Czasowy Przegląd Dwufotonowy Metabolizmu NAD+ Endotelialnego Mózgu U Myszy

Rui Zhan; Yanyan Li; Xia Meng; Hongtu Cui; Mingming Zhao; Wenxin Shan; Huanhuan Cao; Jianyong Du; Junxia Zhang; Lu Fang; Wenguang Li; Qihua He; Xin Wang; Zhao Yang; Jinpeng Sun; Youyi Zhang; Erdan Dong; Han Xiao

doi:10.3791/71358

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Czasowy Przegląd Dwufotonowy Metabolizmu NAD⁺ Endotelialnego Mózgu U Myszy

131 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71358

⸱

24 lipca 2026

Rui Zhan^*¹^,²^,³ , Yanyan Li^*¹ , Xia Meng⁴^,⁵ , Hongtu Cui² , Mingming Zhao² , Wenxin Shan²^,⁶ , Huanhuan Cao²^,⁶ , Jianyong Du¹ , Junxia Zhang² , Lu Fang¹ , Wenguang Li⁷ , Qihua He⁸ , Xin Wang¹ , Zhao Yang³ , Jinpeng Sun³ , Youyi Zhang²^,⁹ , Erdan Dong¹^,²^,⁶ , Han Xiao¹^,²^,⁹

¹School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, ²Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shandong University, ⁴National Center for Infectious Diseases, Capital Medical University, ⁵China National Clinical Research Center for Neurological Diseases, Capital Medical University, ⁶The Institute of Cardiovascular Sciences, Peking University, ⁷Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, ⁸State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, ⁹Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi University School of Medicine

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym metabolizmu nikotynamidu adeniny dinukleotydu w komórkach śródbłonka mózgu u żywych myszy za pomocą ekspresji biosensora ukierunkowanego na śródbłonek, przygotowania okna czaszkowego i obrazowania dwufotonowego.

Streszczenie

Prezentujemy odtwarzalny przepływ pracy do wizualizacji w czasie rzeczywistym odpowiedzi biosensora kanalu nikotynamidu adeniny dinukleotydu (NAD⁺) w komórkach śródbłonka mikrokrążenia mózgu u żywych myszy przy użyciu dwufotonowej mikroskopii okna czaszkowego oraz sensora NAD⁺ ukierunkowanego na endotel. Protokół obejmuje (1) wyrażanie sensora NAD⁺ z wykorzystaniem wirusa adeno-związanego (AAV) selektywnie w endotelialnym układzie naczyniowym za pomocą AAV-X1.1 pod Cdh5 promotorem (kaderyna śródbłonkowa), (2) chirurgiczne przygotowanie stabilnego okna czaszkowego o wymiarach 3 mm × 3 mm, oraz (3) dwufala dwufotonowa do jednoczesnego rejestrowania zielonego sygnału kanału sensora obudzonego przy 920 nm i wewnątrznaczyniowego kanału referencyjnego tetrametylorodaminy (TMR)–dekstranu obudzonego przy 1040 nm. Kanał TMR–dekstranu dostarcza referencji światła światła naczyniowego i wspiera selekcję naczyń, ocenę ruchu oraz ocenę integralności naczyń. Jako przykład zastosowania opisujemy zmiany związane z mononukleotydem nikotynamidu–wiązane z fluorescencja sensora endotelialnego po dostarczeniu przez wodę pitną, podawaniu doustnym lub dożylnym. Protokół ten podkreśla kluczowe kroki, zalecane dawki wirusowe i zagadnienia tytru, rozwiązywanie problemów oraz strategie analizy ilościowej, umożliwiające laboratoriom wdrożenie in vivo monitorowania dynamiki kanału biosensora NAD⁺ układu krążenia mózgowego w badaniach neurometabolizmu w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Nikotinamid-adenin-dinukleotyd (NAD⁺) jest kluczowym kofaktorem dla równowagi redoks, aktywności mitochondria, naprawy DNA i sygnalizacji odpowiedzialnej za stres. W unaczynnionej tkanki mózgowej homeostaza NAD⁺ jest coraz bardziej rozpoznawana jako aktywny regulator integralności bariery, napięcia naczyniowego i sprzężenia neuronaczyniowego, a nie jako pasywny wynik metabolizmu¹. Zakłócenie metabolizmu NAD⁺ w komórkach śródbłonka zostało powiązane z upływem czasu i wyciekiem bariery krew-mózg (BBB) oraz upośledzeniem homeostazy neuronaczyniowej, co podkreśla potrzebę metod, które mogą rozdzielać dynamikę metaboliczną śródbłonka bezpośrednio w żywej tkanki mózgowej².

Większość obecnie stosowanych podejść do ilościowego określania NAD⁺ opiera się na końcowych pomiarach biochemicznych, barwieniu tkanki stałej lub odczytach czujników ex vivo. Chociaż informacje te są pouczające, podejścia te nie zachowują integralnej architektury mikrokrążenia, nie mogą łatwo odróżnić szybkie zmiany w obrębie zwierzęcia w czasie i zapewniają ograniczoną specyficzność dla typu komórki, gdy są stosowane do heterogenicznej tkanki mózgowej. W przeciwieństwie do tego, przewlekłe okno czaszki z dwufotonowym obrażem umożliwia wielokrotną wizualizacje kortykalnych mikronaczyń u żywych myszy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, co sprawia, że jest ono dobrze przystosowane do monitorowania sygnałów śródbłonkowych, reagujących metabolicznie, w warunkach określonych fizjologicznych lub farmakologicznych interwencji³^,⁴^,⁵.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowego przepływu pracy dla monitorowania w czasie rzeczywistym dynamiki NAD⁺ śródbłonka mózgu in vivo. Metoda łączy systemowe dostarczanie śródbłonkowego, ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) opartego na NAD⁺ czujnika opakowującego wirusa adeno-związanego (AAV)-X1.1 i napędzanego przez promotor Cdh5, stabilne 3 mm × 3 mm okno czaszki dla dostępu optycznego⁶^,⁷^,⁸, oraz dwufotonowe obrażenie z dwoma długościami fal i referencyjnym kanałem intravaskularnym tetrametylorodaminy (TMR)-dekstranu¹. Mechanizm czujnika został wyjaśniony w następujący sposób: biosensor cytoplazmatycznego NAD⁺ LigA-cpVenus Cambronne et al. jest odwrotnym czujnikiem opartym na cpVenus. Wiązanie NAD⁺ zmniejsza fluorescencje cpVenus/eGFP w standardowym odczycie pobudzania 488 nm, podczas gdy kanał pobudzania 405 nm służy jako referencja do normalizacji raportowej. Dlatego surowa zielona fluorescencja nie powinna być interpretowana jako bezpośrednia pozytywna miara stężenia NAD⁺. W tej dwufotonowej implementacji, pobudzanie 920 nm jest używane do uzyskania sygnału kanału czujnikowego zielonego, podczas gdy pobudzanie 1040 nm jest używane dla naczyniowego referencyjnego kanału TMR-dekstranu; tym samym, obecne nabywanie 920/1040 nm nie jest równoważne z kalibrowanym raportowaną pomiarem 488/405 nm. Biosensor Cambronne et al. został wybrany, ponieważ został on szeroko zweryfikowany do monitorowania dynamiki NAD⁺ wewnątrzkomórkowej i jest kompatybilny z obecną konfiguracją obrażania z dwoma długościami fali. Chociaż nowsze wskaźniki, takie jak FiNad, zapewniają alternatywne podejścia do monitorowania dynamiki NAD⁺, ich implementacja wymagałaby modyfikacji czerwonego kanału fluorescencji, obecnie używanego do naczyniowego referencyjnego etykietowania TMR-dekstranu. Czujnik Cambronne raportuje względne zmiany w dostępności NAD⁺ w obrębie ograniczonego zakresu dynamicznego i został zweryfikowany w zastosowaniach komórkowych i subkomórkowych; jednak, interpretacja sygnału może być wpłynięta przez poziom ekspresji, pH, fotobielenie i zmienność ścieżki optycznej, a bezwzględna ilościowa ocena NAD⁺ wymaga kalibracji lub ortogonalnej biochemicznej weryfikacji. AAV-X1.1 został wybrany, ponieważ warianty AAV tropowe dla śródbłonka zostały zgłoszone jako wydajnie transdukują naczynia środkowego układu nerwowego⁶^,⁷. W naszym wstępnym porównaniu kilku serotypów AAV, w tym AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT i AAV-X1.1, używając ekspresji ulepszonego zielonego fluorescencyjnego białka CAG- lub Cdh5-sterowanej jako raportu, AAV-X1.1 wyprodukował najbardziej korzystny wzór ekspresji związany z naczyniami spośród testowanych serotypów. Promotor Cdh5 został następnie użyty, aby dodatkowo ograniczyć ekspresję transgenu do komórek śródbłonkowych naczyniowych, zgodnie z poprzednimi raportami wskazującymi na selektywną ekspresję transgenu u śródbłonka in vivo⁶.

W porównaniu z ex vivo testami NAD⁺, to podejście zachowuje integralną sieć naczyniową, umożliwia pomiary wzdłużne w ty