Artykuł metodologiczny

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

DOI:

10.3791/71268

⸱

9 czerwca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotherapy, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, Collaborative Innovation Center of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki T regulatorowe (Treg) odgrywają kluczowe role w utrzymaniu homeostazy immunologicznej. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu komórek Treg są związane z różnymi chorobami, w tym chorobami autoimmunologicznymi, odrzuceniem przeszczepów narządów, infekcjami i rakiem. Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, w tym zaburzeń autoimmunologicznych, odrzucenia przeszczepów stałych narządów, choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi i chorób alergicznych. Klasyczne in vitro testy supresji komórek Treg oceniają głównie hamujący wpływ komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak oprócz proliferacji, różnicowanie komórek T jest ważne dla wykonywania przez nie funkcji odpornościowych. Dlatego w tym protokole przedstawiono zmodyfikowany in vitro test supresji komórek Treg w celu zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff. W tym protokole najpierw przedstawiono przygotowanie mysiej komórek Treg i naiwnych komórek T, a następnie strategię współhodowli do badania regulacyjnych wpływów komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff, w tym komórek Th1 i Th17, i wreszcie przedstawiono strategię barwienia do cytometrii przepływowej po współhodowli. Ta in vitro analiza funkcjonalna komórek Treg może być wykorzystana do zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i polaryzację komórek T.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD4+CD25+Foxp3+ komórki T regulatorowych (Treg) są ważnymi mediatorami homeostazy immunologicznej1. Komórki Treg aktywnie tłumią nadmierną odpowiedź immunologiczną i utrzymują tolerancję immunologiczną, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniu normalnych tkanek i narządów przez reakcje immunologiczne2. Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, takich jak choroby autoimmunologiczne, odrzucenie przeszczepów narządów, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi oraz choroby alergiczne3,4,5. Z drugiej strony, hamowanie funkcji komórek Treg jest uważane za skuteczną strategię aktywacji odporności przeciwnowotworowej6,7. Badania kliniczne obejmowały adopcyjną terapię komórkami T regulatorowymi lub leczenie małymi dawkami IL-2 w przypadku chorób autoimmunologicznych, przeszczepów narządów i choroby przeszczep przeciw gospodarzowi8,9,10. Co więcej, badania nad inżynieryjnymi komórkami Treg, w tym komórkami CAR (chimeric antigen receptor)-Treg i TCR (T-cell receptor)-Treg, zyskują coraz większą uwagę11,12.

Do tej pory terapia Treg nie została szeroko zastosowana w rutynowym leczeniu klinicznym. Aby wspierać zastosowanie kliniczne terapii Treg, ważne jest przeprowadzenie systematycznych badań i oceny jej funkcji. Powszechną strategią oceny funkcji komórek T regulatorowych in vitro jest badanie tłumienia Treg 13, które może wykryć funkcję tłumiąca komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak standardowe in vitro badanie tłumienia Treg nie ocenia różnicowania komórek Teff. Jeśli proliferacja i różnicowanie komórek T efektorowych może być oceniane jednocześnie, można uzyskać więcej informacji o funkcji komórek T regulatorowych.

Przedstawiamy zmodyfikowany in vitro test tłumienia komórek Treg, zwany “in vitro funkcjonalną analizą komórek Treg” (Rysunek 1). Ten protokół zapewnia strategię współkultury in vitro do badania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt w West China Hospital, Sichuan University (Numery zgody: 20250814006, 20211212A). Wszystkie użyte w tym eksperymencie myszy miały genetyczne tło C57BL/6.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj bufor do fluorescynacji aktywowanych komórek (FACS): 1× PBS zawierający 0,5% białka surowicy wołowej (BSA).
  2. Przygotuj bufor do magnetycznej aktywacji komórek (MACS): 1× PBS zawierający 0,5% BSA i 2 mM kwasu etylenodiamonoteocowego (EDTA).
  3. Przygotuj środowisko kultury komórkowej: środowisko RPMI 1640 zawierające 10% surowicy wołowej (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 55 µM β-merkaptoetanol, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny.

2. Przygotowanie limfocytów myszy C57BL/6

  1. Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i obwodowe węzły chłonne (LNs) od 6–8-tygodniowej myszy C57BL/6 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS.
    UWAGA: Sekcja śledziony i węzłów chłonnych powinna być wykonana zgodnie ze standardowymi procedurami.
  2. Umieść sitko komórkowe o średnicy 70 µm na 50 mL probówce do wirowania, następnie umieść śledzionę i węzły chłonne na sitku i użyj tłoczka strzykawki 5 mL, aby delikatnie zgnieść tkankę przez 1 min. Podczas gniecenia spłucz sitko 3 razy buforem FACS. Upewnij się, że tkankę zgniesiono całkowicie i spłucz komórki do probówki. Po gnieceniu usuń sitko.
  3. Wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.
  4. Usuń nadstan, resuspęduj pellet komórek w 3 mL buforu do lizy krwinek czerwonych i pozostaw zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 3–5 min.
  5. Nawczas dodaj bufor FACS do probówki do wirowania do objętości 15–20 mL, aby zakończyć lizę i wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.
  6. Usuń nadstan, dodaj 10 mL buforu FACS i delikatnie resuspęduj pellet komórek.
  7. Weź 10 µL zawiesiny komórkowej i użyj barwienia trypanowym błękitem do zliczenia żywych limfocytów.
    UWAGA: Są to limfocyty CD45.2+.

3. Przygotowanie limfocytów myszy CD45.1

  1. Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i węzły chłonne od 6–8-tygodniowej myszy CD45.1 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS.
  2. Przygotuj limfocyty od myszy CD45.1, stosując się do tych samych kroków, które zostały opisane powyżej.
    UWAGA: Są to limfocyty CD45.1+.

4. Przygotowanie naiwnych komórek T CD45.2+CD4+CD62L+

UWAGA: Cały proces wykorzystuje zestaw do izolacji komórek T CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit for MACS. Bufor MACS jest wstępnie chłodzony w 4 °C, a wszystkie warunki wirowania to 4 °C, 350 × g przez 7 min.

  1. Pobierz zawiesinę komórkową od myszy C57BL/6, wiruj i wyrzuć nadstan, dodaj 400 µL buforu MACS i 100 µL Biotynowanej Mieszanki Przeciwciał do Komórek T CD4+ do probówki do wirowania na każde 1 × 108 początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 5 min w ciemności.
  2. Dodaj 300 µL buforu MACS i 200 µL Przeciwciał przeciwko Biotynie do probówki do wirowania z kroku 4.1 na każde 1 × 108 początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 10 min w ciemności.
  3. Dodaj 10 mL buforu MACS, wiruj i wyrzuć nadstan. Resuspęduj pellet komórek w 2 mL buforu MACS.
  4. Umieść kolumnę LS na odpowiednim separatorze magnetycznym do sortowania MACS. Użyj 3 mL buforu MACS do spłukania kolumny. Poczekaj, aż bufor w kolumnie całkowicie się spuści, zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: Maksymalna pojemność ładowania komórek kolumny LS wynosi 2 × 109 komórek, w tym zarówno dodatnich, jak i ujemnych komórek, a maksymalna liczba dodatnich komórek, którą może uchwycić, to 1 × 108. Zwykle jedna mysz wymaga tutaj jednej kolumny LS.
  5. Włóż zawiesinę kom

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W reprezentatywnym eksperymencie, jako komórki Tresp do badania wpływu komórek wzbogaconych w Treg na proliferację i różnicowanie komórek Th1 i Th17, użyto naiwnych komórek T. W tym eksperymencie komórki Tresp były aktywowane przez anty-mysie CD3 i komórki wzbogacone w APC, niebędące CD4+, a następnie różnicowały się na komórki Th1 pod indukcją IL-12 p70 lub na komórki Th17 pod indukcją TGF-α1 i IL-6. Pod tymi dwoma warunkami indukcji, badano zmiany w proliferacji i różnicowaniu komórek Tresp po dodaniu komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej studii wyniki kokultury w warunkach indukcji Th1 są zgodne z poprzednimi raportami, że komórki Treg mogą hamować proliferację i różnicowanie komórek Th117,18. Komórki wzbogacone Treg zahamowały również proliferację komórek Tresp w warunkach indukcji Th17. Jednakże w warunkach polaryzacji Th17 stosowanych tutaj, częstość komórek IL-17A+ Tresp zwiększyła się w obecności komórek wzbogaconych Treg, co różni się od poprzednich raportów, że komórki Tre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło było wspierane przez Program Sichuan Science and Technology (NR 2026NSFSC0940), projekt 1·3·5 dla Dyscyplin Doskonałości, Zachodni Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet Sichuan (NR. ZYYC25010) oraz Chińską Fundację Naukową dla Doktorantów (NR. 2025M781396). D.Z. szczerze chce upamiętnić Dr. Sang-A Park, który zmarł w 2018 roku. Przepływ eksperymentu został stworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 mL centrifuge tubeThermo Fisher Scientific3457IWlub równoważne
12.5 μL Filtered Pipette TipsThermo Fisher Scientific94420043lub równoważne
1250 μL Filtered Pipette TipsThermo Fisher Scientific94420813lub równoważne
15 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339650lub równoważne
200 μL Filtered Pipette TipsThermo Fisher Scientific94420318lub równoważne
48-well platesCorning Incorporated3548lub równoważne
5 mL syringe pistonShifeng MedicalSB2-061(A)lub równoważne
50 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339652lub równoważne
50 μL Filtered Pipette TipsThermo Fisher Scientific94420258lub równoważne
70 μm cell strainer Biosharp Life SciencesBS-70-CSlub równoważne
Anti-mouse CD28 antibodyBioXcellBE0015-1lub równoważne
Anti-mouse CD3 antibodyBioXcellBE0001-1lub równoważne
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)Thermo Fisher Scientific45-0042-82lub równoważne
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)Thermo Fisher Scientific48-5773-82lub równoważne
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)BioLegend505808lub równoważne
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)Thermo Fisher Scientific25-7177-82lub równoważne
Beckman CytoFLEX S Flow CytometerBeckman CoulterN/Ado pozyskiwania danych cytometrii przepływowej próbek komórek odpornościowych
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichB2064lub równoważne
C57BL/6 miceShanghai Model Organisms Center, IncSM-001do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PEThermo Fisher Scientific12-0251-83lub równoważne
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-091-041do sortowania komórek
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-106-643do sortowania komórek
CD45.1 miceShanghai Model Organisms Center, IncNM-KI-210226do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITCThermo Fisher Scientific11-0453-85lub równoważne
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780Thermo Fisher Scientific47-0454-82lub równoważne
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC Thermo Fisher Scientific11-0621-85lub równoważne
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD Biosciences554714lub równoważne
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450Thermo Fisher Scientific65-0842-90lub równoważne
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Solarbio Life SciencesE1170lub równoważne
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificA5669701lub równoważne
FlowJo 10.6.2BD BiosciencesN/Aoprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej
Golgi-Plug Protein Transport InhibitorBD Biosciences555029lub równoważne
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080lub równoważne
Human TGF-beta1PEPROTECH100-21Club równoważne
Ionomycin calcium saltMillipore SigmaI3909lub równoważne
LD ColumnsMiltenyi Biotec130-042-901do sortowania komórek
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific25030081lub równoważne
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401do sortowania komórek
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303do sortowania komórek
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201do sortowania komórek
OctoMACS SeparatorsMiltenyi Biotec130-042-109do sortowania komórek
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010049lub równoważne
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400408lub równoważne
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control AntibodyThermo Fisher Scientific25-4321-82lub równoważne
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122lub równoważne
PMAMillipore SigmaP8139lub równoważne
Purified anti-mouse CD16/32 AntibodyBioLegend101302lub równoważne
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976do sortowania komórek
Recombinant mouse IL-12 p70PEPROTECH210-12lub równoważne
Recombinant Mouse IL-6R&D Systems406-MLlub równoważne
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)Thermo Fisher ScientificA1049201lub równoważne
RPMI 1640 medium Thermo

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

funkcja kom rek Tregproliferacja limfocyt w Tr nicowanie limfocyt w Ttest in vitrotest supresji Tregefektorowe limfocyty Tcytometria przep ywowakom rki Th1kom rki Th17

Powiązane artykuły