Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Streszczenie

Przemysłowe bioprodukowanie opiera się na mikroorganizmach do wydajnego syntetyzowaniu produktów docelowych w inżynieryzowanych warunkach. Jednak szczepy dzikiego typu często nie mają zdolności do tego, z powodu ich rodzimych sieci metabolicznych. Dlatego szybkie i dokładne przesiewanie wysokowydajnych szczepów z dużych bibliotek mutantów jest kluczowymi krokiem w przemysłowej hodowli mikroorganizmów. W ostatnich latach technologia mikrofluidyki kroplowej przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na swoją wysoką przepustowość, niski zużycie i zdolności do kompartmentalizacji pojedynczych komórek, co doprowadziło do opracowania licznych systemów sortowania pojedynczych komórek. W niniejszej pracy przedstawiono protokół przesiewania wysokowydajnego dla mikroorganizmów przemysłowych przy użyciu zautomatyzowanej platformy mikrofluidyki kroplowej. Zintegrowany przepływ pracy obejmuje cztery kluczowe etapy: budowę biblioteki mutantów poprzez mutagenezę plazmą atmosferyczną i plazmą w temperaturze pokojowej (ARTP); wysokowydajne enkapsulację pojedynczych komórek i kontrolowane mikrohodowlę w kroplach skalii pikoliterowe; precyzyjne mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnego bioczujnika, a następnie sortowanie kropli aktywowanych fluorescencyjnie (FADS), aby odizolować krople zawierające wysokowydajne warianty; oraz walidację posortowanych kandydackich szczepów poprzez fermentację w płytkach mikrotypowych i w flaszy wstrząsającej. Pełny i zintegrowany przepływ pracy przesiewania jest przeznaczony jako znormalizowany szablon, a jego walidacja jest demonstrowana poprzez odizolowanie mutantów wysokowydajnych w produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako konkretnego przykładu. Ta zautomatyzowana platforma przesiewania wysokowydajnego oferuje potężne rozwiązanie techniczne z znacznym potencjałem przyspieszenia przemysłowej hodowli wysokowydajnych szczepów.

Wprowadzenie

Biotechnologia przemysłowa wykorzystuje mikroorganizmy i enzymy jako biokatalizatory do produkcji cennych produktów na dużą skalę. Takie podejście jest uważane za bardziej przyjazne dla środowiska i efektywne niż tradycyjna produkcja chemiczna. Jednak naturalne sieci metaboliczne mikroorganizmów ewoluowały, aby priorytetowo dbać o ich przetrwanie i rozmnażanie, a nie o efektywną syntezę produktów pożądanych przez ludzi. W rezultacie, wysokowydajna hodowla mikrobiologiczna jest często konieczna, aby sprostać wymogom środowiska produkcyjnego przemysłowego z rygorystycznymi warunkami^1,2,3. Proces ten polega na szybkiej budowie dużych bibliotek mutantów mikrobiologicznych poprzez mutagenezę fizyczną lub chemiczną, a następnie hodowli i fenotypową detekcję mutantów o różnych genotypach. Następnie wybiera się tylko niewielką część lepszych szczepów. Jednak tradycyjne technologie przesiewowe oparte na płytkach i mikrotalerzy są ograniczone przez uciążliwe procedury, niski przepływ i wysoki koszt. Ta cieśnina, wraz z znacznym zużyciem materiałów eksploatacyjnych i odczynników, prowadzi do niskiej ogólnej efektywności hodowli mikrobiologicznej^4,5.

Mikrofluidyka kropel stała się ostatnio przełomowym rozwiązaniem tego problemu. W przeciwieństwie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), które są nieodpowiednie do sortowania wydzielonych produktów ze względu na szybkie dyfuzowanie cząsteczek z komórki, sortowanie kropel aktywowanych fluorescencyjnie (FADS) umieszcza pojedyncze komórki w mikrokomorach skali pikolitrowej, skompartymentalizowanych^6,7,8. Ta fizyczna izolacja zapobiega konkurencji szczepów, umożliwia zlokalizowany akumulację wydzielonych metabolitów i pozwala na ich ilościową detekcję za pomocą fluorescencyjnych biosensorów. W rezultacie FADS okazało się idealną platformą do przesiewania wysokowydajnego różnych produktów wydzielniczych, w tym aminokwasów, kwasów organicznych i enzymów. Zespół opracował genetycznie zakodowany fluorescencyjny biosensor GECFINDER i w połączeniu z FADS z powodzeniem przesiewał szczepy wytwarzające wysokie poziomy fenyloalaniny i poprawił efektywność sortowania o ponad 1000 razy⁹. Inna grupa opracowała platformę sortowania kropel aktywowanych fluorescencyjnie sprzężoną z genetycznie zakodowanym biosensorem do przesiewania wysokowydajnych szczepów produkujących kwas 3-dehydroszikiminowy w E. coli, a zoptymalizowany system FADS znacznie poprawił efektywność sortowania i umożliwił izolację mutantów o znacznie zwiększonej produkcji¹⁰. Niektórzy naukowcy zastosowali technologię FADS do inżynierii polimerazy DNA Bst, a uzyskane mutanty o znacznie zwiększonej termostabilności i aktywności przemieszczania się nici zostały następnie zastosowane do wykrywania LAMP, co skróciło czas reakcji z 40 min do 10 min¹¹.

Jednakże, translacja tych postępów technologicznych do rutynowych przepływów pracy rozwoju szczepów przemysłowych pozostaje wyzwaniem. Wiele komercyjnych systemów mikrofluidycznych kropel, pomimo ich zaawansowanego sprzętu, nie posiada kompletnej, intuicyjnej i powtarzalnej standardowej procedury operacyjnej dostosowanej do przesiewania fenotypowego mikroorganizmów. Aby zapełnić tę lukę, przyjęto zautomatyzowany mikrofluidyczny platformę kropel integrującą modułową kontrolę płynów, przyjazne dla użytkownika oprogramowanie i standaryzowany projekt chipu, kładąc idealne techniczne podstawy dla ustanowienia w pełni zintegrowanego przepływu pracy sortowania. To badanie wykorzystuje wysokowydajne przesiewanie wysokowydajnych L-kwasu mlekowego produkujących szczepów B. coagulans jako przypadek walidacji. Na podstawie platformy mikrofluidycznej kropel, ustanowiono następujący przepływ pracy, składający się z czterech kluczowych sekwencyjnych kroków: (1) budowa zróżnicowanej biblioteki mutantów poprzez mutagenezę plazmową atmosferyczną i temperatury pokojowej (ARTP); (2) wysokowydajne enkapsulacja pojedynczych komórek i kontrolowana mikrohodowla w kropelach w warunkach zoptymalizowanych dla wzrostu B. coagulans i produkcji L-kwasu mlekowego; (3) precyzyjne pikowy wstrzyknięcie fluorescencyjnego biosensora specyficznego dla L-laktanu, po którym następuje szybkie sortowanie kropel zawierających wyższe producentów; i (4) rygorystyczna walidacja wyselekcjonowanych kandydatów poprzez fermentację w kultiwatorach wstrząsających, aby potwierdzić zwiększoną produkcję i stabilność genetyczną. Ten protokół jest przeznaczony dla naukowców i inżynierów zaangażowanych w przemysłową hodowlę mikroorganizmów, którzy wymagają wysokowydajnego przesiewania produktów wydzielniczych. Jest szczególnie odpowiedni dla hodowli bakterii, które wydziela małe cząsteczki metabolitów lub enzymów. Platforma przesiewowa musi być wyposażona w czujniki kompatybilne z mikrośrodowiskiem kropli, aby umożliwić specyficzną detekcję docelowych metabolitów. Dla szczepów wymagających specjalnych warunków hodowli (np. ścisłe anaeroby), parametry hodowli mogą być dostosowane, aby zoptymalizować i ustalić dedykowaną strategię hodowli. Poprzez ustanowienie

Protokół

Do niniejszego badania nie było wymagane zatwierdzenie komisji etycznej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z wykorzystaniem czystych kultur drobnoustrojów; w badaniach nie brali udziału ludzie ani zwierzęta laboratoryjne. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w poniższym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowania

OSTROŻNIE: Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa biologicznego. B. coagulans jest organizmem z grupy 1. poziomu bezpieczeństwa biologicznego ( ). Należy używać rękawiczek i fartucha laboratoryjnego. Wszystkie manipulacje w otwartych naczyniach należy wykonywać w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie materiały, które miały kontakt z żywymi komórkami, należy autoklawować w temperaturze 121 °C przez 20 min przed utylizacją.

1. Źródło i utrzymanie szczepu
   1. Zakupić szczep B. coagulans ATCC 7050 z komercyjnej kolekcji kultur jako kulturę na podłożu skośnym drugiej generacji.
   2. Wymazać pętlą kulturę ze skosu na agar podłoża startowego i inkubować w 50 °C przez 24 h. Wybrać pojedynczą kolonię, zaszczepić ją do płynnego podłoża startowego i hodować w 50 °C, 200 rpm przez 12 h.
   3. Zmieszać otrzymaną kulturę ze sterylnym 40% glicerolem do końcowego stężenia 25% (v/v) i przechowywać jako mrożone zapasy w –80 °C. Przed każdym eksperymentem rozmrozić świeżą alikvotę, wymazać ją na agar podłoża startowego i inkubować w 50 °C przez 24 h.
   4. Następnie wybrać pojedynczą kolonię, zaszczepić ją do płynnego podłoża startowego i hodować w 50 °C, 200 rpm przez 12 h przed użyciem do mutagenezy i skriningu (Rycina uzupełniająca 1).
2. Sensor kwasu mlekowego
   1. Wyeksponować i oczyścić sensor eLACCO1.1 zgodnie z opisem w materiałach uzupełniających¹² (Rycina uzupełniająca 2).
   2. Uzupełnić oczyszczony sensor 5% (v/v) glicerolem i przechowywać w –80 °C. Przed każdym eksperymentem rozmrozić jedną alikvotę na lodzie i niezwłocznie rozcieńczyć sterylnym 10 mM PBS (pH 7.4) do końcowego stężenia roboczego  0.1 mg/mL.
3. Przygotowanie podłoży hodowlanych
   1. Podłoże startowe (g/L: glukoza 20, ekstrakt drożdżowy 5, trypton 10, octan sodu 2, cytrynian sodu 2, K₂HPO₄ 2, MgSO₄·7H₂O 0.2, MnSO₄·H₂O 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.01). Glukozę sterylizować osobno jako roztwór zapasowy 200 g/L w 115 °C przez 20 min.
      1. Pozostałe składniki autoklawować w 121 °C przez 15 min. Po ochłodzeniu dodać sterylny roztwór zapasowy glukozy do końcowego stężenia 20 g/L, a następnie sterylizować mikroelementy poprzez filtrację.
      2. Kompletne podłoże przechowywać w 4 °C przez maksymalnie jeden tydzień. Stosować do aktywacji nocnej oraz przygotowania inokulum.
   2. Podłoże do skriningu (g/L: glukoza 20, ekstrakt drożdżowy 6.66, NaCl 0.333, NH₄Cl 0.665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4.46, MgSO₄ 0.12, CaCl₂ 0.074).
      1. Glukozę sterylizować osobno w 115 °C przez 20 min. Mieszaninę soli i ekstraktu drożdżowego autoklawować w 121 °C przez 15 min.
      2. Po ochłodzeniu dodać sterylny roztwór zapasowy glukozy do stężenia 20 g/L. Przechowywać w 4 °C przez maksymalnie jeden tydzień. Stosować jako fazę wodną do generowania kropel oraz jako podłoże hodowlane wewnątrz kropel podczas 10 h inkubacji.
   3. Podłoże fermentacyjne (g/L: glukoza 90, trypton 13.33, ekstrakt drożdżowy 13.33, octan sodu 0.67, NaCl 0.0133, MgSO₄·7H₂O 0.0133, MnSO₄·H₂O 0.0133, FeSO₄·7H₂O 0.0133).
      1. Glukozę sterylizować jako roztwór zapasowy 500 g/L w 115 °C przez 20 min. Pozostałe składniki autoklawować w 121 °C przez 15 min.
      2. Po ochłodzeniu dodać sterylny roztwór zapasowy glukozy do stężenia 90 g/L. Bezpośrednio przed zaszczepieniem dodać sterylny proszek CaCO₃ (4% w/v) w celu buforowania pH. Przygotowywać codziennie. Stosować do wstępnego skriningu na płytkach wielodołkowych oraz do walidacji w kolbach z wytrząsaniem.
         UWAGA: Wszystkie podłoża przygotowywać z wodą destylowaną do końcowej objętości 1 L. Dostosować pH do 6.5 za pomocą 1 M HCl.

2. Konstrukcja biblioteki mutantów przy użyciu ARTP

OSTRZEŻENIE: Praca z ARTP wiąże się z wykorzystaniem plazmy wysokiej częstotliwości oraz lampy UV. Promieniowanie UV może spowodować uszkodzenia oczu i skóry. Wyładowania plazmowe generują ozon oraz wysokie temperatury. Drzwi komory muszą być zawsze zamknięte podczas pracy plazmy. Należy nosić fartuch laboratoryjny i gogle z filtrem UV. Stosować wyłącznie hel o czystości 99,999%; zapewnić odpowiednią wentylację. Po każdym procesie mutagenezy przetrzeć blat roboczy i wewnętrzne ścianki komory mutagenezy ściereczką niepozostawiającą włókien, nasączoną 75% (v/v) etanolem. 75% etanol jest łatwopalny. Przechowywać z dala od otwartego ognia, iskier i gorących powierzchni.

1. Wyznaczenie krzywej wzorcowej korelującej OD₆₀₀ z koncentracją żywych komórek.
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię B. coagulans do pożywki startowej i inkubować w temperaturze 50 °C przy 200 rpm przez 12 h, aż kultura osiągnie środkową fazę logarytmiczną.
   2. Przygotować rozcieńczenia seryjne zawiesiny bakteryjnej w gradientach 10⁴, 10⁵ i 10⁶.
   3. Nanieść 100 µL każdego rozcieńczenia i równomiernie rozprowadzić na szalkach z agarem w pożywce startowej w trzech powtórzeniach.
   4. Inkubować wszystkie wysiane szalki z agarem w temperaturze 50 °C przez 24 h.
   5. Policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU) dla każdego rozcieńczenia.
      UWAGA: Kalibracja wykazuje, że OD₆₀₀ = 0,5 odpowiada około 1 × 10⁸ CFU/mL. Wykorzystać tę zależność do określenia początkowej gęstości komórek do enkapsulacji w kropelkach (Rycina uzupełniająca 3).
2. Hodować B. coagulans do środkowej lub późnej fazy logarytmicznej, a następnie rozcieńczyć świeżą kulturę startową do OD₆₀₀ = 0,05 w świeżej pożywce startowej.
3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować osiem sterylnych małych metalowych krążków i jeden duży metalowy krążek. Przypalić osiem małych krążków nad palnikiem alkoholowym przez 1 min, umieścić je na sterylnym dużym krążku i pozostawić do ochłodzenia na 10 min.
4. Za pomocą mikropipety równomiernie nanieść 10 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na każdy z ośmiu ochłodzonych małych krążków.
5. Przenieść duży krążek z naniesionymi małymi krążkami do sterylnej szalki Petriego.
6. Włączyć urządzenie ARTP i aktywować główny ekran sterowania. Włączyć lampę UV wewnątrz komory do mutagenezy. Uruchomić chłodziarkę i schładzać wstępnie przez 20 min, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 20 °C.
7. Szybko otworzyć drzwiczki komory do mutagenezy i umieścić w niej małe krążki.
8. Za pomocą sterylnej pęsety sekwencyjnie przenosić każdy mały krążek na stół próbek ARTP.
   UWAGA: Moc RF, szybkość przepływu helu, odległość dyszy od próbki oraz czystość helu zostały ustalone odpowiednio na 120 W, 10 SLM, 2 mm i 99,999%. Czas napromieniowania helu ustawiono odpowiednio na 5, 10, 15, 20, 25 i 30 s.
9. Poddać każdy mały krążek mutagenezie ARTP zgodnie z ustalonymi parametrami. Po napromieniowaniu przenieść wszystkie krążki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL zawierającej 10 mL pożywki regeneracyjnej. Inkubować w temperaturze 50 °C z wytrząsaniem przy 200 rpm przez 4 h, aby umożliwić regenerację i wzrost komórek.
10. Wyznaczenie współczynnika letalności.
    1. Rozcieńczyć seryjnie zregenerowaną kulturę w gradiencie od 10^-2 do 10^-6.
    2. Nanieść 100 µL każdego rozcieńczenia na szalki z agarem w pożywce startowej i przygotować trzy powtórzenia dla każdego rozcieńczenia.
    3. Inkubować wszystkie szalki w temperaturze 50 °C przez 24 h.
    4. Policzyć kolonie i obliczyć odpowiadającą wartość CFU/mL.
    5. Obliczyć współczynnik letalności, korzystając ze wzoru:
       ​   (1)
       UWAGA: Przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach dla każdego punktu czasowego. Optymalny czas mutagenezy dla ARTP w tym przypadku wynosi 20 s (Rycina uzupełniająca 4).

3. Skład zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropel i materiały eksploatacyjne

1. Systemy wykonawcze (Rysunek 1)
   UWAGA: Składają się z 3 kanałów wysokoprecyzyjnych kontrolerów ciśnienia z zakresem ciśnienia 0–1000 mbar i czasem odpowiedzi ciśnienia < 50 ms (Rysunek 1A).
2. System obrazowania
   UWAGA: Szybkie obrazowanie mikroskopowe CMOS charakteryzuje się szybkością akwizycji danych obrazowych ≥ 2 GB/s, częstotliwością klatek 0–20 000 fps oraz maksymalną rozdzielczością 1280 x 860. System posiada funkcję autofokusa do obserwacji ruchu kropli w czasie rzeczywistym i obsługuje nagrywanie obrazów oraz filmów, które można eksportować w wielu formatach, w tym BMP, AVI, MP4 i TIF.
3. System detekcji
   UWAGA: Umożliwia detekcję sygnału fluorescencyjnego za pomocą 2 laserów: 488 nm i 633 nm oraz 2 kanałów detekcyjnych.
4. Główny system sterowania
   UWAGA: Sterowany przez oprogramowanie zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej do kropli, system integruje wiele modułów, w tym sterowanie przepływem, obrazowanie mikroskopowe, wzbudzenie i detekcję, generowanie kropli, piko-wtryskiwanie oraz sortowanie. Obsługuje również akwizycję, rejestrację, przechowywanie, wyświetlanie i eksport danych eksperymentalnych. Przedstawiono częściowe jednostki operacyjne zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej do kropli (Rysunek 1B).
5. Materiały eksploatacyjne
   UWAGA: Materiały eksploatacyjne użyte w tym protokole obejmują: probówkę do wstrzykiwania fazy olejowej, próbki i odczynnika (Rysunek 2A); probówkę do inkubacji kropli (Rysunek 2B); chip do generowania kropli (Rysunek 2C); chip do piko-wtryskiwania do kropli (Rysunek 2D) oraz chip do sortowania kropli (Rysunek 2E).

4. Generowanie kropel

UWAGA: Należy wyczyścić zautomatyzowaną platformę mikrofluidyczną do kropli. Po każdym eksperymencie należy przetrzeć stolik, uchwyt chipa oraz wszelkie miejsca z rozlanymi substancjami 75% etanolem, używając bezpyłowych chusteczek. Należy usunąć pozostałości oleju fluorowanego, zawiesiny komórkowej lub roztworu sensorycznego.

1. Enkapsulacja pojedynczych komórek. Aby uzyskać λ = 0,1 w kropelkach o objętości 14 pL, należy rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do OD₆₀₀ ≈ 0,04 (OD_600​=0,5 odpowiada 1 × 10⁸ CFU/mL). Zgodnie z rozkładem Poissona:
      (2)
   Gdy λ = 0,1, 90,5% kropelek jest pustych, 9,1% zawiera pojedynczą komórkę, a 0,4% zawiera wiele komórek.
   UWAGA: W tym przypadku zmierzona wydajność enkapsulacji pojedynczych komórek wyniosła 11,2% (Rycina uzupełniająca 5). Liczbę komórek w kropelce można określić za pomocą barwienia DAPI. Gdy λ = 0,1, a wskaźnik enkapsulacji wielu komórek przekracza 1%, należy obniżyć OD₆₀₀, aby zmniejszyć proporcję kropelek zawierających wiele komórek.
2. Pipetować 300 µL oleju fluorowanego do fiolki wlotowej fazy olejowej. Pipetować 500 µL zawiesiny bakteryjnej do fiolki wlotowej fazy wodnej.
3. Zdjąć taśmę zabezpieczającą powierzchnię kości do generowania kropelek. Podłączyć kolejno fiolkę z olejem, fiolkę z próbką i fiolkę zbierającą do odpowiednich otworów w kości.
4. Umieścić kość na stoliku i zabezpieczyć ją. Podłączyć rurki powietrzne do fiolek wlotowych jedna po drugiej, zgodnie z oznaczeniami ścieżki gazowej.
5. Uruchomić oprogramowanie zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do generowania kropelek. Przesunąć pole widzenia na miejsce generowania kropelek, regulując pokrętło ruchu stolika zgodnie z kierunkami strzałek na kości.
6. Kliknąć „Start” w interfejsie „Droplet Generation” oprogramowania zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do generowania kropelek (Rycina 3A). W interfejsie obrazowania przeciągać suwaki „Z-axis” oraz jasności źródła światła, aby dostosować ostrość i jasność obrazu.
7. Kliknąć przyciski „+” i „-” w sekcjach „Droplet Speed” (prędkość kroplek) i „Droplet Size” (rozmiar kroplek), aby dostosować prędkość generowania oraz rozmiar kropelek.
   UWAGA: W tym przypadku ciśnienie fazy olejowej oraz ciśnienie fazy próbki do generowania kropelek zostały automatycznie ustawione odpowiednio na 300 mbar i 400 mbar, aby osiągnąć częstotliwość generowania 1500 Hz. Przy tych ustawieniach objętość kropelek wynosi 14 pL, a współczynnik zmienności (CV) średnicy kroplek utrzymuje się poniżej 5%, co zapewnia jednolity rozmiar kropelek i niezawodność operacji w dalszych etapach.
8. Odczekać 1 min, aż urządzenie się ustabilizuje, a stan generowania kropelek stanie się stały. Szybko wymienić fiolkę zbierającą, aby rozpocząć zbieranie kropelek.
   UWAGA: Do nowej probówki zbierającej należy wcześniej dodać niewielką ilość oleju fluorowanego, aby przykryć dolny otwór rurki teflonowej; zapobiegnie to bezpośredniemu kontaktowi kropelek ze ścianką rurki i ich łączeniu.
9. Zatrzymać zbieranie kropelek po 30 min pracy. Kliknąć „Stop” w wyskakującym oknie, aby potwierdzić zatrzymanie generowania kropelek.
10. Ostrożnie wyjąć probówkę zbierającą z kości. Ustawić probówkę i fiolkę zbierającą pionowo i odczekać, aż kropelki z probówki wpłyną do fiolki zbierającej.
11. Zdjąć ze stolika kość, fiolkę wlotową fazy olejowej oraz fiolkę wlotową fazy wodnej. Przetrzeć powierzchnię stolika 75% alkoholem. Etap generowania kropelek jest zakończony.

5. Hodowla w kropelkach

1. Dodaj 1 mL oleju mineralnego do probówki zbierającej.
   UWAGA: Warstwa oleju mineralnego pokrywa zawiesinę kropel, aby zminimalizować parowanie i ograniczyć ekspozycję na tlen, zapewniając jednocześnie wystarczającą wymianę gazową dla fakultatywnego anaeroba B. coagulans.
2. Umieść probówkę zbierającą pionowo w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej sterylną wodę. Pozostaw probówkę zbierającą z lekko zakręconą zakrętką i inkubuj w temperaturze 45 °C przez 10 h.
   UWAGA: Po inkubacji upewnij się, że współczynnik zmienności (CV) średnicy kropel wynosi <10% i nie obserwuje się koalescencji kropel. Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, należy odrzucić dane serie.

6. Pikowstrzykiwanie do kropli

OSTRZEŻENIE: Podczas pikowstrzykiwania do elektrod w chipie przyłożone jest wysokie napięcie za pośrednictwem połączenia z urządzeniem. Pole elektryczne może spowodować ciężki wstrząs elektryczny. Nie dotykaj elektrod ani powierzchni chipa narzędziami metalowymi ani gołymi rękami podczas pracy pod wysokim napięciem. Zawsze wyłączaj wyjście wysokiego napięcia przed manipulowaniem chipem. Noś izolacyjne rękawice i używaj nieprzewodzących narzędzi.

1. Przygotuj fiolkę wlotową dla fazy olejowej. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odmierzyć pipetą 300 µL oleju fluorowanego do fiolki wlotowej fazy olejowej.
2. Przygotuj fiolkę wlotową dla próbki. Zdejmij nakrętkę z otworu wlotowego probówki zbiorczej zawierającej kropelki. Zastąp ją nową nakrętką.
3. Odciąć końcówkę nowej fiolki wlotowej. Odetnij niewielki fragment przedniej części nowej fiolki wlotowej w taki sposób, aby jej końcówka sięgała poniżej poziomu cieczy w kroplach w fiolce z próbką.
4. Dokręć nakrętkę. Zabezpiecz nakrętkę szczelnie, aby zapobiec wyciekowi.
5. Przygotuj fiolkę doprowadzającą odczynnik. Pipetuj 500 µL czujnika kwasu mlekowego do fiolki wlotowej z odczynnikiem.
6. Dodać PBS do fiolki wlotowej z odczynnikiem. Jednocześnie dodać 500 µL sterylnego buforu PBS do tej samej fiolki doprowadzającej odczynnik.
   UWAGA: W tym doświadczeniu dodano bufor PBS w celu zrównoważenia pH kropli. Końcowe stężenie robocze czujnika mleczanów wynosiło 0,1 mg/ml, a objętość załadunku czujnika mleczanów wynosiła 500 µL.
7. Użyj ostrza, aby przeciąć taśmę zakrywającą otwory elektrod i odsłonić elektrody. Ustaw multimetr w trybie testu ciągłości i sprawdź połączenie obwodu oraz stan zwarcia układu scalonego.
   UWAGA: Jeśli multimetr wykaże prawidłowe połączenie obwodu elektrod w chipie, należy przejść do następnego kroku. W przypadku przerwy w obwodzie należy wymienić chip wstrzykujący i powtórzyć test.
8. Po potwierdzeniu prawidłowego połączenia obwodu za pomocą multimetru, usuń taśmę z powierzchni chipa. Podłącz kolejno fiolkę z olejem, fiolkę z próbką, fiolkę z odczynnikiem oraz fiolkę odbiorczą do odpowiadających im otworów w chipie.
9. Umieść chip na stoliku i zabezpiecz go. Podłącz rurki doprowadzające powietrze do kolejnych fiolek wlotowych zgodnie z etykietami ścieżek gazowych.
10. Otwórz oprogramowanie zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropelkowej. Przekręć pokrętło przesuwania stolika zgodnie z kierunkami strzałek na chipie, aby przesunąć pole widzenia na obszar elektrod chipa kropelkowego.
11. Kliknij "Rozpocznij" w "Pikowstrzykiwanie w kroplach" interfejs oprogramowania zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropel (Rycina 3B). W interfejsie obrazowania przeciągnij "Oś Z" oraz suwaki jasności źródła światła do regulacji klarowności i jasności obrazu.
    UWAGA: W tym momencie urządzenie automatycznie dostosowuje ciśnienie pompy fazy olejowej do 400 mbar, ciśnienie pompy fazy próbki do 420 mbar, a ciśnienie pompy fazy wtryskiwania odczynników do 450 mbar
12. W początkowej fazie pracy segment powietrza w cewniku zostanie wprowadzony do chipa, co jest zjawiskiem normalnym i trwa kilka minut.
13. Należy poczekać, aż krople pojawią się w polu widzenia. Kliknąć "Rozpocznij piko-iniekcję"W tym momencie zostanie aktywowane pole elektryczne urządzenia. Dostosuj prędkość generowania kropel, odstępy między kroplami oraz objętość iniekcji, klikając w "+" i "-" przyciski "Prędkość kropli", "Odstępy między kropelkami"i "Objętość wstrzykniętej próbki".
    UWAGA: Pole elektryczne ustawiono na domyślny zakres maksymalny. Jeśli podczas procesu fuzji krople pękają w obszarze pola elektrycznego, należy przełączyć urządzenie na zakres średni lub niski. W tym przypadku szybkość wstrzykiwania kropli wynosiła 200 Hz.
14. Obserwuj proces w oprogramowaniu do wyświetlania obrazów z kamery wysokich prędkości. Jeśli krople są stabilnie wstrzykiwane do czujnika kwasu mlekowego w stosunku 1:1, odczekaj 5 minut do ustabilizowania się urządzenia. Szybko wymień fiolkę odbiorczą, aby rozpocząć zbieranie kropel.
15. Po stabilnej infuzji przez 2 h, kliknij "Zatrzymaj" aby zakończyć piko-iniekcję kropelkową.
16. Ostrożnie wyjmij probówkę zbiorczą z chipa. Ustaw probówkę i fiolkę zbiorczą pionowo i poczekaj, aż kropelki z probówki przedostaną się do fiolki zbiorczej.

7. Sortowanie kropel

OSTREŻENIE: Demulgator jest substancją drażniącą i może powodować podrażnienia skóry i oczu. Jest również szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Zawsze należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych). Demulgatorem należy operować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem (dygestorium). Zużyty demulgator należy zbierać w osobnym, wyraźnie oznakowanym pojemniku. Nie wylewać do zlewu.

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nabić do pipety 300 µL fluorowanego oleju i dodać go do fiolki wlotowej fazy olejowej. Zastąpić zakrętkę fiolki wlotowej probówki zbiorczej zawierającej mikroiniekcyjne kropelki nową zakrętką.
   UWAGA: Przed przeprowadzeniem eksperymentów z sortowaniem kropelek pobrać 5 µL kropelek i obserwować je pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zmierzyć średnicę co najmniej 200 kropelek; kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy CV < 10%.
2. Za pomocą ostrza przeciąć taśmę zakrywającą otwory elektrod, aby odsłonić elektrody. Ustawić multimetr w trybie ciągłości i sprawdzić połączenie obwodu oraz stan zwarcia chipa.
3. Po potwierdzeniu prawidłowego połączenia obwodu za pomocą multimetru, odkleić taśmę z powierzchni chipa. Po kolei podłączyć fiolkę z olejem, fiolkę z próbką oraz fiolkę zbiorczą do sortowania do odpowiednich otworów w chipie.
4. Umieścić chip na stole i go zabezpieczyć. Podłączyć rurki powietrzne do fiolek wlotowych jedna po drugiej, zgodnie z oznaczeniami ścieżek gazowych.
5. Otworzyć oprogramowanie do obrazowania wysokiej rozdzielczości. Przekręcić pokrętło ruchu stołu zgodnie z kierunkiem strzałek na chipie, aby przesunąć pole widzenia na obszar elektrod chipa do kropelek.
6. Kliknąć „Start” w interfejsie „Droplet Sorting” (Sortowanie kropelek) oprogramowania zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropelek. W interfejsie obrazowania przesunąć suwaki „Z-axis” (Oś Z) oraz jasności źródła światła, aby dostosować ostrość i jasność obrazu.
   UWAGA: Po kliknięciu „Start” urządzenie automatycznie dostosowuje ciśnienie pompy olejowej do 300 mbar i ciśnienie pompy do próbek do 190 mbar, co skutkuje przepływem kropelek na poziomie 100 Hz.
7. W początkowej fazie pracy segment powietrza w cewniku zostanie wprowadzony do chipa, co potrwa kilka minut i jest zjawiskiem normalnym.
8.  Kliknąć, aby wybrać „Laser” i wybrać kanał detekcyjny 488 nm .
   UWAGA: Personel eksperymentalny może wybrać laser 488 nm, laser 633 nm lub kombinację obu, w zależności od projektu detekcji eksperymentalnej. Moc lasera: 20 mW.
9. Kliknąć „Data Recording” (Rejestracja danych). Urządzenie rozpocznie pozyskiwanie sygnałów fluorescencji kropelek (Rysunek 3C).
   UWAGA: Zebrać sygnały fluorescencji od 50 000 do 100 000 kropelek; urządzenie automatycznie posortuje wartości sygnałów i wygeneruje histogram sygnału fluorescencji.
10. Na podstawie wygenerowanego histogramu sygnału fluorescencji ustawić próg sortowania na najwyższe 0,1% całkowitych sygnałów fluorescencji i zebrać kropelki z wartościami sygnału powyżej tego progu.
    UWAGA: W tym przypadku bramka sortowania została ustawiona tak, aby zbierać kropelki o intensywności fluorescencji > 2750 (a.u.), co odpowiadało najwyższym 0,1% kropelek.
11. Ponownie kliknąć „Data Recording”. Urządzenie ponownie zarejestruje sygnały fluorescencji z pozostałych kropelek i posortuje kropelki docelowe na podstawie progu ustawionego w punkcie 7.10.
    UWAGA: Pozostałe sygnały kropelek zostaną również automatycznie posortowane i przedstawione na histogramie fluorescencji.
12. Po wybraniu obszaru kropelek docelowych włączyć „Sorting Switch” (Przełącznik sortowania) i ustawić wartość „Deflection Force” (Siła odchylenia). Urządzenie rozpocznie sortowanie kropelek.
    UWAGA: Urządzenie oferuje trzy wybieralne poziomy natężenia pola elektrycznego (Wysoki, Średni, Niski). Dla kropelek większych niż 30 µm wybrać Wysoki; dla kropelek mniejszych niż 25 µm wybrać Średni lub Niski. Zapewnia to stabilne odchylenie i optymalną wydajność sortowania.
13. Po stabilizacji pracy urządzenia przez 5 min, wymienić fiolkę zbiorczą, aby zebrać kropelki pozytywne.
    UWAGA: Podczas sortowania urządzenie na bieżąco i w czasie rzeczywistym mierzy intensywność fluorescencji każdej kropelki i porównuje ją z ustawionym progiem. Tylko kropelki o intensywności fluorescencji powyżej progu są odchylane i zbierane do dodatkowej probówki zbiorczej. Kropelka jest uważana za pozytywną, jeśli urządzenie wyświetla sygnał fluorescencji przekraczający próg sortowania i jednocześnie w interfejsie obrazowania obserwowane jest odchylenie kropelki, co potwierdza, że kropelka została pomyślnie skierowana do kanału zbiorczego dla próbek pozytywnych.
14. Zatrzymać sortowanie kropelek po 4 h stabilnej pracy. Kliknąć „Stop” w interfejsie „Droplet Sorting”.
15. Delikatnie wyjąć probówkę zbiorczą z chipa. Umieścić probówkę i fiolkę zbiorczą pionowo, aby upewnić się, że kropelki z probówki przedostaną się do fiolki zbiorczej.
16. Po zakończeniu zbierania kropelek kliknąć wykres rozrzutu, aby zapisać wykres rozrzutu z eksperymentu, wartości sygnału fluorescencji posortowanych kropelek pozytywnych oraz wartości sygnału fluorescencji wszystkich kropelek.
17. Usunąć chip, fiolkę wlotową fazy olejowej, fiolkę z próbką i fiolkę z odczynnikiem ze stołu. Zamknąć oprogramowanie.
18. Demulsyfikacja kropelek. Dodać 500 µL 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanolu do probówki zbiorczej z kropelkami. Odczekać 5 min, a następnie dodać 500 µL świeżego medium przesiewowego w celu odzyskania.
    UWAGA: Nie wstrząsać energicznie probówką zbiorczą po dodaniu demulsyfikatora; mieszać delikatnie. Po demulsyfikacji kropelek powstanie wyraźna granica między fazą wodną a olejową.
19. Pobrać 20 µL zdemulsyfikowanej zawiesiny bakteryjnej, rozcieńczyć ją 10-krotnie i wysiać na dwie płytki agarowe. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 2 dni.
    UWAGA: Stopień rozcieńczenia można dostosować do liczby zebranych kropelek. W tym przypadku z dwóch płytek uzyskano około 400 pojedynczych kolonii.

8. Eksport danych

1. Kliknij wykres sygnału fluorescencji w pustym obszarze interfejsu sortowania oprogramowania. Wybierz opcję zapisu wykresu rozproszenia sygnału fluorescencji kropli, histogramu sygnału fluorescencji oraz arkusza kalkulacyjnego Excel z sygnałami fluorescencji, które zawierają zarejestrowane wartości intensywności fluorescencji dla całkowitej liczby kropli, a także wartości intensywności fluorescencji dla wyselekcjonowanych kropli pozytywnych.

9. Wstępny screening na mikropłytkach

1. Wybierz losowo pojedyncze kolonie.
2. Zaszczep płytkę głębokich studzienek 24-dołkową do kultury namnażania. Każdą wybraną kolonię zaszczep do jednej studzienki 24-dołkowej płytki głębokiej zawierającej 2 mL pożywki fermentacyjnej. Użyj pętli do szczepienia.
3. Uszczelnij płytkę głębokich studzienek 24-dołkową nieprzepuszczalną membraną.
   UWAGA: Nie używaj membrany przepuszczalnej, ponieważ powoduje ona odparowanie pożywki hodowlanej.
4. Inkubuj kulturę namnażania. Umieść uszczelnioną płytkę głęboką 24-dołkową w inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 50 °C i przy 200 rpm przez 24 h.
5. Wykonaj pasaż w celu walidacji fermentacji. Po 24 h przenieś 200 µL kultury z każdej studzienki do nowej 24-dołkowej płytki głębokiej zawierającej 1,8 mL pożywki fermentacyjnej (szczepionka 10% v/v). Przed zaszczepieniem do każdej studzienki dodaj sterylny CaCO₃ do stężenia końcowego 4% (w/v) w celu buforowania pH.
6. Dołącz kontrolę. W każdej nowej 24-dołkowej płytce głębokiej wypełnij trzy losowo wybrane studzienki szczepem wyjściowym ATCC 7050 jako kontrolami negatywnymi. Przetraktuj je w taki sam sposób jak szczepy kandydackie.
7. Uszczelnij płytkę głębokich studzienek 24-dołkową nieprzepuszczalną membraną.
8. Inkubuj płytkę głębokich studzienek 24-dołkową. Umieść uszczelnioną płytkę w inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 50 °C i przy 200 rpm przez 24 h.
9. Przygotuj próbki do detekcji mleczanu. Wirować płytkę przy 5 842 × g przez 10 min. Przenieś 10 µL supernatantu do czarnej mikropłytki 96-dołkowej i rozcieńcz w 990 µL wody ultrapure. Wymieszaj dokładnie.
10. Dodaj sensor mleczanu. Dodaj 100 µL rozcieńczonej próbki do każdej studzienki nowej czarnej płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 100 µL sensora kwasu mlekowego. Delikatnie wymieszaj.
11. Zmierz fluorescencję. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 min (chroniąc przed światłem). Zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek z wzbudzeniem przy 485 nm i emisją przy 515 nm.
12. Wyznacz próg selekcji hitów. Oblicz średnią fluorescencję trzech studzienek kontroli wyjściowej (parent) oraz odchylenie standardowe (SD_parent). Zdefiniuj próg jako F_parent + 3 × SD_parent.
13. Zidentyfikuj hity pierwotne. Szczep kandydacki jest uważany za hit pierwotny, jeśli jego sygnał fluorescencji przekracza próg. Zapisz liczbę hitów pierwotnych do dalszej walidacji.

10. Wtórna walidacja szczepów o wysokiej wydajności

UWAGA: Faza ruchoma zawiera rozcieńczony kwas siarkowy (5 mM), który jest substancją żrącą. Należy unikać kontaktu ze skórą oraz wdychania. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny, gogle ochronne). Przygotowywanie i obchodzenie się z fazą ruchomą należy przeprowadzać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Wszystkie odpady zawierające kwas należy zbierać w dedykowanym pojemniku na odpady kwasowe w celu właściutego zagospodarowania. Nie wlewać do zlewu.

1. Przygotowanie kultury startowej. Wysiać wyselekcjonowane szczepy pierwotne na płytki z agarem z pożywką startową. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 24 h. Pobrać pojedynczą kolonię z każdej płytki i zaszczepić ją do 30 mL płynnej pożywki startowej w kolbie z wytrząsarką o pojemności 250 mL. Inkubować w temperaturze 50 °C przy 200 rpm przez 12 h.
2. Przygotowanie do fermentacji. Przygotować pożywkę fermentacyjną i dodać sterylny proszek CaCO3 do stężenia końcowego 4% (w/v) w celu neutralizacji pH. Przenieść 5 mL kultury startowej do 45 mL tej pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 mL (inakulacja 10% v/v; końcowa objętość robocza 50 mL).
   UWAGA: Użyć trzech niezależnych kolb dla każdego szczepu kandydata oraz dla szczepu rodzicielskiego ATCC 7050 jako kontroli.
3. Inkubacja kolb. Umieścić kolby w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 50 °C przy 200 rpm. Prowadzić fermentację przez 24 h.
4. Pobieranie próbek. Po 24 h pobrać 1 mL kultury z każdej kolby. Centryfugować przy 13 800 × g przez 2 min. Rozcieńczyć nadnadpłyn 100-krotnie wodą ultrapure i przefiltrować przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,22 µm.
5. Konfiguracja warunków HPLC. Użyć kolumny Aminex HPX‑87H. Przygotować fazę ruchomą: 5 mM H₂SO₄ w wodzie ultrapure, przefiltrować przez membranę 0,22 µm i odgazować za pomocą sonikacji. Ustawić temperaturę kolumny na 40 °C, szybkość przepływu na 0,6 mL/min, objętość wtrysku na 20 µL oraz czas analizy na 20 min na próbkę (kwas mlekowy eluuje w ~12,600 min). Użyć detektora współczynnika załamania światła (RID).
6. Przygotowanie krzywej wzorcowej. Rozpuścić mleczyna wapniowa w wodzie ultrapure, aby przygotować roztwory standardowe o stężeniach 0, 0,4, 0,8, 1,2 i 1,6 g/L (wyrażone jako mleczyna wapniowa). Wstrzyknąć każdy standard w trzech powtórzeniach.
   UWAGA: Wykreślić powierzchnię piku w funkcji stężenia i wyznaczyć równanie regresji liniowej (R² > 0,999). Analizować standardy na początku i na końcu każdej serii próbek, aby skorygować dryft.
7. Wtryskiwanie próbek. Wstrzyknąć przefiltrowane nadnadpłyny fermentacyjne (20 µL) do systemu HPLC. Odczytać powierzchnię piku dla mleczyny wapniowej.
   UWAGA: Wstrzyknąć próbkę kontroli jakości (1 g/L mleczyny wapniowej) co 10 próbek w celu monitorowania stabilności systemu. Akceptowalna zmiana czasu retencji wynosi <0,2 min, a zmienność powierzchni piku <5% w porównaniu ze standardem kalibracyjnym początkowym.
8. Obliczanie wydajności kwasu L-mlekowego. Przeliczyć powierzchnię piku każdej próbki na podstawie krzywej wzorcowej, aby uzyskać stężenie mleczyny wapniowej (g/L).
   UWAGA: Przeliczyć na stężenie kwasu L-mlekowego, stosując stosunek mas cząsteczkowych:
       (3)
   Obliczyć procent poprawy:
       (4)
9. Identyfikacja końcowych szczepów wysokowydajnych. Jako zwalidowane mutanty wybrać szczepy, które konsekwentnie wykazują wyższą wydajność kwasu L-mlekowego niż szczep rodzicielski. Wybrać najlepszy szczep do dalszej charakterystyki.

11. Ocena stabilności genetycznej szczepów o wysokiej wydajności

1. Wysiać wybrany szczep mutantów na płytki z agarem w pożywce startowej. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 24 h. Jest to generacja 1.
2. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki generacji 1 i zaszczepić ją do 5 mL płynnej pożywki startowej w probówce o pojemności 50 mL. Inkubować w temperaturze 50 °C przy 200 rpm przez 12 h, aby uzyskać kulturę startową F1.
3. Przenieść 10% (v/v) kultury startowej generacji 1 do 50 mL pożywki fermentacyjnej (zawierającej 4% w/v sterylnego CaCO₃) w kolbie z wytrząsaniem o pojemności 250 mL. Inkubować w temperaturze 50 °C przy 200 rpm przez 24 h.
4. Pobrać 1 mL kultury po fermentacji. Centryfugować przy 13 800 × g przez 2 min, rozcieńczyć nadfiltr 100-krotnie wodą ultrapurystyczną i zmierzyć stężenie kwasu L-mlekowego za pomocą HPLC. Użyć trzech niezależnych kolb dla każdej generacji.
5. Aby uzyskać kolejną generację, wysiać pętlą kulturę z generacji 1 na nową płytkę z agarem w pożywce startowej. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 24 h. Powtórzyć kroki 11.2 i 11.3 dla generacji 2.
6. Powtarzać proces pasażowania, aby uzyskać generację 3 i generację 4. Dla każdej generacji przygotować trzy kolby z wytrząsaniem i zmierzyć produkcję kwasu mlekowego za pomocą HPLC.
7. Porównać wydajność czterech generacji (1–4) przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA lub testu t-Studenta. Szczep uznaje się za stabilny genetycznie, jeśli pomiędzy generacjami nie zaobserwowano istotnej różnicy (p > 0,05) w produkcji kwasu mlekowego.

Wyniki

Na podstawie zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej w kroplach opracowano model przesiewania wysokoprzepustowego. Bibliotekę mutantów B. coagulans skonstruowano metodą mutagenezy ARTP przy optymalnym czasie naświetlania wynoszącym 20 s, co dało wskaźnik letalności na poziomie około 90% (Rycina 4A). Komórki mutantów zamknięto następnie w kroplach o objętości 14 pL i średnicy około 30 µm przy częstotliwości generowania 1500 Hz (Rycina 4B). Po inkubacji w temperaturze 45 °C przez 10 h, do każdej kropli wstrzyknięto sensor przy częstotliwości 200 Hz (Rycina 4C). Sortowanie kropli z aktywacją fluorescencyjną przeprowadzono przy 100 Hz przy użyciu lasera o długości fali 488 nm (Rycina 4D). Posortowane pozytywne krople poddano demulgacji, a następnie wyizolowano pojedyncze kolonie do walidacji. Wyselekcjonowane kolonie hodowano początkowo w 24-dołkowych płytkach głębokodنnych zawierających pożywkę fermentacyjną w temperaturze 50 °C i przy 200 rpm przez 24 h. Fluorescencję każdego dołka mierzono za pomocą czytnika płytek mikrodołkowych przy długościach fal wzbudzenia i emisji wynoszących odpowiednio 485 nm i 515 nm. Wybrano klony wykazujące fluorescencję wyższą niż średnia szczepu rodzicielskiego zwiększona o trzy odchylenia standardowe. Kandydaty te przeniesiono następnie do kolb z wytrząsaniem o pojemności 250 mL z 10% szczepionką i fermentowano w tych samych warunkach przez kolejne 24 h. Stężenie kwasu L-mlekowego oznaczono ostatecznie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (Rycina 4E).

Aby potwierdzić możliwość zastosowania sensora kwasu mlekowego do przesiewania szczepów produkujących duże ilości kwasu L-mlekowego, w pierwszej kolejności przeprowadzono charakterystykę sensora. W celu weryfikacji przydatności sensora kwasu mlekowego do detekcji w mikropłytkach, do płytek mikrotitracyjnych dodano standardy kwasu L-mlekowego (1, 10, 100, 1000, 10000, 100000 µM), a do każdej dołki dodano 100 µL mieszaniny sensora kwasu mlekowego. Wyniki wykazały, że intensywność fluorescencji wzrastała wraz ze wzrostem stężenia kwasu mlekowego w zakresie od 100 µM do 10 mM. Sensor wykazał silne odpowiedzi fluorescencyjne na kwas L-mlekowy (Rysunek 5A). Niemniej jednak, pozostaje on w pełni odpowiedni do niniejszego badania z dwóch powodów. Po pierwsze, B. coagulans ATCC 7050 jest dobrze scharakteryzowanym producentem kwasu L-mlekowego z pomijalną ilością tworzonego kwasu D-mlekowego, co potwierdzono poprzez profil metaboliczny zdominowany przez L-LDH. Po drugie, dokładność sensora w oznaczaniu ilości kwasu L-mlekowego w rzeczywistych próbkach fermentacyjnych została zweryfikowana poprzez porównanie z HPLC (Rysunek 5B). Zatem, pomimo reaktywności krzyżowej in vitro z kwasem D-mlekowym, sensor wiarygodnie raportuje poziomy kwasu L-mlekowego w naszym procesie przesiewania. Aby potwierdzić możliwość ilościowego wykrywania kwasu mlekowego za pomocą sensora, zmierzono stopień odzysku sensora zarówno w roztworze wodnym, jak i w podłożu przesiewającym. Wyniki wykazały wysoką wartość odzysku, odpowiednio 108,81% w podłożu przesiewającym i 98,39% w roztworze wodnym, przy względnych odchyleniach standardowych < 5% (Rysunek 5C). Lekki wzrost w podłożu mieści się w dopuszczalnym zakresie 90–110%, co wskazuje na brak istotnych zakłóceń matrycowych. W analizach na mikropłytkach sensor mieszano w stosunku 1:1 ze standardami kwasu L-mlekowego, inkubowano przez 5 min, co wykazało doskonałą liniowość w zakresie 0–0,6 g/L (Rysunek 5D). Co więcej, metoda fluorescencyjna umożliwiła detekcję 96 próbek w 5 min, co stanowi 384-krotne skrócenie całkowitego czasu detekcji w porównaniu z HPLC. Aby dalej potwierdzić przydatność sensora kwasu mlekowego w przesiewaniu opartym na kropelkach, przygotowano kropelki zawierające kwas L-mlekowy w różnych stężeniach, a następnie do każdej kropelki wstrzyknięto za pomocą piko-iniekcji równą objętość sensora kwasu mlekowego. Intensywność fluorescencji kropelek wykryto za pomocą zautomatyzowanej mikrofluidycznej platformy kroplkowej. Wyniki wykazały znaczące przesunięcie sygnału fluorescencji w prawo wraz ze wzrostem stężenia kwasu L-mlekowego (Rysunek 5E). Do przechowywania sensor laktatu uzupełniono 5% glicerolem i przechowywano w temperaturze -80 °C, co pozwoliło zachować stabilność detekcji przez co najmniej jeden miesiąc (Rysunek uzupełniający 6).

Oprócz wyboru odpowiedniego sensora do hodowli z wykorzystaniem technologii FADS, kluczowe jest określenie optymalnego czasu hodowli szczepów w kropelkach. Zbyt krótki czas hodowli może prowadzić do niewystarczającej sekrecji kwasu L-mlekowego, co skutkuje niskimi sygnałami fluorescencji, które nie pozwalają na odróżnienie szczepów o wysokiej i niskiej wydajności. Z kolei zbyt długi czas hodowli może spowodować nadmierną akumulację kwasu L-mlekowego, przekraczającą zakres detekcji sensora kwasu mlekowego. Aby rozwiązać ten problem, czas hodowli szczepów w kropelkach zoptymalizowano poprzez dynamiczne monitorowanie stanu ich wzrostu. Szczepy weszły w fazę wzrostu logarytmicznego po 6 h hodowli w kropelkach, a biomasa bakteryjna w kropelkach wzrosła znacząco w 10 h (Rycyna 6A). W przeciwieństwie do tego, gdy czas hodowli przekroczył 12 h, kropelki wykazały wyraźne obkurczanie się. Zjawisko to przypisuje się zmianom ciśnienia osmotycznego wewnątrz kropelek w późnej fazie wzrostu szczepów, co indukuje ich kurczenie się. Taki proces może prowadzić do niespójnych objętości pikoiniekcji między poszczególnymi kropelkami w kolejnych doświadczeniach. Aby określić optymalny czas hodowli, do kropelek hodowanych przez różne okresy wstrzyknięto równą objętość sensora kwasu mlekowego. Stwierdzono, że sygnał fluorescencji kropelek uległ znacznemu wzmocnieniu po 10 h hodowli; w związku z tym 10 h wybrano jako optymalny czas hodowli szczepów w kropelkach (Rycyna 6B).

W jednej rundzie przesiewania krople zostały następnie posortowane za pomocą chipa sortującego z częstotliwością 100 Hz przez 4 h, a zebrano 0,1% kropli o najwyższej intensywności fluorescencji (Rycyna 6C). Pozytywne krople zebrano do sterylnej probówki i potraktowano 500 µL demulgatora oraz 500 µL świeżej pożywki startowej. Po delikatnym wytrząsaniu przez 5 min pobrano 20 µL górnej fazy wodnej, rozcieńczono 10-krotnie i wypościano na dwie stałe płytki agarowe. Po inkubacji w temperaturze 50 °C przez 2 dni losowo wybrano 200 pojedynczych kolonii i zaszczepiono je do 24-dołkowych płytek głębokich w celu hodowli ekspansyjnej. spośród 200 hodowanych klonów 78 szczepów mutantów wykazało wyższe wydajności kwasu L-mlekowego niż szczep rodzicielski (Rycina uzupełniająca 7). Te 78 mutantów poddano następnie walidacji w kolbach z wytrząsaniem, w wyniku czego ostatecznie uzyskano 17 szczepów o poprawionych wydajnościach w porównaniu ze szczepem rodzicielskim. Wśród nich mutant ADC-17 wykazał największy wzrost, z 57,2 g/L do 67,04 g/L, co stanowi poprawę o 17,2% (Rycina 6D). Stabilność genetyczną ADC-17 oceniano przez cztery kolejne pokolenia. Nie zaobserwowano istotnych różnic między czterema pokoleniami (p > 0,05), co wskazuje, że cecha wysokiej wydajności ADC-17 pozostała stabilna przez cztery kolejne subkultury (Rycina 6E). Wyniki te demonstrują efektywność i niezawodność platformy FADS, która wykorzystuje sensor kwasu mlekowego do wzbogacania szczepów o wysokiej wydajności z bibliotek mutantów losowych w jednej rundzie przesiewania.

Rysunek 1: Budowa zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropel. (A) Wewnętrzna struktura platformy. Składa się ona z czterech głównych modułów: sterowania przepływem opartego na ciśnieniu, wysokoprędkościowego obrazowania CMOS, detekcji fluorescencji dwulaserowej 488 nm/633 nm oraz systemu sterowania nadrzędnego do manipulacji kropelkami i wyjści danych. (B) Platforma operacyjna zautomatyzowanej platformy mikroprzepływowej do kropel. Oznaczone komponenty obejmują: a. Platformę pozycjonującą, b. Kamerę wysokoprędkościową, c. Elektrody chipa, d. Zacisk mocujący chip, e. Gniazdo do umieszczania chipa, f. Kąpiel metalową, g. Pompę powietrzną 1: steruje fazą olejową, h. Pompę powietrzną 2: steruje próbką. Pompa powietrzna 3: steruje wstrzykiwaniem odczynników. Rysunek 1A został przygotowany za pomocą Biorender, zgodnie z udzieloną licencją autorską. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Materiały eksploatacyjne do eksperymentu. (A) Probówka do wstrzykiwania: do wprowadzania fazy olejowej, zawiesiny bakterii z próbki oraz roztworu odczynnika. (B) Probówka do zbierania: do zbierania kropel i późniejszej inkubacji. (C) Chip do przygotowania kropel: generuje krople o objętości 14 pL. (D) Chip do mikroiniekcji kropel: służy do mikroiniekcji odczynników do kropel. (E) Chip do sortowania kropel: sortuje szczepy pozytywne za pomocą elektrod. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Główne interfejsy oprogramowania zautomatyzowanej platformy mikrofluidyki kropelkowej. (A) Wprowadzenie do interfejsu oprogramowania do generowania kropelek. A. Start: Kliknij, aby rozpocząć generowanie kropelek. B. Speed: Regulacja szybkości generowania kropelek. C. Size: Regulacja objętości kropelki. D. Stop: Kliknij, aby zatrzymać generowanie kropelek. (B) Interfejs piko-iniekcji kropelkowej. E. Injection volume: Regulacja objętości wstrzykiwanego odczynnika. F. Fusion force: Trzy poziomy napięcia (High/Medium/Low). (C) Wprowadzenie do interfejsu sortowania kropelek. G. Laser: Wybór typu lasera (488 nm lub 633 nm). H. Rejestracja danych. I. Deflection Force: Trzy poziomy napięcia (High/Medium/Low). J. Przełącznik sortowania: Kliknij, aby rozpocząć sortowanie kropelek. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przebieg wysokoprzepustowego przesiewania opartego na zautomatyzowanej platformie mikroprzepływowej do kropli. (A) Konstrukcja biblioteki mutantów poprzez mutogenezę ARTP. (B) Generowanie i inkubacja kropli. Pojedyncze komórki są wydzielane do kropli o objętości pikolitrowej. (C). Pikowstrzykiwanie do kropli. Do każdej kropli wstrzyknięto fluorescencyjny sensor. (D) Sortowanie kropli. Krople o wysokiej fluorescencji (wskazujące na wysoką produkcję kwasu L-mlekowego) są wzbogacane za pomocą FADS. (E) Walidacja pozytywnych klonów w mikropłytkach i kolbach z wytrząsaniem. Skrót; FADS = Fluorescence‑Activated Droplet Sorting. Rysunek 4 został stworzony w programie Biorender, a licencja autorska została dostarczona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Charakterystyka sensora kwasu mlekowego in vitro. (A) Zakres odpowiedzi sensora kwasu mlekowego na kwas L-mlekowy. Wzbudzenie/Emisja = 485/515 nm. Średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów (n = 3, każdy z potrójnymi powtórzeniami technicznymi). (B) Korelacja z HPLC. Sześć próbek z fermentacji (z różnych punktów czasowych) zostało przeanalizowanych pojedynczo zarówno za pomocą sensora mleczanowego, jak i HPLC. Regresja liniowa wykazała R² = 0,9927. Wzbudzenie/Emisja = 485/515 nm. (C) Eksperyment odzysku kwasu mlekowego. Kwas L-mlekowy dodano do wody ultrapurej i pożywki przesiewowej w stężeniu 0,5 g/L. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 3 niezależne eksperymenty). Odzyski wyniosły 98,39% (woda) i 108,81% (pożywka przesiewowa), przy STD < 5%. Wzbudzenie/Emisja = 485/515 nm. (D) Optymalizacja czasu detekcji. Sensor zmieszano ze standardami kwasu L-mlekowego (0–0,6 g/L) i inkubowano przez 0, 5, 10, 15, 20, 25 i 30 min. Najwyższą wartość R² = 0,990 uzyskano po 5 min mieszania. Dane pochodzą z trzech niezależnych eksperymentów (n = 3). Wzbudzenie/Emisja = 485/515 nm. (E) Histogram fluorescencji kropli. Przeanalizowano co najmniej 2000 kropli dla każdego stężenia kwasu L-mlekowego. Kanał detekcji: 488 nm, DC (V) = sygnał napięcia reprezentujący intensywność fluorescencji kropli. Skrót; STD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 6: Przesiewy wysokoprzepustowe szczepów B.coagulans o wysokiej produkcji kwasu L-mlekowego. (A) Obserwowano morfologię szczepów wewnątrz kropelek w czasie 0, 2, 4, 6, 8 i 10 h. Pasek skali: 20 µm. Czas ekspozycji: 100 ms. (B) Zmiany intensywności fluorescencji kropelek zawierających B. coagulans po inkubacji przez różny czas, po wstrzyknięciu sensora kwasu mlekowego. Obrazy uzyskano przy czasie ekspozycji 2000 ms i wzmocnieniu 1500%. Pasek skali: 50 µm. (C) Rozkład intensywności fluorescencji kropelek. Próg przesiewowy: intensywność FL > 2750 (a.u.). Kanał detekcji: 488 nm (D) Wydajność kwasu L-mlekowego (g/L) szczepu wyjściowego (ATCC 7050) oraz reprezentatywnych mutantów pozytywnych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 niezależne kolby z wytrząsaniem na szczep). ****p < 0,0001 w porównaniu ze szczepem wyjściowym. Najlepiej wydajny mutant, ADC-17, wykazuje wzrost o 17,2%. (E) Stabilność genetyczna najwyższej wydajności B. coagulans ADC-17 w ciągu czterech kolejnych pokoleń (1–4). Wydajność kwasu L-mlekowego określono metodą HPLC po 24 h fermentacji w kolbach z wytrząsaniem. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 kolby na pokolenie). Jednoczynnikowa analiza ANOVA nie wykazała istotnych różnic między pokoleniami (p > 0,05, ns). Skróty: HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; SD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Oczyszczanie sensora mleczanu eLACCO1.1. Białko eluowano przy użyciu 500 mM imidazolu i przechowywano w temperaturze -80 °C w 5% glicerolu. Stężenie robocze wynosi 0,1 mg/mL, a granica wykrywalności wynosi 2 mg/L. Rycina uzupełniająca 1 została w całości odtworzona przez autorów przy użyciu wyłącznie natywnych narzędzi rysunkowych w programie Microsoft PowerPoint (w tym podstawowych kształtów, linii i pól tekstowych). Nie użyto żadnych ikon zewnętrznych, szablonów ani zewnętrznych źródeł obrazów. Wszystkie elementy są oryginalnymi tworami autorów. W związku z tym rycina ta nie wymaga żadnej dodatkowej licencji publikacyjnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Krzywa wzrostu B. coagulans ATCC 7050. Szczep hodowano w pożywce startowej w temperaturze 50 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 niezależne hodowle). Hodowla osiągnęła późną fazę logarytmiczną po około 12 h; punkt czasowy ten wykorzystano do przygotowania inokulum w kolejnych eksperymentach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Krzywa kalibracyjna OD₆₀₀ w funkcji stężenia żywych komórek dla B. coagulans ATCC 7050. Przygotowano rozcieńczenia szeregowe kultury w środkowej fazie logarytmicznej i zmierzono OD₆₀₀. Odpowiadające im jednostki tworzące kolonie (CFU/mL) określono poprzez wysianie 100 µL odpowiednich rozcieńczeń na płytki z agarem w pożywce podstawowej i inkubację w temperaturze 50 °C przez 24 h. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 niezależne eksperymenty). Zgodnie z tą krzywą, OD₆₀₀ = 0,5 odpowiada około 1 × 10⁸ CFU/mL. Kalibrację tę wykorzystano do określenia początkowej gęstości komórek do enkapsulacji w kropelkach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Krzywa śmiertelności B. coagulans ATCC 7050 podczas mutagenezy ARTP. Komórki poddano działaniu plazmy helowej przez różne okresy czasu (5, 10, 15, 20, 25, 30 s). Po napromieniowaniu komórki wysiano na agar z pożywką startową, a CFU policzono po 24 h inkubacji w 50 °C. Śmiertelność (%) obliczono zgodnie z równaniem (2). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 niezależne powtórzenia). Strzałka wskazuje wybrany czas mutagenezy (20 s) przy wskaźniku śmiertelności wynoszącym około 90%. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Wyznaczenie wydajności enkapsulacji pojedynczych komórek za pomocą barwienia DAPI. B. coagulans ATCC 7050 poddano barwieniu DAPI i enkapsulowano w kropelkach przy λ = 0,1. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zbadano łącznie 2000 kropelek, zliczając liczbę kropelek zawierających 0, 1 lub ≥2 komórki. Obserwowana wydajność enkapsulacji pojedynczych komórek wyniosła 11,2%, co jest wartością nieco wyższą od teoretycznego oczekiwania Poissona (9,0% dla λ = 0,1). Odchylenie to przypisuje się czynnikom takim jak aktywna dyspersja komórek, niespecyficzne barwienie DAPI uszkodzonych komórek oraz rozpad małych agregatów pod wpływem sił ścinania podczas formowania kropelek. Pasek skali: 30 µm. Przeanalizowano co najmniej 2000 mikrokropelek. Obrazy pozyskano przy czasie ekspozycji 2000 ms i wzmocnieniu 1500%. Skrót; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Stabilność przechowywania sensora.  Przedstawiono odpowiedź fluorescencyjną sensora przechowywanego w temperaturze -80 °C z 5% glicerolem przez cztery tygodnie. Nie zaobserwowano istotnego spadku sygnału, co potwierdza dobrą stabilność przechowywania (p > 0.05). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 7: Wyniki wstępnego przesiewu 78 szczepów wykazujących wyższą produkcję kwasu mlekowego niż szczep kontrolny w płytkach głębokoprzestrzennych. W ramach tego wstępnego przesiewu zidentyfikowano łącznie 78 szczepów mutantów, których wydajność produkcji L-kwasu mlekowego przekraczała wydajność szczepu rodzicielskiego. Wszystkie dane dotyczące szczepów mutantów przedstawiają wyniki przesiewu jednopunktowego bez powtórzeń biologicznych. Szczep rodzicielski (kontrola) został rozmieszczony losowo w 24 płytkach głębokoprzestrzennych jako punkt odniesienia, a jego dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych powtórzeń w 24-dołkowych płytkach głębokoprzestrzennych (n = 3). Oś Y przedstawia wydajność L-kwasu mlekowego (g/L) dla każdego szczepu na osi X; słupki błędów wyświetlono wyłącznie dla kontrolnego szczepu rodzicielskiego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ten protokół przedstawia standaryzowany proces przesiewowy mikroorganizmów przemysłowych oparty na zautomatyzowanej platformie mikrokropelkowej. Zintegrowany proces obejmuje budowę bibliotek mutantów, generowanie kropel i enkapsulację jednokomórkową, hodowlę w mikroreaktorach, wstrzyknięcie bioczujników, sortowanie kropel z aktywacją fluorescencji i ostateczną weryfikację docelowych szczepów. Wykorzystując wysokowydajne przesiewanie o wysokiej wydajności produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako przypadek walidacji, ten proces wykazał wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami przesiewowymi na płytkach mikrofalowych i agarowych w kontekście ulepszania szczepów B. coagulans. Pod względem wydajności i efektywności przesiewania, platforma wykorzystuje układy mikrofluidalne do generowania i przetwarzania tysięcy do dziesiątek tysięcy kropel na sekundę równolegle, osiągając około 10⁴-krotne zwiększenie wydajności przesiewu w jednej rundzie w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na płytkach mikrofalowych¹². W przypadku B. coagulans proces może przesiewać 10⁶ kropel w ciągu 4 godzin, skracając cykl rozwoju szczepów z kilku tygodni do zaledwie kilku dni i znacznie przyspieszając proces hodowli. Skuteczność przesiewu systemu FADS jest około 3 × 10³ razy wyższa niż w przypadku systemu przesiewowego opartego na płytkach, przy jednoczesnym znacznym obniżeniu kosztów infrastruktury, pracy i materiałów eksploatacyjnych¹³. Jednak ze względu na właściwości poszczególnych mikroorganizmów, wymagana jest dostosowanie tego standardowego procesu. Na przykład po 36 godzinach hodowli drożdży, zmiany w ciśnieniu osmotycznym prowadzą do zmniejszenia objętości kropli, co wymaga dostosowania czasu inkubacji, aby zapewnić stabilność operacji wstrzykiwania i sortowania¹⁴. W przypadku grzybów nitkowatych, zwykle konieczne jest zwiększenie objętości kropli, aby zapobiec pękaniu lub łączeniu się interfejsu kropli z powodu wzrostu grzybni^15,16.

Ponadto, ze względu na bardzo małą objętość kropli skalowanej do pikolitów, konieczne jest opracowanie dostosowanych fluoroforowych bioczujników dla każdego docelowego produktu. Kilka klasycznych fluoroforowych środków wykrywających do proteaz i małych metabolitów jest już dostępnych komercyjnie, takich jak te dla nadtlenku wodoru¹⁷, glikozydaz¹⁸, etanolu¹⁹ i glukozy²⁰. Niemniej jednak, chemicznie syntetyzowane fluorofory mają ograniczone typy i mają tendencję do wycieku z kropel do sąsiednich pustych kropel, co prowadzi do podniesienia poziomu tlenu tlenu. Jest to głównie spowodowane tym, że hydrofobowe fluorofory mogą łatwo penetrować interfejs olej-woda²¹.

W ostatnich latach bioczujniki obejmują głównie dwa typy: genetycznie kodowane bioczujniki i bioczujniki oparte na czynnikach transkrypcyjnych (TF). Genetycznie kodowane fluorescencyjne bioczujniki odnoszą się do chimerycznych białek, które mogą być wyrażane wewnątrzkomórkowo i projektowane tak, aby służyć jako czujniki do monitorowania sygnałtransdukcji in vivo. Ze względu na doskonałą stabilność, szybką fluorescencyjną reakcję i wysoką specyficzność, genetycznie kodowane fluorescencyjne bioczujniki były stosowane w wielu scenariuszach²². Zespół zastosował intensywnościowy reporter fluorescencyjny oparty na glutaminianie (iGluSnFR) w układzie sortowania kropel mikrofluidalnych, ustanawiając wysokowydajny proces przesiewowy mutantów Bacillus amyloliquefaciens o zwiększonej produkcji glutaminazy. Ta platforma oparta na bioczujnikach umożliwiła 56-krotny wskaźnik wzbogacania i ostatecznie wyizolowała wariant o ponad 47% wzroście produkcji glutaminazy z biblioteki mutantów o liczbie 10⁵ pełnego genomu²³.

Bioczujniki całokomórkowe oparte na czynnikach transkrypcyjnych (TF) są ważną klasą całokomórkowych bioczujników, zbudowanych wokół czynników transkrypcyjnych. Czynniki transkrypcyjne są klasą białek, które regulują ekspresję genów poprzez wiązanie się z określonymi sekwencjami DNA¹⁴. Niektóre czynniki transkrypcyjne są aktywowane po związaniu z metabolitami lub związkami obcymi; nazywane są one alosterycznymi czynnikami transkrypcyjnymi (aTFs). Po aktywacji aTFs przechodzą zmiany konformacyjne, które z kolei prowadzą do ich oderwania lub wiązania się z sekwencją DNA znajdującą się w górę strumieni do genów docelowych, aktywując lub hamując ekspresję tych genów. Czynniki transkrypcyjne mogą być łączone z innymi elementami DNA powszechnie stosowanymi w syntetycznej biologii (takimi jak promotory, miejsca wiązania rybosomów, terminatory i geny reporterowe) w celu zbudowania obwodów genetycznych opartych na TF. Te elementy genetyczne mogą wykrywać stężenie różnych ligandów w komórce lub środowisku i odpowiadać odpowiednio²⁴. Wykrywanie erytrytolu zostało pomyślnie zaimplementowane za

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Do przygotowania płyt litych
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Wycieranie i dezynfekcja blatów laboratoryjnych i urządzeń
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  został zastosowany do konstrukcji biblioteki mutantów w celu mutageneza szczepów.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 został użyty jako szczep wyjściowy do mutageneza i cel do wysokowydajnego przesiewania kropel.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	96-dołkowa czarna płytka mikroskoliczna była używana do testów czujników mlekonianu i oznaczania stężenia kwasu mlekowego.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Do izolacji hiperproducentów L-kwasu mlekowego.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	Chlorku wapnia używano do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Używane jako próbki do przygotowania krzywej standardowej w procesie wykrywania.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Używany do rozcieńczania płynu bakteryjnego
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Do pobierania kropel i późniejszego uprawu
Computer	Lenovo	E450	Instalacja oprogramowania i sterowanie komórką DREM.
DAPI	Solarbio	c0065	Do barwienia komórek.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Do początkowej weryfikacji wydajności mutantów B. coagulans przy użyciu głębokich płytek dołkowych
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	Demulgator kropli służy do rozbijania mikrodrobin wody w oleju i uwalniania komórek wewnętrznych, szczepów lub supernatantu do dalszego wykrywania i analizy.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glukoza jest używana do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	Wodoroortofosforan diamonowy jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	Bezwodny wodoroortofosforan dipotasu jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Do sterowania instrumentem DREM Cell. Oprogramowanie DREM jest programem komercyjnym wyłącznie dla instrumentu DREM Cell firmy Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Nie ma publicznego oficjalnego dostępu ani URL do pobrania i jest dystrybuowane tylko wraz z urządzeniem na podstawie autoryzacji.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Był używany do wysokowydajnego pojedynczego zamknięcia komórek i sortowania, aby szybko przesiewać wysokowydajne szczepy z biblioteki mutantów.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Chip do generowania kropel jest używany do produkcji jednorodnych kropel skalowania pikolitera (pL) do pojedynczego zamknięcia komórek.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Mikroiniekcyjny chip kropli jest używany do osiągnięcia precyzyjnego i śladowego wtrysku reagentów do wstępnie uformowanych kropel na potrzeby późniejszych reakcji biochemicznych.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Chip do sortowania kropel jest używany do sortowania docelowych kropel zawierających komórki wysokowydajne na podstawie sygnałów fluorescencyjnych.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Służy do weryfikacji uprawy skalowania mutantów B. coagulans po wstępnym przesiewaniu za pomocą głębokich płytek, aby potwierdzić stabilność i powtarzalność wysokowydajnych szczepów.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Używany do filtracji bulionu fermentacyjnego.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	Mikroskop fluorescencyjny Olympus IX73 był używany do obserwacji morfologii bakterii wewnątrz kropel
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	Olej fluorowany służy jako faza ciągła w mikrofluidyce kropel do generowania stabilnych, jednorodnych i nieinterferujących mikrodrobin wody w oleju, wspierających hodowlę i przesiewanie pojedynczych komórek.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Służy do separacji kwasu mlekowego od innych składników w bulionie fermentacyjnym według różnych właściwości retencji, aby osiągnąć dokładne ilościowe wykrywanie kwasu mlekowego.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	HPLC