Artykuł metodologiczny

Strategie obrazowania dla interwencji akupunktury u modelowych myszy chorob Alzheimera

176 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70998

⸱

21 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje strategię in vivo mikro-PET połączoną z testami behawioralnymi i molekularnymi, aby dynamicznie oceniać wpływ elektroakupunktury na odkładanie β-amyloidu oraz funkcje poznawcze w modelu myszy z chorobą Alzheimera.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) to choroba neurodegeneracyjna, przede wszystkim charakteryzująca się postępującą dysfunkcją poznawczą. Jedną z typowych cech patologicznych jest tworzenie blaszek stróżnych w mózgu w wyniku odkładania białek β-amyloidowych (Aβ). Akupunktura wykazała potencjał w praktyce klinicznej w poprawie funkcji poznawczych u pacjentów z chorobą Alzheimera. Jednak jej dynamiczne działanie na patologię Aβ wymaga obiektywnego wyjaśnienia za pomocą nowoczesnych metod technologicznych. Mikropozytonowa tomografia emisyjna (micro-PET) stanowi potężne narzędzie do in vivo, nieinwazyjnej obserwacji osadzania Aβ w mózgach modelowych myszy z AD. W tym protokole szczegółowo przedstawiamy strategię obrazowania wykorzystującą mikro-PET [18F]AV-45 do oceny efektów interwencji elektroakupunktury, uzupełnioną o testy behawioralne Morris Water Maze oraz molekularną analizę Western blot. Zintegrowane podejście umożliwia wizualizację i ilościową progresję patologiczną Aβ w mózgach modelowych myszy z AD. Dostarcza to obiektywnych i ilościowych dowodów do zbadania wpływu regulacyjnego akupunktury na depozycji Aβ. Poprzez integrację tradycyjnych zasad medycyny chińskiej z nowoczesnymi technologiami obrazowania molekularnego i biologii molekularnej.

Wprowadzenie

Monitorowanie in vivo depozycji β-amyloidu (Aβ) w mózgu jest kluczowe dla oceny patologicznego postępuAD 1. Po klinicznym zastosowaniu terapii przeciwciałami ukierunkowanych na Aβ (np. Lecanemab), podłużna i ilościowa ocena obciążenia Aβ w mózgu za pomocą PET stała się złotym standardem do określania skuteczności terapeutycznej2. Chociaż akupunktura wykazała potencjał w badaniach przedklinicznych w zakresie modulacji metabolizmu Aβ, tradycyjne podejścia badawcze opierały się głównie na analizach ex vivo, nie mając skutecznych narzędzi do bezpośredniej i obiektywnej oceny jej dynamicznego wpływu na depozycję Aβ w organizmach żywych. W ostatnich latach postęp w technologiach obrazowania molekularnego stworzył możliwości wypełnienia tej luki. mikro-PET umożliwił nieinwazyjną, podłużną obserwację osadzania Aβ u myszy modelowychAD 1. Co ważniejsze, nowe strategie obrazowania ewoluują od podejść jednocelowych w kierunku paradygmatów multimodalnych. Na przykład badania potwierdziły, że różne podtypy strukturalne włókien Aβ wykazują różne powinowactwa wiązania do powszechnie stosowanych znaczników PET, co rodzi nowe zapotrzebowanie na precyzyjną ilościową ilościowość3. Równocześnie pojawiające się techniki, takie jak obrazowanie neuroimmunologiczne (np. TSPO PET) oraz oceny funkcji bariery krew-mózg, oferują bezprecedensowe perspektywy w kompleksowym wyjaśnieniu złożonych mechanizmów patologicznych AD oraz wielocelowych efektów interwencji terapeutycznych4.

Na podstawie tych podstaw celem niniejszego badania mają na celu opracowanie zaawansowanej strategii obrazowania mikro-PET, wykorzystującej najnowsze sondy specyficzne dla Aβ, aby dynamicznie i ilościowo ocenić wpływ interwencji akupunktury na depozycję Aβ w mózgach myszy modelowych z AD in vivo. Badanie nie tylko potwierdzi skuteczność terapeutyczną akupunktury, ale także dostarczy bezpośrednich dowodów na jej mechanizmy na poziomie obrazowania molekularnego.

Protokół

Przeprowadzać wszystkie eksperymenty zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wydanymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyki Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (nr bucm-4-2021102707-5421).

1. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych

  1. Zdobądź 6-miesięczne męskie myszy APP/PS1 oraz dopasowane do wieku i płci C57BL/6 myszy ważące 28,0 ± 2,0 g.
  2. Myszy trzymaj w standardowych klatkach w temperaturze pokojowej 24 ± 2 °C i wilgotności 40%–60%.
    UWAGA: Zwierzęta były przechowywane w standardowych klatkach w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie, Capital Medical University.
  3. Trzymaj zwierzęta w standardowym, 12-godzinnym cyklu światła/ciemności (okres ciemności: 20:00–8:00) z darmowym dostępem do jedzenia i wody. Codziennie zmieniaj pościel, aby zapewnić czyste i suche warunki w domu.
  4. Przyzwyczaj zwierzęta do środowiska laboratoryjnego przez 7 dni. Rozpocznij eksperymenty ósmego dnia po aklimatyzacji.

2. Grupowanie zwierząt i interwencje

  1. Losowo przypisz dwudziestu 6-miesięcznych samców myszy APP/PS1 do grupy modelowej choroby Alzheimera (grupa AD, n = 10) oraz grupy elektroakupunktury (grupa EA, n = 10). Przypisz dziesięć myszy C57BL/6N dopasowanych do wieku i płci do normalnej grupy kontrolnej (grupa N, n = 10).
  2. Zidentyfikuj trzy punkty akupunktowe na głowie przeznaczone do interwencji: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) i GV29 (Yintang).
    UWAGA: Lokalizacja punktów akupunkturowych opiera się na "Atlasie Akupunktury Akupunktury Zwierząt" opracowanym przez Eksperymentalne Towarzystwo Badań Akupunktury Chińskiego Stowarzyszenia Akupunktury i Moksyzbuzi. GV20 znajduje się w środku między końcówkami obu uszu; GV29 znajduje się w środku między przyśrodkowymi końcami brwi; a GV26 znajduje się poniżej przegrody nosowej myszy, na styku dolnych dwóch trzecich i górnej jednej trzeciej linii środkowej szczeliny. Schemat przedstawiony jest na Rysunku 1.
  3. Podawaj elektroakupunkturę grupie EA raz dziennie przez 20 minut przez 15 kolejnych dni.
    1. Zabezpiecz mysz pewnie identycznymi, specjalnie zaprojektowanymi materiałowymi rękawami zabezpieczającymi. Upewnij się, że ciało jest wygodnie owinięte, a główka pozostaje całkowicie odsłonięta, co pozwala na dokładne włożenie igły i normalne oddychanie.
    2. Przygotuj jednorazowe sterylne igły akupunktury (0,25 mm × 13 mm).
    3. Zastosowanie szybkiej metody nakłucia (szybkie włożenie i natychmiastowe wyciągnięcie bez zatrzymania) do punktu akupunkturowego GV26 (Shuigou) za pomocą sterylnej igły akupunkturowej.
    4. Połącz uchwyty igieł w GV20 i GV29 z klipsami wyjściowymi elektronicznego aparatu elektroakupunkturowego.
    5. Ustaw parametry stymulacji na urządzeniu tak, aby dostarczały ciągłą rzadką falę o częstotliwości 2 Hz, stałym napięciu 2 V i natężeniu prądu 0,1 mA.
    6. Obserwuj mysz uważnie i upewnij się, że intensywność stymulacji wywołuje łagodne, rytmiczne drżenie głowy myszy.
  4. Utrzymuj myszy w grupach N i AD w identycznych warunkach mieszkalnych bez żadnej ingerencji. Poddać grupy N i AD tym samym codziennym procedurom obsługi i unieruchomienia co grupę EA przez cały okres 15 dni, aby zapewnić spójność warunków eksperymentalnych.

3. Test labiryntu wodnego Morrisa (MWM)

UWAGA: Ramy behawioralne (Morris Water Maze) opierają się na naszej wcześniejszej pracy5.

  1. Przygotowanie aparatury
    1. W pomieszczeniu testowym umieść okrągły zbiornik na wodę (90 cm średnicy, 50 cm głębokości). Napełnij zbiornik wodą (22 ± 2 °C) na głębokość 30 cm.
    2. Dodaj 0,5 kg odtłuszczonego mleka w proszku do wody, aby uczynić ją nieprzezroczystą. Praktycznie podziel czołg na cztery równe ćwiartki (I, II, III i IV).
    3. Umieść platformę ratunkową (okrągłą, 5 cm średnicy i 28 cm wysokości) w centrum kwadrantu I.
    4. Umieść wyraźne wizualne wskazówki o różnych kształtach na wewnętrznej ścianie każdego kwadrantu, aby pomóc myszy nauczyć się i zapamiętać położenie platformy.
    5. Zamontuj kamerę cyfrową 2 m nad środkiem zbiornika na suficie i podłącz ją do systemu do akwizycji obrazu6.
  2. Habituacja
    1. Usuń platformę z akwarium dzień przed testem ukrytej platformy. Pozwól myszy swobodnie pływać w akwarium przez 90 sekund rano i po południu, aby przyzwyczaić się do środowiska eksperymentalnego.
  3. Test ukrytej platformy
    1. Przeprowadź test ukrytej platformy przez pięć kolejnych dni.
    2. Wybierz punkty startowe odpowiednio z drugiego, trzeciego i czwartego kwadrantu, dbając o to, by każdy punkt startowy był w równej odległości od środka zbiornika.
    3. Umieść mysz w wodzie, twarzą do ściany akwarium. Pozwól myszy obserwować otoczenie przez 10 sekund po wejściu do wody.
    4. Zapisz opóźnienie ucieczki i ścieżkę pływania, jeśli mysz zlokalizuje ukrytą platformę i pozostaje na niej przez 5 sekund w granicach 60 sekund. Jeśli nie znajdzie platformy w ciągu 60 sekund, ręcznie poprowadź mysz na platformę.
    5. Pozwól zwierzęciu pozostać na platformie przez 10 sekund, aby obserwować i zapamiętać lokalizację, a opóźnienie ucieczki wynosiło 60 sekund.
  4. Test sondy przestrzennej
    1. Usuń ukrytą platformę z czołgu po pięciu kolejnych dniach szkolenia z ukrytą platformą.
    2. Umieść każdą mysz w wodzie z jednego z punktów startowych znajdujących się w drugim, trzecim lub czwartym kwadrancie. Pozwól myszy swobodnie pływać przez 60 sekund. Zapisz trasę pływania oraz czas spędzony w docelowym kwadrancie (kwadrant I).
    3. Wszystkie myszy natychmiast odłóż do domowych klatek między próbami, aby zminimalizować bezpośredni kontakt z eksperymentatorem.

4. Analiza zachodnich plam

  1. Uśpić sześć myszy na grupę 24 godziny po zakończeniu 15-dniowej interwencji. Szybko rozczłonkowaj i izoluj świeże tkanki hipokampa na lodzie.
  2. Zważ tkanki hipokampa i umieść je w schłodzonych mikrowirówkach. Dodaj zimny bufor lizy RIPA z dodatkiem 1% koktajlu inhibitorów proteazy oraz 1% koktajlu inhibitorów fosfatazy w proporcji 10 μL buforu na 1 mg tkanki.
  3. Dokładnie ujednolic tkanki za pomocą mechanicznego homogenizatora tkanek na lodzie. Wiruj w wirówce, a następnie homogenizuje się w 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Ostrożnie zbieraj supernatant i przelewaj go do nowej, wcześniej schłodzonej rurki mikrowirówki.
  4. Wymieszaj próbki białka z buforem ładunkowym 5× SDS i gotuj mieszankę w 95 °C przez 10 minut, aby całkowicie zdenaturować białka. Na żel SDS-PAGE o wartości 15% należy załadować równe ilości białka (20 μg) na dołek. Umieść wstępnie barwiony marker masy cząsteczkowej białka w jednym z sąsiednich dołków.
  5. Uruchom żel układający przy stałym napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie rozpuszczaj białka w żelu rozdzielającym przy 120 V, aż czoło bromofenolowego niebieskiego barwnika dotrze do dna żelu.
  6. Przenieś rozdzielone białka na membranę z poliwinylydenu (PVDF) o pojemności 0,22 μm przy stałym prądzie 250 mA przez 90 minut na lodzie. Blokuj membranę PVDF 5% beztłuszczowym mlekiem odtłuszczonym rozpuszczonym w soli fizjologicznej z buforem Tris zawierającym 0,1% Tween 20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze.
  7. Inkubuj błonę z pierwotnym przeciwciałem przeciwko Aβ (rozcieńczonym [1:1000] w buforze blokującym) oraz pierwotnym przeciwciałem przeciwko GAPDH (rozcieńczonym [1:5000] w buforze blokującym) przez noc w temperaturze 4 °C na poziomym shakerze. Inkubuj błonę przeciwciałem wtórnym sprzężonym z nadoksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczonym [1:2000] w buforze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyj błonę trzy razy metodą TBST przez 10 minut każdy, aby usunąć niezwiązane przeciwciała wtórne.
  9. Zastosować podłoże o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) na membranę i przechwycić sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.
  10. Ilościowo określ intensywność pasma białek za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.53a). Normalizuj wartości w skali szarości docelowych pasm do wartości GAPDH i obliczaj względne poziomy ekspresji interesujących nas białek.

5. [18F]AV-45 radiosynteza

  1. Wykonaj radioznakowanie poprzez nukleofilową podstawienie 3,0 mg związku prekursorowego z [18F]KF.
  2. Oczyszcz produkt za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC), aby uzyskać radiochemiczną czystość (RCP) powyżej 95%.
  3. Rozpuść oznaczony związek w etanolu.
  4. Rozcieńcz roztwór 0,9% chlorku sodu i przygotuj produkt końcowy w 10% etanolu do dalszego użycia7.

6. Obrazowanie PET in vivo

  1. Wybierz losowo cztery myszy z każdej grupy eksperymentalnej.
    1. Umieść mysz na cyrkulującej poduszce grzewczo wody (37 °C) lub pod lampą grzewczą na 5–10 minut przed zabiegiem, aby wspomóc rozszerzenie naczyń ogonowych.
    2. Przygotuj mysz w odpowiednim przezroczystym cylindrycznym zabezpieczeniu dla gryzoni, pozostawiając ogon całkowicie odsłonięty. Dezynfekuj ogon i dodatkowo zwizualizuj boczne żyły ogonowe poprzez wycieranie skóry wymazem etanolowym z zamawiającym 70%.
  2. Włóż opracowany[18F]radiotracer AV-45 do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mL wyposażonej w igłę. Przygotuj objętość zastrzyku około 100–150 μL, aby uzyskać docelową dawkę radioaktywności 3,0 MBq (czystość radiochemiczna > 95%)2.
  3. Zmierz i rejestruj początkową radioaktywność strzykawki wypełnionej znacznikiem za pomocą kalibratora dawki.
  4. Wprowadź igłę, skośoną do góry, pod płytkim kątem (około 10°–20°) do bocznej żyły ogonowej. Odczekaj 60 minut po podaniu, a następnie znieczulaj mysz przez wdychanie 2% izofluranu.
  5. Ustaw mysz i wykonaj 15-minutowy trójwymiarowy statyczny skan PET.
  6. Odbuduj dane PET za pomocą algorytmu maksymalizacji oczekiwanej z trójwymiarowym uporządkowaniem podzbiorów (OSEM).
  7. Przetwarzaj zrekonstruowane dane za pomocą oprogramowania PMOD (wersja 4.5).
    1. Współrejestruj dane do szablonu mózgowego odpowiedniego dla małych i średnich myszy w module fuzji PMOD. Pozwól programowi automatycznie wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) w mózgu myszy.
  8. Oblicz standaryzowane wartości pobierania (SUV). Uzyskaj ustandaryzowany współczynnik wartości absorpcji (SUVR), porównując SUV każdego ROI z możdżkiem8.
    UWAGA: Akceptowalna zmienność podawanej dawki (2,0–3,8 MBq) uwzględnia dzienne wahania wydajności radiotracera oraz masę ciała myszy indywidualnie. Ponieważ kolejne ilościowe analizy opierają się na standaryzowanym wskaźniku wartości absorpcji (SUVR) — który normalizuje obszar docelowy względem obszaru odniesienia (móżdżku) — bezwzględne wahania dawki w tym zakresie nie wpływają na wyniki porównawczych obrazowania. Mikropozytonowa tomografia emisyjna (Micro-PET) pokazana jest na Rysunku 2.

7. Analiza statystyczna

  1. Wszystkie analizy statystyczne wykonuj za pomocą oprogramowania SPSS (wersja 19.0).
  2. Przedstawij dane jako średnią ± odchyleniu standardowym (SD).
  3. Zastosuj jednokierunkową ANOVA, aby przeanalizować wyniki testów ukrytej platformy.
  4. Przeanalizuj dane z testu sondy przestrzennej i obrazowania PET za pomocą powtarzalnych pomiarów ANOVA lub jednokierunkowych ANOVA, a następnie wykonaj testy LSD po-hoc dla porównań parowych.

Wyniki

Wpływ elektroakupunktury na funkcje poznawcze u myszy APP/PS1
Aby ocenić zdolność uczenia się przestrzennego, myszy przeszły próby treningowe od pierwszego do piątego dnia. W teście ukrytej platformy (Rysunek 3A,B) opóźnienie ucieczki myszy we wszystkich grupach wykazywało malejący trend w okresie treningowym. W porównaniu z grupą N, grupa z AD wykazywała znacząco wydłużoną latencję ucieczki (p < 0,05), co wskazuje na wyraźne deficyty uczenia się i pamięci u 6-miesięcznych myszy APP/PS1. Opóźnienie ucieczki w grupie AD było znacząco dłuższe niż w grupach N i EA (p < 0,01). Warto zauważyć, że w piątym dniu opóźnienie ucieczki w grupie EA było znacząco krótsze niż w grupie AD (p < 0,05) (Rysunek 3C). Po 5-dniowym okresie treningowym oceniono pamięć przestrzenną za pomocą testu sondy przestrzennej. Obliczono stosunek czasu spędzonego na pływaniu w kwadrancie docelowym (platformowym) do całkowitego czasu pływania; wyższy stosunek oznacza lepsze zapamiętywanie pamięci. Wyniki wykazały, że stosunek czasu pływania w grupie z AD był istotnie niższy niż w grupie N (p < 0,01). Dla porównania, grupa EA wykazała istotnie wyższy wskaźnik w porównaniu do grupy z AD (p < 0,01). Jednak stosunek w grupie EA pozostał niższy niż w grupie N (p < 0,05) (Rysunek 3D).

Przeanalizowano także liczbę przekroczeń peronów, co odzwierciedla precyzję pamięci przestrzennej. Większa liczba przekroczeń sugeruje lepsze zapamiętywanie informacji. Grupa z AD wykazała znacznie mniej przekroczeń między peronami niż grupa N (p < 0,05), podczas gdy grupa EA wykazała istotny wzrost w porównaniu z grupą AD (p < 0,05). Niemniej jednak grupa EA miała mniej przecięć niż grupa N (p < 0,05) (Rysunek 3E).

Wpływ elektroakupunktury na osadzanie się Aβ w hipokampie APP/PS1 mice
Depozicija Aβ została oceniona za pomocą obrazowania PET, a standaryzowany współczynnik wartości absorpcji (SUVR) radioznakowanego znacznika Aβ obliczono w hipokampie myszy APP/PS1 (Rysunek 4A). Skany mikro-PET wykazały, że zarówno grupa N, jak i EA wykazywały istotnie niższe wartości SUVR w porównaniu z grupą AD (Rysunek 4B). Dalsza analiza ilościowa potwierdziła, że SUVR hipokampa i Aβ w grupie EA były istotnie wyższe niż w grupie N (p < 0,05), podczas gdy po interwencji elektroakupunkturą pozostały istotnie niższe niż w grupie z AD (p < 0,05) (Rysunek 4C).

Wpływ elektroakupunktury na ekspresję białka Aβ
Po ocenach behawioralnych i obrazowych oceniono ekspresję białka Aβ w hipokampie za pomocą analizy Western blot (rysunek 5A). Analiza ilościowa wykazała, że względna ekspresja Aβ w grupie AD była istotnie podwyższona w porównaniu do grupy N (p < 0,05). Grupa EA wykazała istotne zmniejszenie ekspresji Aβ w hipokampie w porównaniu do grupy z AD (p < 0,05). Jednak poziomy ekspresji w grupie EA pozostały wyższe niż w grupie N, co wskazuje, że choć interwencja skutecznie osłabiła nagromadzenie Aβ, nie oczyściła całkowicie istniejących blaszek (Rysunek 5B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny diagram pokazujący położenie punktów akupunktowych GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) i GV29 (Yintang) u myszy. Figura ta została ponownie wykorzystana za zgodą Sun i in.5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikropozytonowa tomografia emisyjna (Micro-PET). IRIS PET/CT (Inviscan) to przedkliniczny system obrazowania myszy i szczurów, charakteryzujący się wysoką czułością (>9%) oraz rozdzielczością przestrzenną 1 mm oraz polem widzenia osiowym 96 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Wpływ elektroakupunktury na funkcje poznawcze. (A) aparat MWM. (B) Myszy były testowane przy użyciu aparatu Morris Water Mae (MWM). (C) Trendy opóźnień ucieczki podczas testu ukrytej platformy. W porównaniu do grupy N, ◆◆p < 0,05; w porównaniu z grupą z chorobą Alzheimera (AD), ▲▲p < 0,05. (D) Proporcja czasu pływania w pierwszym kwadrancie. W porównaniu do grupy N, ◆◆p < 0,05; w porównaniu do grupy AD, ▲▲p < 0,05. (E) Liczba przejazdów peronów w kwadrancie peronowym. W porównaniu do grupy N, ◆◆p < 0,05; w porównaniu do grupy AD, ▲▲p < 0,05. Figura ta została ponownie wykorzystana za zgodą Sun i in.5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Wpływ elektroakupunktury na depozycję Aβ. (A) Obszar zainteresowania hipokampa myszy jest przedstawiony na zielono. (B) Obrazy mikropozytonowej tomografii emisyjnej Aβ u myszy z każdej grupy. (C) Porównanie ustandaryzowanych wskaźników wartości wchładu [18F]AV-45 (SUVR; region docelowy/móżdżek) w hipokampie każdej grupy, zdefiniowane przez mikro-PET. W porównaniu do grupy N, ◆◆p < 0,05; w porównaniu z grupą z chorobą Alzheimera (AD), ▲▲p < 0,05. Figura ta została ponownie wykorzystana za zgodą Sun i in.5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Wpływ elektroakupunktury na ekspresję białek Aβ. (A) Reprezentatywne zachodnie pasma blot pokazujące poziomy ekspresji Aβ (4 kDa) i GAPDH (146 kDa) jako kontrolę obciążenia. Pasma te ilustrują niską ekspresję Aβ w grupie N, wysoką ekspresję w grupie AD oraz zmniejszoną ekspresję w grupie EA w porównaniu z modelem AD. (B) Ilościowa analiza względnej ekspresji Aβ do GAPDH w grupach eksperymentalnych. W porównaniu do grupy N, ◆◆p < 0,05; w porównaniu z grupą z chorobą Alzheimera (AD), ▲▲p < 0,05. Figura ta została ponownie wykorzystana za zgodą Sun i in.5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Wizualizacja i ilościowa ilościowość osadów w hipokampie stanowi kluczowe okno na patologiczny przebieg9 n.e. Chociaż istnieje wiele modalności neuroobrazowania, osiągnięcie wysokiej rozdzielczości, translacji ilościowej i międzygatunkowej pozostaje istotną przeszkodą. Na przykład obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni często jest ograniczone rozdzielczością przestrzenną, a MRI — choć potrafi mapować zmiany strukturalne — często wymaga nadmiernie wysokich dawek środków kontrastowych, aby wyznaczyć płytki amyloidowe in vivo. Dla porównania, PET stanowi optymalne narzędzie translacyjne, umożliwiające dynamiczną ocenę neurozapalenia, metabolizmu glukozy oraz akumulacji A zarówno w modelach zwierzęcych, jak i populacjach klinicznych10,11. Obrazowanie molekularne za pomocą PET nie tylko ułatwia wczesną diagnozę i precyzyjne patologiczne zaawansowanie. ale jest także niezbędny do monitorowania zaangażowania i skuteczności nowych terapii antydefensywnych12. Pojawienie się technologii mikro-PET w przedklinicznej sferze znacznie rozszerzyło użyteczność PET poza środowiska kliniczne i badania nad naczelnymi nieludzkimi. Charakteryzujący się wyższą rozdzielczością przestrzenną i wysoką czułością dostosowaną do wąskich pól widzenia, micro-PET umożliwia badaczom śledzenie postępu neurodegeneracyjnego w modelach gryzoni wzdłużnie13,14. Co istotne, ustalone ilościowe metryki, takie jak SUVR obliczone względem obszarów referencyjnych pozbawionych solidnej patologii A, takiej jak móżdżek, mogą być płynnie przełożone z laboratorium na łóżkopacjenta 15. Historycznie obrazowanie PET z użyciem specyficznych znaczników wykazywało wysoką wrażliwość diagnostyczną (do 90%) i swoistość (89%) dla AD16,17. Chociaż znacznik PIB [11C]PIB zrewolucjonizował wczesną wizualizację amyloidu, jego krótki okres półtrwania ograniczał szerokie zastosowanie18. Późniejszy rozwój i zatwierdzenie przez FDA w 2012 roku dla [18F]AV-45 (Florbetapir) złagodziłote ograniczenia, zapewniając dłuższy okres półtrwania oraz doskonałą więźność i selektywność dla Aβ. W konsekwencji [18F]AV-45 stał się podstawą zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w ocenach przedklinicznych20.

Należy rozważyć kilka kluczowych kroków i potencjalnych modyfikacji przy korzystaniu z tego protokołu. Po pierwsze, rygorystyczna kontrola parametrów radiosyntezy jest niezbędna; każde odchylenie w ilości prekursora lub temperaturze reakcji może poważnie ograniczyć czystość radiochemiczną i wydajność [18F]AV-45. Po drugie, precyzyjne ustawienie stereotaksyjne podczas obrazowania PET jest kluczowe, aby uniknąć efektów częściowej objętości, które mogą sztucznie zniekształcać obliczenia SUVR w małych hipokampach myszy. Aby rozwiązywać problemy z niskimi stosunkami sygnału do szumu w obrazach PET, badacze powinni zweryfikować specyficzną aktywność wstrzykniętego znacznika i upewnić się, że głębokość znieczulenia izofluranowego pozostaje stabilna, ponieważ ruch oddechowy może rozmyć obrazy.

Ta metodologia ma pewne ograniczenia. Chociaż mikro-PET AV-45 zapewnia makroskopowy obraz regionalnego obciążenia Aβ, jego rozdzielczość przestrzenna nie pozwala na wizualizację pojedynczych, mikroskopijnych płytek amyloidowych. Ponadto 15-dniowa interwencja elektroakupunktury zastosowana w tym badaniu wykazała istotne zmniejszenie obciążenia Aβ w porównaniu z nieleczonymi myszami z AD; jednak biorąc pod uwagę, że całkowite usunięcie ustalonych blaszek Aβ zazwyczaj wymaga miesięcy ciągłej interwencji, obecny paradygmat odzwierciedla przede wszystkim wczesną modulację rozpuszczalnej dynamiki Aβ lub zatrzymanie stopniowego osadzania, a nie całkowite usunięcie blaszek strukturalnych. Dodatkowo, uzyskanie badań PET przed i po interwencji u tego samego uczestnika zapewniłoby silniejszą kontrolę podłużną, strategię, którą należy zastosować w przyszłych projektach eksperymentalnych.

Podsumowując, wyniki tego badania sugerują, że interwencja elektroakupunktury (EA) znacząco ogranicza nagromadzenie Aβ i zachowuje funkcje poznawcze przestrzenne u myszy APP/PS1. Mechaniczne podstawy tej poprawy mogą wiązać się z neuromodulacyjnymi efektami stymulujących punkty akupunkturowe Governor Vessel (Du Mai)21, które zostały anatomicznie powiązane z sieciami powięziowymi i neuronaczyniowymi wspierającymi przepływ krwi głowowej i szlaki oczyszczania. Dzięki dostarczaniu solidnych, mierzalnych dowodów obrazowania molekularnego, protokół ten podkreśla znaczenie integracji tradycyjnych metod terapeutycznych z zaawansowanym neuroobrazowaniem. Takie ramy metodologiczne torują drogę głębszym badaniom nad terapeutycznymi ścieżkami akupunktury w zwalczaniu AD.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy zadeklarowali brak potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82004482, 82274654, 82274644), Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (nr 7252219) oraz Fundusz Innowacji Szóstego Centrum Medycznego Szpitala Ludowego Ludowego (nr CXPY202405). Dziękujemy Biorender (biorender.com) za dostarczenie narzędzi graficznych użytych w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[18 lat]AV-45Laboratorium Radiofarmakologiczne Uniwersytetu Pedagogicznego w Pekinie— —Najczęściej stosowany znacznik w branży
0,22 μ Membrana PVDF m PVDFBeyotimeFFP71Efektywny transfer filmu
15% żel SDS-PAGEBeyotimeP0066Utrudnianie migracji białek małych cząsteczek
5& razy; Bufor ładowania SDSBeyotimeP0015Upewnij się, że pasy są wyraźne i dokładnie je rozdzielają.
6-miesięczny męsek, myszy z aplikacją/PS1Cavenberg (Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Szeroko wykorzystywany do badań nad chorobą Alzheimera.
 
6-miesięczny samiec myszy C57BL/6Cavenberg (Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Dla normalnej grupy kontrolnej
Aβ Przeciwciałoproteintech25524-1-APWykrywanie A i beta; Monomer
Jednorazowe igły do sterylnej akupunkturyZhongYan TaiHe Medicial Instrument Co.,LtdZYTH2013030504Popularne narzędzia akupunktury
Podłoże ECLThermo Fisher (Pierce)  32106 (500 mL)Wykrywanie białek docelowych
Aparat elektroakupunktury (EA)Pekin Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202Powszechnie stosowany sprzęt do elektroakupunktury w Chinach
GAPDHproteintech23567-1-CBKlasyczne białko referencyjne (1:5000)
Przeciwciało wtórne sprzężone z HRPThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100μ L)Wykrywanie białek docelowych (1:2000)
Oprogramowanie ImageJNIH  Wersja 1.53aAnaliza wartości szarości w skali pasków
IzofluranCentaur30135687 (250ml)Bezpieczna i szybka anestezja myszy
PET-CTSystem obrazowania IRIS PET/CTIRISWysoka czułość PET i doskonała wydajność ilościowa
Koktajl inhibitorów fosfatazyBeyotimeP0055BUtrzymanie stanu fosforylacji białek
Oprogramowanie PMODPMOD Technologies  Wersja 4.5 Używane do  przetwarzanie i analiza danych obrazowych PET
Marker masy cząsteczkowej białka z wcześniejszym barwieniemThermo Fisher (Pierce)26619 (2&razy; 250&mikro; L) Monitorowanie elektroforezy i transferu błonowego 
Koktajl inhibitorów proteazyBeyotimeP1046Szerokie spektrum hamowania endogennej aktywności proteazy
Bufor lizy RIPABeyotimeP0013CUtrzymanie modyfikacji fosforylacji białek
Odtłuszczone mleko w proszku używane w urządzeniu Morris Water MazeYili6907992637815Urządzić nieprzezroczystość wody i ukryć podwodne platformy
System labiryntu wodnego MorrisChengdu Taimeng Software Co., Ltd.WMT-100SSprzęt do labiryntów wodnych szeroko stosowany w Chinach

Bibliografia

  1. Chiotis, K., Wang, Y., La Joie, R., Rabinovici, G. D. The role of amyloid-β and tau PET in the new era of Alzheimer disease therapies. J Nucl Med. 67 (2), 175-185 (2026).
  2. Zhao, Q., et al. Unraveling Alzheimer's complexity with a distinct Aβ42 fibril type and specific AV-45 binding. Nat Chem Biol. 22 (3), 482-490 (2025).
  3. Machado, L. S., et al. Association between FDG- and TSPO-PET signals across human and animal studies investigating neurodegenerative conditions: a systematic review. Mol Psychiatry. 31 (1), 559-575 (2025).
  4. Yin, H., Lu, Z., Deng, Y., Tian, X., Gong, Q. Decoding blood-brain barrier dysfunction in Alzheimer's disease: innovations and challenges in multimodal MRI and PET imaging biomarkers. Ageing Res Rev. 114, 102952(2025).
  5. Sun, R. -Q., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in behavioral probably due to reducing deposition of Aβ in hippocampus. Anat Rec (Hoboken). 304 (11), 2521-2530 (2021).
  6. Lakatos, I., et al. AI-driven framework for enhanced and automated behavioral analysis in Morris water maze studies. Sensors (Basel). 25 (5), 1564(2025).
  7. Zha, Z., Ploessl, K., Choi, S. R., Alexoff, D., Kung, H. F. Preclinical evaluation of [18F]D3FSP, deuterated AV-45, for imaging of β-amyloid in the brain. Nucl Med Biol. 92, 97-106 (2020).
  8. Wong, D. F., et al. In vivo imaging of amyloid deposition in Alzheimer disease using the radioligand 18F-AV-45 (florbetapir [corrected] F 18). J Nucl Med. 51 (6), 913-920 (2010).
  9. Almeida, Z. L., Vaz, D. C., Brito, R. M. M. Morphological and molecular profiling of amyloid-β species in Alzheimer's pathogenesis. Mol Neurobiol. 62 (4), 4391-4419 (2024).
  10. Naganuma, F., et al. A novel near-infrared fluorescence probe THK-565 enables in vivo detection of amyloid deposits in Alzheimer's disease mouse model. Mol Imaging Biol. 25 (6), 1115-1124 (2023).
  11. Kim, E., et al. In vivo multi-parametric manganese-enhanced MRI for detecting amyloid plaques in rodent models of Alzheimer's disease. Sci Rep. 11 (1), 12419(2021).
  12. van Dyck, C. H., et al. Lecanemab in early Alzheimer's disease. N Engl J Med. 388 (1), 9-21 (2022).
  13. Masdeu, J. C., Pascual, B., Fujita, M. Imaging neuroinflammation in neurodegenerative disorders. J Nucl Med. 63 (Suppl 1), 45S-52S (2022).
  14. Zhan, Y., et al. Hybrid PET/MRI imaging of Alzheimer's disease based on 18F-AV-1451. J Vis Exp. (218), e67574(2025).
  15. Lopresti, B. J., et al. Simplified quantification of Pittsburgh compound B amyloid imaging PET studies: a comparative analysis. J Nucl Med. 46 (12), 1959-1972 (2005).
  16. Herschman, H. R. Micro-PET imaging and small animal models of disease. Curr Opin Immunol. 15 (4), 378-384 (2003).
  17. Patwardhan, M. B., McCrory, D. C., Matchar, D. B., Samsa, G. P., Rutschmann, O. T. Alzheimer disease: operating characteristics of PET–a meta-analysis. Radiology. 231 (1), 73-80 (2004).
  18. Mintun, M. A., et al. [11C]PIB in a nondemented population: potential antecedent marker of Alzheimer disease. Neurology. 67 (3), 446-452 (2006).
  19. Romano, M., Buratti, E. Florbetapir F 18 for brain imaging of β-amyloid plaques. Drugs Today (Barc). 49 (3), 181-193 (2013).
  20. Choi, S. R., et al. Preclinical properties of 18F-AV-45: a PET agent for Abeta plaques in the brain. J Nucl Med. 50 (11), 1887-1894 (2009).
  21. Wang, G. -J., Ayati, M. H., Zhang, W. -B. Meridian studies in China: a systematic review. J Acupunct Meridian Stud. 3 (1), 1-9 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie mikro-PETodkładanie beta-amyloiduelektroakupunkturalabirynt wodny MorrisaWestern blotdysfunkcja poznawczaobrazowanie molekularne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.