, synchroniczna rejestracja wielo-regionalna rejestruje skoordynowane dynamiki w rozproszonych sieciach pamięci, co czyni ją potężnym narzędziem do badania nauki i pamięci9

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych sporów interesów, finansowych lub innego rodzaju.

Podziękowania

Pani Jia Lou jest wymieniana za wsparcie techniczne, a Sai Te Xin Si (narzędzie AI) jest wymieniana za pomoc w redagowaniu językowym. Ta praca otrzymała wsparcie od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82371485, 82588301, 32400932) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing w Chinach (grant nr CSTB2024NSCQ-JQX0024, 2024NSCQ-MSX1104).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
75 RN 5uL SYR W/O NEEDLEHamilton7634-01Łączy się z mikropipetą do iniekcji wirusowej
AAV5-GfaABC1D-GCaMP6fAddgene52925Astrocytospecyficzna ekspresja GCaMP6f
AAV9-hSyn-NES-jRGECO1aAddgene100854Neuronowy czerwono przesunięty wskaźnik wapnia
Bepanthen Eye and Nasal OintmentBepanthenMA0008Zapobiega wysychaniu rogówki
Bundled optical fibers with ceramic sleevesInperBFO-1x3-W1.25Łączy zaimplantowane włókna z systemem fotometrii
CameraMind VisionMV-SUA502C-TWideo zachowań zsynchronizowane z sygnałami wapniowymi
Dental cementNISSINSuper-Bond C&BUżywany do zamocowania tulejek do czaszki
Ferrule holderInperSCH-1.25Przytrzymywanie ceramicznej tulejki bezpiecznie podczas implantacji
Isoflurane vaporizer & Anesthesia systemRWD Life ScienceR510-29Do indukcji i podtrzymiwania znieczulenia
Multi-channel fiber photometry systemRWD Life ScienceR821Do dwukolorowego nagrywania
OFRS softwareRWD Life ScienceAnaliza nagranych sygnałów wapniowych
Optical fibersRWD Life ScienceR-FOC-BL200C-39NZaimplantowane w docelowej części mózgu
Stereotaxic instrumentRWD Life Science68801Używany do precyzyjnej iniekcji wirusowej i implantacji włókien
Syringe pumpKD Scientific788130Dostarcza wirusa w kontrolowanych szybkościach
Tissue glue3M Animal Care Products1469SB VetbondDo zamknięcia nacięć

Bibliografia

  1. Eichenbaum, H. Memory: Organization and Control. Annu Rev Psychol. 68, 19-45 (2017).
  2. Kamatham, P. T., Shukla, R., Khatri, D. K., Vora, L. K. Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics for Alzheimer’s disease: Breaking the memory barrier. Ageing Res Rev. 101, 102481(2024).
  3. Graff-Radford, J., et al. New insights into atypical Alzheimer’s disease in the era of biomarkers. Lancet Neurol. 20 (3), 222-234 (2021).
  4. Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
  5. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  6. Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat Neurosci. 14 (10), 1276-1284 (2011).
  7. Savtchouk, I., Volterra, A. Gliotransmission: Beyond Black-and-White. J Neurosci. 38 (1), 14-25 (2018).
  8. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: Astrocytes process and control synaptic information. Trends Neurosci. 32 (8), 421-431 (2009).
  9. Wang, H., et al. Mapping multi-regional functional connectivity of astrocyte-neuronal networks during behaviors. Neurophotonics. 11 (4), 045010(2024).
  10. Lines, J., Martin, E. D., Kofuji, P., Aguilar, J., Araque, A. Astrocytes modulate sensory-evoked neuronal network activity. Nat Commun. 11 (1), 3689(2020).
  11. Lines, J., et al. Astrocyte-neuronal network interplay is disrupted in Alzheimer’s disease mice. Glia. 70 (2), 368-378 (2022).
  12. Brincat, S. L., Miller, E. K. Frequency-specific hippocampal-prefrontal interactions during associative learning. Nat Neurosci. 18 (4), 576-581 (2015).
  13. DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nat Neurosci. 22 (3), 460-469 (2019).
  14. Kitamura, T., et al. Engrams and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356 (6333), 73-78 (2017).
  15. Gonzalo Cogno, S., et al. Minute-scale oscillatory sequences in medial entorhinal cortex. Nature. 625 (7994), 338-344 (2024).
  16. Roudi, Y., Moser, E. I. Grid cells in an inhibitory network. Nat Neurosci. 17 (5), 639-641 (2014).
  17. Williamson, M. R., et al. Learning-associated astrocyte ensembles regulate memory recall. Nature. 637 (8045), 478-486 (2025).
  18. Curreli, S., Bonato, J., Romanzi, S., Panzeri, S., Fellin, T. Complementary encoding of spatial information in hippocampal astrocytes. PLoS Biol. 20 (3), e3001530(2022).
  19. Oheim, M., Michael, D. J., Geisbauer, M., Madsen, D., Chow, R. H. Principles of two-photon excitation fluorescence microscopy and other nonlinear imaging approaches. Adv Drug Deliv Rev. 58 (7), 788-808 (2006).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Zhang, K., Chen, X. Sensory response in host and engrafted astrocytes of adult brain in vivo. Glia. 65 (12), 1867-1884 (2017).
  22. Qin, H., et al. A visual-cue-dependent memory circuit for place navigation. Neuron. 99 (1), 47-55.e44 (2018).
  23. Yao, J., et al. A corticopontine circuit for initiation of urination. Nat Neurosci. 21 (11), 1541-1550 (2018).
  24. Mirzayi, P., Shobeiri, P., Kalantari, A., Perry, G., Rezaei, N. Optogenetics: Implications for Alzheimer’s disease research and therapy. Mol Brain. 15 (1), 20(2022).
  25. Simpson, E. H., et al. Lights, fiber, action! A primer on in vivo fiber photometry. Neuron. 112 (5), 718-739 (2024).
  26. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  27. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727(2016).
  28. Serikov, A., Martsishevska, I., Shin, W., Kim, J. Protocol for in vivo dual-color fiber photometry in the mouse thalamus. STAR Protoc. 5 (2), 102931(2024).
  29. Gilbert, C. D. Horizontal integration and cortical dynamics. Neuron. 9 (1), 1-13 (1992).
  30. de Pasquale, F., Corbetta, M., Betti, V., Della Penna, S. Cortical cores in network dynamics. Neuroimage. 180 (Pt B), 370-382 (2018).
  31. Suthard, R. L., et al. Engram reactivation mimics cellular signatures of fear. Cell Rep. 44 (10), 116409(2025).
  32. Sandoval, K. C., Rychlik, J., Choe, K. Y. Calcium dynamics in hypothalamic paraventricular oxytocin neurons and astrocytes associated with social and stress stimuli. eNeuro. 12 (5), (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
  34. Spellman, T., et al. Hippocampal-prefrontal input supports spatial encoding in working memory. Nature. 522 (7556), 309-314 (2015).
  35. Hu, W., et al. Optogenetics sheds new light on tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 227, 119546(2020).
  36. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  37. Shah, D., et al. Astrocyte calcium dysfunction causes early network hyperactivity in Alzheimer’s disease. Cell Rep. 40 (8), 111280(2022).
  38. Jiménez-Balado, J., Eich, T. S. GABAergic dysfunction, neural network hyperactivity and memory impairments in human aging and Alzheimer’s disease. Semin Cell Dev Biol. 116, 146-159 (2021).
  39. Lin, R., Guo, Y., Jiang, W., Wang, Y. Advanced technologies for the study of neuronal cross-organ regulation: a narrative review. Adv Technol Neurosci. 1 (2), 166-176 (2024).
  40. Reitman, M. E., et al. Norepinephrine links astrocytic activity to regulation of cortical state. Nat Neurosci. 26 (4), 579-593 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Fotometria dwukolorowaobrazowanie wapniagenetycznie kodowane wskaźnikiprzyśrodkowa kora przedczołowaobszar CA1 hipokampaprzyśrodkowa kora entorynalnamonitorowanie behawioralne
Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.