Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przemysłowe bioprodukowanie opiera się na mikroorganizmach do wydajnego syntetyzowaniu produktów docelowych w inżynieryzowanych warunkach. Jednak szczepy dzikiego typu często nie mają zdolności do tego, z powodu ich rodzimych sieci metabolicznych. Dlatego szybkie i dokładne przesiewanie wysokowydajnych szczepów z dużych bibliotek mutantów jest kluczowymi krokiem w przemysłowej hodowli mikroorganizmów. W ostatnich latach technologia mikrofluidyki kroplowej przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na swoją wysoką przepustowość, niski zużycie i zdolności do kompartmentalizacji pojedynczych komórek, co doprowadziło do opracowania licznych systemów sortowania pojedynczych komórek. W niniejszej pracy przedstawiono protokół przesiewania wysokowydajnego dla mikroorganizmów przemysłowych przy użyciu zautomatyzowanej platformy mikrofluidyki kroplowej. Zintegrowany przepływ pracy obejmuje cztery kluczowe etapy: budowę biblioteki mutantów poprzez mutagenezę plazmą atmosferyczną i plazmą w temperaturze pokojowej (ARTP); wysokowydajne enkapsulację pojedynczych komórek i kontrolowane mikrohodowlę w kroplach skalii pikoliterowe; precyzyjne mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnego bioczujnika, a następnie sortowanie kropli aktywowanych fluorescencyjnie (FADS), aby odizolować krople zawierające wysokowydajne warianty; oraz walidację posortowanych kandydackich szczepów poprzez fermentację w płytkach mikrotypowych i w flaszy wstrząsającej. Pełny i zintegrowany przepływ pracy przesiewania jest przeznaczony jako znormalizowany szablon, a jego walidacja jest demonstrowana poprzez odizolowanie mutantów wysokowydajnych w produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako konkretnego przykładu. Ta zautomatyzowana platforma przesiewania wysokowydajnego oferuje potężne rozwiązanie techniczne z znacznym potencjałem przyspieszenia przemysłowej hodowli wysokowydajnych szczepów.
Wprowadzenie
Biotechnologia przemysłowa wykorzystuje mikroorganizmy i enzymy jako biokatalizatory do produkcji cennych produktów na dużą skalę. Takie podejście jest uważane za bardziej przyjazne dla środowiska i efektywne niż tradycyjna produkcja chemiczna. Jednak naturalne sieci metaboliczne mikroorganizmów ewoluowały, aby priorytetowo dbać o ich przetrwanie i rozmnażanie, a nie o efektywną syntezę produktów pożądanych przez ludzi. W rezultacie, wysokowydajna hodowla mikrobiologiczna jest często konieczna, aby sprostać wymogom środowiska produkcyjnego przemysłowego z rygorystycznymi warunkami1,2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zatwierdzenie etyczne nie było wymagane dla niniejszego badania. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem czystych kultur drobnoustrojów; w badaniu nie uczestniczyli ludzie ani zwierzęta laboratoryjne. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów wykorzystanych w poniższym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowania
UWAGA: Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa biologicznego. B. coagulans jest organizmem z grupy 1 poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Należy nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Wszystkie manipulacje w otwartych naczy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W oparciu o zautomatyzowaną mikrofluidyczną platformę kropelkową opracowano model wysokoprzepustowego przesiewania. Bibliotekę mutantów B. coagulans stworzono metodą mutagenezy ARTP przy optymalnym czasie naświetlania wynoszącym 20 s, co dało wskaźnik śmiertelności na poziomie około 90% (Rysunek 4A). Komórki mutantów zamknięto następnie w kropelkach o objętości 14 pL i średnicy około 30 µm, przy częstotliwości generowania 1500 Hz (Rysunek 4B). Po inkubacji w tempera.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten protokół przedstawia standaryzowany proces przesiewowy mikroorganizmów przemysłowych oparty na zautomatyzowanej platformie mikrokropelkowej. Zintegrowany proces obejmuje budowę bibliotek mutantów, generowanie kropel i enkapsulację jednokomórkową, hodowlę w mikroreaktorach, wstrzyknięcie bioczujników, sortowanie kropel z aktywacją fluorescencji i ostateczną weryfikację docelowych szczepów. Wykorzystując wysokowydajne przesiewanie o wysokiej wydajności produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako przy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Xiaojie Guo i Liyan Wang są pracownikami Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., które produkuje zautomatyzowany mikrofluidyczny system kropelkowy i mikroczipy użyte w tym badaniu. Firma deklaruje, że nie ma żadnych konfliktów interesów w związku z tą pracą i nie miała wpływu na projekt badania, zbieranie danych, analizę, interpretację czy przygotowanie manuskryptu. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Narodowy Program Nauki i Technologii dla Zaawansowanych Materiałów (Grant nr 2024ZD0603600). Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez Program S&T Guangdong (Grant nr 2024B1111130002).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214030 | Do przygotowania płyt litych |
| Anhydrous Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | Wycieranie i dezynfekcja blatów laboratoryjnych i urządzeń |
| Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-002 | ARTP został zastosowany do konstrukcji biblioteki mutantów w celu mutageneza szczepów. |
| B. coagulans | Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC | 1511C0004000002355 | B. coagulans ATCC 7050 został użyty jako szczep wyjściowy do mutageneza i cel do wysokowydajnego przesiewania kropel. |
| Black microplate (96 well) | Corning | 3925 | 96-dołkowa czarna płytka mikroskoliczna była używana do testów czujników mlekonianu i oznaczania stężenia kwasu mlekowego. |
| Calcium carbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20011062 | Do izolacji hiperproducentów L-kwasu mlekowego. |
| Calcium chloride | Sinopharm | 10005819 | Chlorku wapnia używano do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów. |
| Calcium L-lactate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69027528 | Używane jako próbki do przygotowania krzywej standardowej w procesie wykrywania. |
| Centrifuge tube (15 mL) | Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd | HB53397 | Używany do rozcieńczania płynu bakteryjnego |
| Collection tube | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell-CL | Do pobierania kropel i późniejszego uprawu |
| Computer | Lenovo | E450 | Instalacja oprogramowania i sterowanie komórką DREM. |
| DAPI | Solarbio | c0065 | Do barwienia komórek. |
| Deep-well plate (24-well) | BKMAMLAB | 110424008 | Do początkowej weryfikacji wydajności mutantów B. coagulans przy użyciu głębokich płytek dołkowych |
| Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol) | MACKLIN | H817022 | Demulgator kropli służy do rozbijania mikrodrobin wody w oleju i uwalniania komórek wewnętrznych, szczepów lub supernatantu do dalszego wykrywania i analizy. |
| D-Glucose | Solarbio | G8150-1000 | D-Glukoza jest używana do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów. |
| Diammonium hydrogen citrate | Solarbio | D9950 | Wodoroortofosforan diamonowy jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów. |
| Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | P8281 | Bezwodny wodoroortofosforan dipotasu jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów. |
| DREM Software version | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell v02.01.18 | Do sterowania instrumentem DREM Cell. Oprogramowanie DREM jest programem komercyjnym wyłącznie dla instrumentu DREM Cell firmy Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Nie ma publicznego oficjalnego dostępu ani URL do pobrania i jest dystrybuowane tylko wraz z urządzeniem na podstawie autoryzacji. |
| Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-027 | Był używany do wysokowydajnego pojedynczego zamknięcia komórek i sortowania, aby szybko przesiewać wysokowydajne szczepy z biblioteki mutantów. |
| Droplet generation chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-009 | Chip do generowania kropel jest używany do produkcji jednorodnych kropel skalowania pikolitera (pL) do pojedynczego zamknięcia komórek. |
| Droplet injection chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-003 | Mikroiniekcyjny chip kropli jest używany do osiągnięcia precyzyjnego i śladowego wtrysku reagentów do wstępnie uformowanych kropel na potrzeby późniejszych reakcji biochemicznych. |
| Droplet sorting chip | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-002 | Chip do sortowania kropel jest używany do sortowania docelowych kropel zawierających komórki wysokowydajne na podstawie sygnałów fluorescencyjnych. |
| Erlenmeyer shake flask (250 mL) | Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd. | B-001006 | Służy do weryfikacji uprawy skalowania mutantów B. coagulans po wstępnym przesiewaniu za pomocą głębokich płytek, aby potwierdzić stabilność i powtarzalność wysokowydajnych szczepów. |
| Filter Membranes (0.22 μm) | Merck | SLGPR33RB | Używany do filtracji bulionu fermentacyjnego. |
| Fluorescence inverted microscope | Olympus | IX73 | Mikroskop fluorescencyjny Olympus IX73 był używany do obserwacji morfologii bakterii wewnątrz kropel |
| Fluorinated Oil | Bio-Rad | 1864006 | Olej fluorowany służy jako faza ciągła w mikrofluidyce kropel do generowania stabilnych, jednorodnych i nieinterferujących mikrodrobin wody w oleju, wspierających hodowlę i przesiewanie pojedynczych komórek. |
| High Performance Liquid Chromatography column | Bio-Rad | Bio-Rad Aminex HPX-87 | Służy do separacji kwasu mlekowego od innych składników w bulionie fermentacyjnym według różnych właściwości retencji, aby osiągnąć dokładne ilościowe wykrywanie kwasu mlekowego. |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu | 228-34001-02 | HPLC |
Bibliografia
- Zeng W, et al. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends Biotechnol. 2020;38(8):888-906.
- Sarnaik A, et al. High-throughput screening for efficient microbial biotechnology. Curr Opin Biotechnol. 2020;64:141-150.
- Li Z-H, et al. The advances of strategies and technologies in high-throughput microbial culturomics. Biotechnol Adv. 2026;87:108783.
- Zhou S, Alper HS. Strategies for directed and adapted evolution as part of microbial strain engineering. J Chem Technol Biotechnol. 2019;94(2):366-376.
- Xu L, Guo M, Jiang D, Jiang J, Lu L. Advances in high-throughput mutation breeding systems integrating atmospheric and room....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
