In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

Streszczenie

Komórki T regulatorowe (Treg) odgrywają kluczowe role w utrzymaniu homeostazy immunologicznej. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu komórek Treg są związane z różnymi chorobami, w tym chorobami autoimmunologicznymi, odrzuceniem przeszczepów narządów, infekcjami i rakiem. Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, w tym zaburzeń autoimmunologicznych, odrzucenia przeszczepów stałych narządów, choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi i chorób alergicznych. Klasyczne in vitro testy supresji komórek Treg oceniają głównie hamujący wpływ komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak oprócz proliferacji, różnicowanie komórek T jest ważne dla wykonywania przez nie funkcji odpornościowych. Dlatego w tym protokole przedstawiono zmodyfikowany in vitro test supresji komórek Treg w celu zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff. W tym protokole najpierw przedstawiono przygotowanie mysiej komórek Treg i naiwnych komórek T, a następnie strategię współhodowli do badania regulacyjnych wpływów komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff, w tym komórek Th1 i Th17, i wreszcie przedstawiono strategię barwienia do cytometrii przepływowej po współhodowli. Ta in vitro analiza funkcjonalna komórek Treg może być wykorzystana do zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i polaryzację komórek T.

Wprowadzenie

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ komórki T regulatorowych (Treg) są ważnymi mediatorami homeostazy immunologicznej¹. Komórki Treg aktywnie tłumią nadmierną odpowiedź immunologiczną i utrzymują tolerancję immunologiczną, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniu normalnych tkanek i narządów przez reakcje immunologiczne². Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, takich jak choroby autoimmunologiczne, odrzucenie przeszczepów narządów, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi oraz choroby alergiczne^3,4,5. Z drugiej strony, hamowanie funkcji komórek Treg jest uważane za skuteczną strategię aktywacji odporności przeciwnowotworowej^6,7. Badania kliniczne obejmowały adopcyjną terapię komórkami T regulatorowymi lub leczenie małymi dawkami IL-2 w przypadku chorób autoimmunologicznych, przeszczepów narządów i choroby przeszczep przeciw gospodarzowi^8,9,10. Co więcej, badania nad inżynieryjnymi komórkami Treg, w tym komórkami CAR (chimeric antigen receptor)-Treg i TCR (T-cell receptor)-Treg, zyskują coraz większą uwagę^11,12.

Do tej pory terapia Treg nie została szeroko zastosowana w rutynowym leczeniu klinicznym. Aby wspierać zastosowanie kliniczne terapii Treg, ważne jest przeprowadzenie systematycznych badań i oceny jej funkcji. Powszechną strategią oceny funkcji komórek T regulatorowych in vitro jest badanie tłumienia Treg ¹³, które może wykryć funkcję tłumiąca komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak standardowe in vitro badanie tłumienia Treg nie ocenia różnicowania komórek Teff. Jeśli proliferacja i różnicowanie komórek T efektorowych może być oceniane jednocześnie, można uzyskać więcej informacji o funkcji komórek T regulatorowych.

Przedstawiamy zmodyfikowany in vitro test tłumienia komórek Treg, zwany “in vitro funkcjonalną analizą komórek Treg” (Rysunek 1). Ten protokół zapewnia strategię współkultury in vitro do badania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt w West China Hospital, Sichuan University (Numery zgody: 20250814006, 20211212A). Wszystkie użyte w tym eksperymencie myszy miały genetyczne tło C57BL/6.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj bufor do fluorescynacji aktywowanych komórek (FACS): 1× PBS zawierający 0,5% białka surowicy wołowej (BSA).
2. Przygotuj bufor do magnetycznej aktywacji komórek (MACS): 1× PBS zawierający 0,5% BSA i 2 mM kwasu etylenodiamonoteocowego (EDTA).
3. Przygotuj środowisko kultury komórkowej: środowisko RPMI 1640 zawierające 10% surowicy wołowej (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 55 µM β-merkaptoetanol, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny.

2. Przygotowanie limfocytów myszy C57BL/6

1. Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i obwodowe węzły chłonne (LNs) od 6–8-tygodniowej myszy C57BL/6 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS.
   UWAGA: Sekcja śledziony i węzłów chłonnych powinna być wykonana zgodnie ze standardowymi procedurami.
2. Umieść sitko komórkowe o średnicy 70 µm na 50 mL probówce do wirowania, następnie umieść śledzionę i węzły chłonne na sitku i użyj tłoczka strzykawki 5 mL, aby delikatnie zgnieść tkankę przez 1 min. Podczas gniecenia spłucz sitko 3 razy buforem FACS. Upewnij się, że tkankę zgniesiono całkowicie i spłucz komórki do probówki. Po gnieceniu usuń sitko.
3. Wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.
4. Usuń nadstan, resuspęduj pellet komórek w 3 mL buforu do lizy krwinek czerwonych i pozostaw zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 3–5 min.
5. Nawczas dodaj bufor FACS do probówki do wirowania do objętości 15–20 mL, aby zakończyć lizę i wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.
6. Usuń nadstan, dodaj 10 mL buforu FACS i delikatnie resuspęduj pellet komórek.
7. Weź 10 µL zawiesiny komórkowej i użyj barwienia trypanowym błękitem do zliczenia żywych limfocytów.
   UWAGA: Są to limfocyty CD45.2⁺.

3. Przygotowanie limfocytów myszy CD45.1

1. Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i węzły chłonne od 6–8-tygodniowej myszy CD45.1 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS.
2. Przygotuj limfocyty od myszy CD45.1, stosując się do tych samych kroków, które zostały opisane powyżej.
   UWAGA: Są to limfocyty CD45.1⁺.

4. Przygotowanie naiwnych komórek T CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

UWAGA: Cały proces wykorzystuje zestaw do izolacji komórek T CD4⁺CD62L⁺ T Cell Isolation Kit for MACS. Bufor MACS jest wstępnie chłodzony w 4 °C, a wszystkie warunki wirowania to 4 °C, 350 × g przez 7 min.

1. Pobierz zawiesinę komórkową od myszy C57BL/6, wiruj i wyrzuć nadstan, dodaj 400 µL buforu MACS i 100 µL Biotynowanej Mieszanki Przeciwciał do Komórek T CD4⁺ do probówki do wirowania na każde 1 × 10⁸ początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 5 min w ciemności.
2. Dodaj 300 µL buforu MACS i 200 µL Przeciwciał przeciwko Biotynie do probówki do wirowania z kroku 4.1 na każde 1 × 10⁸ początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 10 min w ciemności.
3. Dodaj 10 mL buforu MACS, wiruj i wyrzuć nadstan. Resuspęduj pellet komórek w 2 mL buforu MACS.
4. Umieść kolumnę LS na odpowiednim separatorze magnetycznym do sortowania MACS. Użyj 3 mL buforu MACS do spłukania kolumny. Poczekaj, aż bufor w kolumnie całkowicie się spuści, zanim przejdziesz do następnego kroku.
   UWAGA: Maksymalna pojemność ładowania komórek kolumny LS wynosi 2 × 10⁹ komórek, w tym zarówno dodatnich, jak i ujemnych komórek, a maksymalna liczba dodatnich komórek, którą może uchwycić, to 1 × 10⁸. Zwykle jedna mysz wymaga tutaj jednej kolumny LS.
5. Włóż zawiesinę kom

Wyniki

W reprezentatywnym eksperymencie, jako komórki Tresp do badania wpływu komórek wzbogaconych w Treg na proliferację i różnicowanie komórek Th1 i Th17, użyto naiwnych komórek T. W tym eksperymencie komórki Tresp były aktywowane przez anty-mysie CD3 i komórki wzbogacone w APC, niebędące CD4⁺, a następnie różnicowały się na komórki Th1 pod indukcją IL-12 p70 lub na komórki Th17 pod indukcją TGF-α1 i IL-6. Pod tymi dwoma warunkami indukcji, badano zmiany w proliferacji i różnicowaniu komórek Tresp po dodaniu komóre...

Dyskusja

W tej studii wyniki kokultury w warunkach indukcji Th1 są zgodne z poprzednimi raportami, że komórki Treg mogą hamować proliferację i różnicowanie komórek Th1^17,18. Komórki wzbogacone Treg zahamowały również proliferację komórek Tresp w warunkach indukcji Th17. Jednakże w warunkach polaryzacji Th17 stosowanych tutaj, częstość komórek IL-17A⁺ Tresp zwiększyła się w obecności komórek wzbogaconych Treg, co różni się od poprzednich raportów, że komórki Tre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	lub równoważne
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	lub równoważne
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	lub równoważne
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	lub równoważne
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	lub równoważne
48-well plates	Corning Incorporated	3548	lub równoważne
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	lub równoważne
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	lub równoważne
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	lub równoważne
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	lub równoważne
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	lub równoważne
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	lub równoważne
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	lub równoważne
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	lub równoważne
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	lub równoważne
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	lub równoważne
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	do pozyskiwania danych cytometrii przepływowej próbek komórek odpornościowych
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	lub równoważne
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	lub równoważne
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	do sortowania komórek
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	do sortowania komórek
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	lub równoważne
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	lub równoważne
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	lub równoważne
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	lub równoważne
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	lub równoważne
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	lub równoważne
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	lub równoważne
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	lub równoważne
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	lub równoważne
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	lub równoważne
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	lub równoważne
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	do sortowania komórek
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	lub równoważne
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	do sortowania komórek
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	do sortowania komórek
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	do sortowania komórek
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	do sortowania komórek
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	lub równoważne
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	lub równoważne
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	lub równoważne
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	lub równoważne
PMA	Millipore Sigma	P8139	lub równoważne
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	lub równoważne
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	do sortowania komórek
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	lub równoważne
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	lub równoważne
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	lub równoważne
RPMI 1640 medium	Thermo