Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Podsumowanie

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną funkcją jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przeciwko wnikaniu mikroorganizmów patogennych. W tym filmie prezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki forward i reverse.

Streszczenie

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną rolą jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przed wnikaniem mikroorganizmów patogennych. Kutykula składa się z wytrzymałego polimeru sieciowanego, nazywanego kutyną, oraz ochronnej warstwy wosku, która uszczelnia powierzchnię rośliny. Woskowa warstwa kutykuli jest wyraźnie widoczna u wielu roślin, przejawiając się jako błyszcząca błona na liściu bluszczu lub jako matowa zewnętrzna powłoka na powierzchni winogrona bądź liścia kapusty, co jest wynikiem obecności kryształów rozpraszających światło w wosku. Ponieważ kutykula jest kluczową adaptacją roślin do środowiska lądowego, zrozumienie genów zaangażowanych w jej tworzenie ma zastosowanie zarówno w rolnictwie, jak i w leśnictwie. Dzisiaj zaprezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki typu forward oraz reverse.

Protokół

I. Przesiewy wizualne i podejścia genetyki odwrotnej w celu identyfikacji mutantów kutykuli.

Mutanty kutykuli u rośliny modelowej Arabidopsis thaliana nazywane są mutantami „eceriferum”, co oznacza „nieprodukujące wosku”. Można je zidentyfikować w badaniach wizualnych, co oznacza, że już na podstawie wyglądu mutanta można zauważyć, że łodyga kwiatostanu roślin typu dzikiego jest biaława, podczas gdy mutanty mają ciemnozielone, błyszczące łodygi.  Jednym z mutantów wyizolowanych w tego typu badaniach wizualnych jest mutant zwany eceriferum4 lub cer4. 

Innym sposobem odkrywania interesujących mutantów kutykuli jest podejście genetyki odwrotnej: wybór genów kandydackich, a następnie badanie linii roślin z przerwanym działaniem tych genów. Mutanty te posiadają TDNA przerywające gen docelowy, w tym przypadku cytochrom P450, który obecnie nazywamy MAH1.

Wyniki PCR (takie jak pokazane na filmie) mogą potwierdzić, że insercja TDNA znajduje się w genie docelowym. Gdy do amplifikacji DNA typu dzikiego używa się dwóch starterów specyficznych dla genu, otrzymujemy produkt, ale jeśli TDNA go przerywa, jak w przypadku tego mutanta, produkt nie powstaje.  I odwrotnie, przy użyciu starterów specyficznych dla TDNA i genu, produkt jest widoczny tylko u mutanta. Poszukujemy homozygotycznych linii mutantów, w których obie kopie genu — macierzysta i ojcowskia — są przerwane. Jeśli jedna kopia genu jest przerwana przez TDNA, a druga kopia jest wciąż typu dzikiego, wyniki PCR są mieszane.

II.  Wykorzystanie chromatografii gazowej do oznaczenia składu chemicznego wosku kutykularnego. 

Analizujemy skład chemiczny wosku za pomocą chromatografii gazowej. W pierwszej kolejności rozpuszczalne związki wosku są usuwane z powierzchni rośliny poprzez zanurzenie jej w chloroformie.

Następnie próbki są wstrzykiwane do kolumny chromatograficznej, gdzie są podgrzewane i transportowane w strumieniu gazu. Różne związki w różnym stopniu przylegają do ścianek kolumny, co prowadzi do ich rozdzielenia, w wyniku czego opuszczają one kolumnę jeden po drugim. Kiedy związki przechodzą przez detektor jonizacji płomieniowej, rejestrowane są piki. Czas retencji każdego piku jest charakterystyczny dla poszczególnych związków, a dzięki spektrometrii mas zidentyfikowano każdy z komponentów wosku Arabidopsis. Główne piki odpowiadają alkanowi C29, ketonowi C29 oraz wtórnemu alkoholowi C29. Mniejsze piki to alkohole wtórne, kwasy tłuszczowe, aldehydy i estry. Pole pod pikami, w odniesieniu do standardu, informuje o ilości każdego z obecnych związków.

Analizując chromatogramy gazowe mutantów kutykuli, można zauważyć, że w linii cer4 brakuje alkoholi pierwszorzędowych i estrów, natomiast w mah1 brakuje alkoholi wtórnych i ketonów. Fenotypy te mogą dostarczyć wielu informacji na temat funkcji badanego genu w roślinie. Na przykład, zanim zidentyfikowano gen zmutowany w linii cer4, fenotyp wskazywał na problem w odgałęzieniu biosyntezy alkoholi pierwszorzędowych. Po zbadaniu tożsamości molekularnej tego genu w laboratorium Kunst odkryto, że należy on do rodziny genów reduktaz acyloacylu, co jest spójne z tym fenotypem chemicznym.

III. Wykorzystanie Cryo-SEM do oznaczenia struktury kryształów kutykuli

Podczas badania mutantów kutykuli Arabidopsis możemy zaobserwować, czy wykazują one ciemnozielony, błyszczący fenotyp, czy też typowy dla typu dzikiego białawy wygląd łodygi. Używamy skaningowego mikroskopu elektronowego, aby zbadać kutykulę na powierzchni rośliny i zidentyfikować podstawę wizualnego fenotypu. Stosujemy cryo-SEM, zamrażając rośliny i obserwując je w temperaturze ciekłego azotu, aby zachować nienaruszoną kutykulę, ponieważ SEM wymaga do pracy próżni, a bez zamrożenia próbki uległyby wysuszeniu i zapadnięciu.

Tutaj próbki cer4 i mah1, wraz z kontrolami typu dzikiego, są preparowane i zamrażane na stubie do SEM. Po przeniesieniu próbek na chłodny stolik mikroskopu widać, że powierzchnia kutykuli łodygi Arabidopsis typu dzikiego jest pokryta kryształkami. To właśnie światło rozproszone na tych kryształkach nadaje łodydze białawy wygląd. Oto łodyga cer4; pamiętacie, że wyglądała na błyszczącą? Brakuje na niej kryształków na powierzchni.

Przeprowadzano eksperymenty, w których izolowano czysty związek woskowy z kutykuli rośliny, a po jego rekrystalizacji w laboratorium kryształy przybierały te same kształty, co te znalezione na roślinach. W przypadku Arabidopsis uważamy, że kryształy składają się z mieszaniny związków i sytuacja jest bardziej skomplikowana.  Na przykład analiza chemiczna wykazuje, że w cer4 brakuje jedynie mniejszego składnika w postaci alkoholi pierwszorzędowych i ich estrowych pochodnych, a mimo to kryształki na łodydze cer4 zniknęły. W przypadku mah1 efektem mutacji w tym enzymie cytochromu P450 jest brak dwóch głównych składników wosku w roślinach mutantach – alkoholi wtórnych i ketonów – jednak kryształki na roślinach mah1 tworzą się prawidłowo.

Aby dowiedzieć się więcej o mutantach kutykuli Arabidopsis, prosimy odwiedzić stronę Annual Review of Plant Biology.