Niniejszy protokół przedstawia znormalizowany i powtarzalny schemat postępowania w celu oceny zdolności proliferacyjnej oraz różnicowania osteogennego i odontogennego ludzkich komórek macierzystych zębów hodowanych na rusztowaniach z nanomateriałów, z wykorzystaniem standaryzowanych testów (aktywność ALP, immunofluorescencja RANKL [osteogenna] oraz immunofluorescencja DMP-1 [odontogenna]) i strategii normalizacji, aby zapewnić porównywalność między badaniami.
Artykuł metodologiczny
Znormalizowany protokół in vitro oceny różnicowania i proliferacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba na rusztowaniach z nanomateriałów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niezawodna ocena różnicowania osteogenicznego i odontogenicznego, a także proliferacji komórek macierzystych, jest kluczowa dla oceny wydajności biologicznej strategii regeneracyjnych opartych na rusztowaniach. Jednak zmienność protokołów eksperymentalnych, doboru testów i interpretacji danych często ogranicza powtarzalność i możliwość porównywania badań. Protokół opisany w niniejszym artykule przedstawia ustandaryzowany, powtarzalny schemat postępowania dla oceny in vitro różnicowania osteogenicznego i odontogenicznego, a także zdolności proliferacyjnej komórek macierzystych hodowanych na rusztowaniach z biomateriałów. Kierowanie różnicowaniem w stronę osteogeniczną ocenia się poprzez aktywność enzymatyczną fosfatazy zasadowej (ALP) oraz immunofluorescencję liganda receptora aktywatora jądrowego czynnika κB (RANKL), natomiast różnicowanie odontogeniczne ocenia się za pomocą immunofluorescencji DMP-1 (białka macierzy dentynowej-1); oba punkty końcowe białkowe są ilościowo określane przy użyciu ustandaryzowanej metodologii H-score. Szczegółowo omówiono krytyczne parametry eksperymentalne, w tym gęstość zasiewu komórek, harmonogramy indukcji, warunki przeprowadzania testów, strategie normalizacji (w tym aktywność ALP znormalizowaną względem białka, żywotność MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliu] znormalizowaną względem liczby komórek oraz H-score immunofluorescencji) i podejścia do analizy danych, wraz ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów w celu zminimalizowania zmienności technicznej. Metodologia ta została zastosowana jako ustandaryzowane ramy w wielu badaniach eksperymentalnych opartych na rusztowaniach, wykazując wysoką odporność i powtarzalność. Poprzez dostarczenie kompleksowych, zwalidowanych ram, artykuł ten ma na celu ułatwienie ustandaryzowanej oceny interakcji między komórkami macierzystymi a rusztowaniem oraz poprawę porównywalności przedklinicznych badań nad regeneracją.
Wprowadzenie
Endodoncja regeneracyjna stanowi zmianę paradygmatu w stomatologii, koncentrując się na przywróceniu żywotności miazgi zęba poprzez zastosowanie komórek macierzystych, czynników wzrostu i rusztowań1,2. Zachowanie żywotności miazgi jest niezbędne dla funkcji sensorycznych i odpowiedzi immunologicznej, a jest szczególnie istotne w leczeniu zębów niedojrzałych z martwicą miazgi, aby umożliwić dalszy rozwój korzenia2.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z miazgi zęba (DPSCs) oraz komórki macierzyste z brodawki szczytowej (SCAPs) są głównymi kandydatami do tych procedur ze względu na ich wysoki potencjał proliferacyjny, zdolność do samoodnawiania, właściwości immunosupresyjne oraz zdolność do różnicowania się w komórki przypominające odontoblasty w odpowiednich warunkach mikrośrodowiskowych, co czyni je wysoce perspektywicznymi kandydatami do przyszłych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i interwencjach terapeutycznych opartych na komórkach3,4,5.
Podczas gdy badano konwencjonalnie formulowane materiały, takie jak cementy na bazie krzemianu wapnia, pojawiające się dowody sugerują, że modyfikacja nanocząsteczkowa może istotnie wpływać na oddziaływania między biomateriałem a komórkami6. Biomateriały nanostrukturalne mogą zapewniać bardziej biomimetyczne mikrośrodowisko, potencjalnie zwiększając adhezję komórek macierzystych i różnicowanie specyficzne dla danej linii7. Jednakże zachowanie biologiczne nowych materiałów, takich jak NeoMTA2 w formie nanocząsteczkowej, pozostaje niewystarczająco poznane w porównaniu z materiałami uznanymi, takimi jak nanohydroksyapatyt8. Niniejszy protokół odpowiada na potrzebę stworzenia zestandaryzowanych ram metodologicznych w celu dokładnej i powtarzalnej oceny tych oddziaływań.
Niniejsze zestandaryzowane ramy badawcze są szczególnie odpowiednie do badań oceniających nowe biomateriały lub rusztowania nanomateriałowe w identycznych warunkach biologicznych, gdzie kluczowa jest porównywalność między badaniami. Oferują one przewagę nad podejściami opartymi na pojedynczych analizach poprzez integrację badania żywotności (MTT), wczesnego różnicowania osteogenicznego (aktywność ALP) oraz różnicowania na poziomie białka (wynik H immunofluorescencji) w ramach jednego schematu postępowania. Badacze stosujący konwencjonalne barwienie aliceryną czerwoną lub analizy w jednym punkcie czasowym mogą odnieść korzyść z przyjęcia tych wieloparametrycznych ram w celu zmniejszenia błędu obserwatora i poprawy rozdzielczości ilościowej. Protokół ten nie jest jednak przeznaczony do trójwymiarowych kultur organoidów, systemów kokultur ani modeli komórek macierzystych pochodzenia zwierzęcego bez odpowiedniej adaptacji. Badacze wymagający profilowania ekspresji genów (np. RT-qPCR dla RUNX2, OCN lub DSPP) powinni uzupełnić ten schemat analizami molekularnymi, ponieważ obecny protokół koncentruje się wyłącznie na punktach końcowych białkowych i enzymatycznych.
Aby kompleksowo uchwycić zdolność do dwufunkcyjnego różnicowania komórek macierzystych zębów, w niniejszym protokole zastosowano dwa komplementarne markery immunofluorescencyjne, które odzwierciedlają odrębne punkty końcowe biologicznie. RANKL (ligand receptora aktywatora jądrowego czynnika kappa-B) jest wykorzystywany jako marker zaangażowania w linię osteogenną: jego ekspresja w komórkach podobnych do osteoblastów odzwierciedla sygnały mineralizacji napędzane jonami wapnia oraz aktywację komórek tworzących kość, co jest zgodne z jego zastosowaniem w kilku badaniach oceniających SCAPs4,8,9. Równolegle stosuje się DMP-1 (białko macierzy dentynowej-1) jako specyficzny marker różnicowania odontogennego/dentinogennego: jego nadekspresja w komórkach podobnych do odontoblastów odzwierciedla indukcję tworzenia macierzy dentynowej i specyficzną dla miazgi naprawę twardych tkanek, co jest szczególnie istotne, gdy docelową populacją komórek są DPSCs10. Poprzez ilościowe oznaczenie zarówno RANKL, jak i DMP-1 w ramach tego samego schematu eksperymentalnego z wykorzystaniem metodologii H-score, protokół ten umożliwia badaczom odróżnienie zaangażowania osteogennego od odontogennego; dwóch nakładających się, lecz mechanistycznie różnych wyników oddziaływań między komórkami macierzystymi a rusztowaniem, bez konieczności stosowania oddzielnych planów eksperymentalnych.
Protokół
Protokół ten został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Wydziału Stomatologii Uniwersytetu Ain Shams pod numerem zatwierdzenia FDASU-Rec IM112105. Wszystkie procedury z udziałem tkanek ludzkich były wykonywane zgodnie z Deklaracją Helsińską. Przed ekstrakcją zębów i pobraniem komórek macierzystych od wszystkich uczestników uzyskano pisemne świadome zgody.
1. Przygotowanie i charakterystyka nanomateriałów
- Zsyntetyzować nanomateriały zgodnie z określonymi wymaganiami10,11. W przypadku Nano-NeoMTA2, zmielić proszek w planetarnej młynce kulowej (patrz Tabela materiałów) przez 10 h przy 350 rpm z 3-minutowymi odstępami włącz/wyłącz. Zastosować stosunek masy kulek do proszku 10:1, używając kul z cyrkonu (średnica 5 mm) w cyrkonowym naczyniu mielącym. Przed kontynuacją zweryfikować końcowy rozmiar cząstek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) (cel: <200 nm).
OSTROŻNIE: Proszek NeoMTA2 może powodować podrażnienie dróg oddechowych w przypadku wdychania. Wszystkie etapy mielenia na sucho należy przeprowadzać w certyfikowanym wyciągu laboratoryjnym, używając respiratora N95, okularów ochronnych i rękawic nitrylowych. - Przygotować nanohydroksyapatyt metodą mokrego wytrącania chemicznego8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Przygotować 1 L 0,5 M roztworu azotanu wapnia oraz 0,6 L 0,3 M roztworu fosforanu amonu, oba w wodziey dejonizowanej. Dodawać roztwór azotanu wapnia do roztworu fosforanu amonu z prędkością około 2–3 mL/min przy ciągłym mieszaniu przy 400 rpm i ogrzewać do 70 °C, utrzymując pH 10–12 poprzez kroplowe dodawanie wodorotlenku amonu8.
OSTROŻNIE: Wodorotlenek amonu jest żrący i wydziela toksyczne opary amoniaku. Operować wyłącznie w chemizacyjnym wyciągu laboratoryjnym. Stosować rękawice odporne na kwasy, okulary ochronne przeciwrozbryzgowe i fartuch laboratoryjny. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast płukać wodą przez ≥15 min. - Poddać otrzymany osad apatytu obróbce hydrotermalnej w autoklawie w temperaturze 140 °C i pod ciśnieniem 0,3 MPa przez 2–3 h10. Poddać oczyszczony osad liofilizacji w temperaturze -50 °C w próżni ≤0,05 mbar przez 48 h8.
- Przygotować nanocząsteczki bioaktywnego szkła 45S5 metodą sol-żel w następujący sposób:
- Przygotować roztwór prekursorowy, mieszając 40 mL ortokrzemianu tetraetylu (TEOS) z 10 mL 2 M kwasu azotowego (HNO₃) jako katalizatora kwasowego w zlewce z polipropylenu przy ciągłym mieszaniu przy 300 rpm w temperaturze pokojowej.
- Po 30 min dodać tetrahydrat azotanu wapnia (Ca(NO₃)₂·4H₂O) oraz azotan sodu (NaNO₃), aby uzyskać docelowy skład molowy: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O i 6 mol% P₂O₅. Jako prekursor fosforu dodać fosforan trietylowy (TEP).
- Mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 h. Dojrzewać żel w temperaturze 60 °C przez 24 h w szczelnym pojemniku. Suszyć w temperaturze 120 °C przez 24 h. Kalcynować w piecu muflowym w temperaturze 650 °C przez 3 h (szybkość wzrostu temperatury: 2 °C/min). Zmielić i potwierdzić skład fazowy za pomocą TEM oraz dyfrakcji rentgenowskiej (XRD)4,9.
OSTROŻNIE: TEOS i etanol są łatwopalne. HNO₃ jest żrący. Wszystkie procedury należy przeprowadzać w wyciągu laboratoryjnym, z dala od źródeł zapłonu.
- Przeprowadzić charakterystykę wszystkich przygotowanych nanocząsteczek za pomocą wysokorozdzielczego TEM i XRD, aby potwierdzić rozmiar cząstek i krystaliczność8. Wyznaczyć średnią wielkość cząstek, indeks polidyspersyjności (PDI) oraz potencjał zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), aby potwierdzić stabilność koloidalną. Przyjąć partie z średnim rozmiarem cząstek <200 nm i potencjałem zeta <−15 mV lub >+15 mV.
2. Pozyskiwanie i hodowla komórek macierzystych
- Pozyskaj DPSCs lub SCAPs z niedawno wyekstrahowanych, zatrzymanych trzecich trzonowców żuchwy po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody10. Przetwarzaj wyekstrahowane zęby w ciągu 2 h od ekstrakcji i transportuj w sterylnym roztworze soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Kryteria kwalifikacji dawców obejmują zdrowych systemicznie dorosłych w wieku 18–35 lat, niepalących, bez historii stosowania antybiotyków w ciągu ostatnich 3 miesięcy, bez chorób periodontalnych i bez radiologicznych dowodów patologii okołowierzchołkowej. - Izoluj komórki metodą trawienia enzymatycznego9. Posiekaj tkankę zęba na kawałki o wielkości 1–2 mm i traw roztworem kolagenazy typu I o stężeniu 3 mg/mL w beztłuszczowym medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) przez 1 h w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu z prędkością 60 rpm na platformie kołyszącej8. Zneutralizuj pełnym ośrodkiem hodowlanym i przefiltruj przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm.
OSTRZEŻENIE: Kolagenaza typu I może zawierać endotoksyny. Używaj wyłącznie kolagenazy przeznaczonej do hodowli tkankowych, przebadanej pod kątem zawartości endotoksyn. Stosuj rękawice i unikaj wdychania. - Zasiać zawiesinę pojedynczych komórek w kolbach o powierzchni 75 cm2 przy początkowej gęstości 1 × 104 cells/cm2 w pełnym ośrodku hodowlanym składającym się z DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny (Tabela Materiałów)8.
- Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂8. Codziennie monitoruj wzrost i zanieczyszczenia za pomocą odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego10. Wymieniaj ośrodek hodowlany co 48–72 h. Usuń każdą kolbę wykazującą oznaki kontaminacji (zmętnienie, zmiana koloru, nieregularna morfologia komórek).
- Zbierz komórki po trzecim pasażu, gdy osiągną około 70–80% konfluencji8. W celu pasażowania odessaj medium, wypłucz PBS i odklej komórki, używając 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3–5 min. Zneutralizuj pełnym ośrodkiem hodowlanym, wiruj przy 300 x g przez 5 min i zasiaj ponownie w gęstości 1 × 104 cells/cm2. Aby zachować stabilność fenotypową, używaj wyłącznie komórek między 3. a 6. pasażem.
3. Charakterystyka komórek macierzystych
- Oceń immunofenotyp wyizolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej8,10. Scharakteryzuj komórki w trzecim pasażu. Uwzględnij niebarwioną kontrolę negatywną oraz kontrole kompensacyjne barwione pojedynczymi fluorochromami dla każdego użytego barwnika.
- Dostosuj liczbę komórek do 106/mL w PBS. Odwiruj przy 800 x g przez 10 min i przemyj osad dwukrotnie PBS8,10.
- Zbarw komórki przeciwciałami anty-ludzkimi przeciwko markerom mezenchymalnym (CD44, CD73) i markerom hematopoetycznym (CD45) w rozcieńczeniach zalecanych przez producenta (zazwyczaj 1:100 w PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (Tabela materiałów))8,10. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 45 min w ciemności. Przemyj dwukrotnie PBS i resuspenduj w 300 µL PBS do analizy.
- Przeanalizuj komórki za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (Tabela materiałów), aby ocenić immunofenotyp (ekspresję CD44 i CD73, z CD45 jako markerem wykluczającym linię hematopoetyczną). Zastosuj sekwencyjne bramkowanie: (a) bramkowanie według rozproszenia (FSC-A vs. SSC-A); (b) wykluczenie dubletów (FSC-H vs. FSC-A); (c) bramki specyficzne dla fluorochromów ustawione względem kontroli niebarwionych. Podaj procent komórek pozytywnych dla każdego markera wraz ze strategią bramkowania.
4. Wyznaczanie bezpiecznego stężenia materiału (półmaksymalne stężenie efektywne, EC₅₀)
- Wyznacz EC₅₀ za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej (GraphPad Prism 9). Dopasuj dane zależności dawka-odpowiedź do nieliniowej krzywej regresji sigmoidalnej (czteroparametryczny model logistyczny: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). Podaj wartość EC₅₀ w µg/mL wraz z 95% przedziałem ufności8.
- Przygotuj rozcieńczenia szeregowe nanomateriałów (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 i 1,56 µg/mL) w 1 mL PBS. Wymieszaj zawiesinę wzorcową w vortexie przez 30 s, a następnie poddaj sonikacji (sonikator sondowy, 40 W, cykle 30 s włączony/10 s wyłączony przez 3 cykle w 4 °C), aby zapewnić homogeniczną zawiesinę. Sterylizuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza pod światłem UV przez 30 min.
- hoduj komórki macierzyste w zagęszczeniu 1 × 104 komórek/studzienkę w płytkach 96-dołkowych przez 72 h z zastosowaniem różnych stężeń i policz żywe komórki przy użyciu błękitu Trypanu, aby obliczyć EC₅₀ z wykorzystaniem czteroparametrycznego modelu logistycznego opisanego w kroku 4.1.
- Przeprowadź doświadczenia w trzech powtórzeniach (n = 3 niezależne studzienki na stężenie) z co najmniej trzema powtórzeniami biologicznymi. Podaj wartości EC₅₀ jako średnia ± SD i oblicz współczynnik zmienności (CV%) dla powtórzeń (akceptowalne CV <15%).
5. Ocena różnicowania osteogenicznego i odontogenicznego
UWAGA: W tej sekcji ocenia się dwie komplementarne ścieżki różnicowania, wykorzystując równoległe testy immunofluorescencyjne z tego samego preparatu komórkowego. RANKL (krok 5.5) służy jako marker osteogenny, natomiast DMP-1 (krok 5.6) jako marker odontogenny. Oba są ilościowo określane przy użyciu tej samej metodologii H-score (krok 5.8). Oba testy należy przeprowadzić na oddzielnych szkiełkach podstawowych przygotowanych jednocześnie.
- Wysiać komórki macierzyste w płytkach 6-dołkowych z gęstością 4,5 × 105 komórek/dołek. Przed rozpoczęciem różnicowania należy pozostawić komórki na 24 h w pełnej pożywce hodowlanej w celu ich adhezji.
- Przydziel próbki do czterech grup: kontrolnej negatywnej (sam DMEM), kontrolnej pozytywnej (pożywka do różnicowania osteogenicznego/odontogennego) oraz grup doświadczalnych (nanomateriały w EC₅₀-pochodne bezpieczne stężenia).
- Przygotować pożywkę do różnicowania osteogennego, uzupełniając DMEM o 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 10 mM β-glicerofosforan, 50 µg/mL kwas askorbinowy (L-askorbinian-2-fosforan) oraz 100 nM deksametazonu. Wymieniać pożywkę co 48 h. Inkubować przez 72 h w temperaturze 37 °C oraz 5% CO2₂.
- Pomiar aktywności ALP
- Wysiać komórki w 24-dołkowych płytkach hodowlanych w zagęszczeniu 1 × 104 komórek/dołek i inkubować w 37 °C w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% CO2₂ przez 72 h.
- Odssać pożywkę hodowlaną, przepłukać studzienki buforem PBS, a następnie poddać komórki lizie poprzez dodanie 200 µL buforu do lizy na dołek (0,1% Triton X-100 w PBS) i inkubowaniu w 4 °C przez 10 min przy delikatnym kołysaniu.
- Zebrać lizat i odwirować z prędkością 500 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C; użyj nadsączu do wszystkich dalszych pomiarów ALP. Przenieś 50 µL każdej próbki badawczej i 100 µL standardów p-nitrofenolu do płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami. Dodać bufor substratowy AMP (Tabela materiałów) w celu zainicjowania reakcji katalitycznej.
- Po ponownej inkubacji przez 30 min w 37 °C, zatrzymaj reakcję poprzez dodanie 50 µL 0,5 M NaOH na każdą studzienkę. Odczytać absorbancję natychmiast przy 405 nm za pomocą mikroplateowego czytnika absorbancji (Tabela materiałów).
- Należy wyznaczyć krzywą wzorcową absorbancji w funkcji stężenia p-nitrofenolu i obliczyć aktywność ALP w U/L.
- Oznacz całkowistą zawartość białka w tym samym lizacie komórkowym, wykorzystując metodę Bradforda lub test BCA. Znormalizuj aktywność ALP do całkowistej zawartości białka i przedstaw końcowe wyniki w jednostkach U/mg białka.
- Marker osteogenny (RANKL)
- Oceń ekspresję białka RANKL przy użyciu immunofluorescencji. Najpierw przygotuj kontrole izotypowe oraz kontrole z samym przeciwciałem wtórnym: (a) zastąp przeciwciało pierwszorzędowe dopasowanym izotypowo IgG królika w tym samym stężeniu oraz (b) w osobnych dołkach całkowicie pomiń przeciwciało pierwszorzędowe.
- Utrwalić komórki w świeżo przygotowanej 4% formaldehydzie w PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej. Przemyć trzy razy PBS (po 5 min każdego płukania).
- Przeprowadzić permeabilizację przy użyciu 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 min, a następnie zablokować wiązania niespecyficzne, stosując 5% normowane surowicę kozią w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej. Bez przemywania dodać bezpośrednio przeciwciało pierwszorzędowe Rabbit Anti-RANKL w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokującym (Tabela materiałów) i inkubować przez noc w 4 °C.
- Przemyć trzy razy buforem PBS, a następnie inkubować z kozim przeciwciałem wtórnym anty-króliczym IgG sprzężonym z fluorophorem w rozcieńczeniu 1:500 w buforze blokującym (Tabela materiałów) przez 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności8Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym należy trzykrotnie przemyć preparat buforem PBS (po 5 min za każdym razem), a następnie przejść bezpośrednio do kroku 5.7 w celu zamontowania preparatu.
UWAGA: Formaldehyd (roztwór 4%) jest toksycznym utrwalaczem i prawdopodobnym kancerogenem. Należy go przygotowywać i stosować wyłącznie w certyfikowanej dygestorium chemicznym. Należy używać rękawic nitrylowych, okularów ochronnych oraz fartucha laboratoryjnego. Odpady należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
UWAGA. Tożsamość komórek jest zamiast tego potwierdzana za pomocą mikroskopii kontrastowej oraz kryteriów morfologicznych przed oceną immunofluorescencyjną (patrz krok 5.10).
- Marker odontogenny (DMP-1)
UWAGA: Równolegle z krokiem 5.5 należy ocenić ekspresję białka DMP-1 (białka macierzy dentynowej 1) za pomocą immunofluorescencji w celu oceny różnicowania w kierunku odontogenicznym.- Używając oddzielnego zestawu szkiełek podstawowych z tej samej preparacji komórek, powtórzyć wszystkie etapy fiksacji, permeabilizacji i blokowania opisane w kroku 5.5, w tym kontrole izotypowe oraz kontrole z samym przeciwciałem wtórnym.
- Bez płukania po blokowaniu, bezpośrednio dodaj przeciwciało pierwotne anty-DMP-1 (patrz Tabela materiałów) w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °CPrzemyć trzy razy buforem PBS, a następnie inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorophorem (należy użyć fluorochromu o innym widmie niż ten użyty dla RANKL; patrz Tabela materiałów) w rozcieńczeniu 1:500 w buforze blokującym przez 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Należy wykonać obrazy fluorescencyjne przy 10-krotnym powiększeniu, aby ocenić ekspresję DMP-1 jako wskaźnika różnicowania w kierunku komórek przypominających odontoblasty.10Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi trzykrotnie przemyj preparat buforem PBS (po 5 min każde płukanie), a następnie przejdź bezpośrednio do kroku 5.7 w celu zamontowania preparatu.
- Zamontuj preparaty na szkiełkach przy użyciu medium montażowego z dodatkiem środka zapobiegającego zanikaniu fluorescencji (patrz Tabela materiałów) i pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Preparaty barwione RANKL i DMP-1 zamontować osobno i wyraźnie opisać (np. "Grupa RANKL 1" i "Grupa 1 DMP-1") przed obrazowaniem.
- Preparaty należy zbadać niezwłocznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub przechowywać w 4 °C chronić przed światłem. Ilościowo określić ekspresję białka poprzez ocenę intensywności barwienia z zastosowaniem ustandaryzowanego czterostopniowego systemu punktacji: 0 (brak barwienia), 1+ (słabe), 2+ (umiarkowane) i 3+ (silne).
- Należy pozyskać obrazy, stosując identyczne ustawienia mikroskopu (czas ekspozycji, moc lasera i wzmocnienie) dla wszystkich grup eksperymentalnych. Dla każdego markera (RANKL i DMP-1) należy niezależnie zastosować identyczne ustawienia, aby zapewnić spójność wewnątrzmarkera pomiędzy grupami.
- Oceń minimum pięć losowo wybranych pól widzenia przy dużym powiększeniu (obiektyw x20) w każdej studni. Ocenę powinni przeprowadzić dwaj niezależni, oślepieni obserwatorzy, a następnie należy podać współczynnik kappa Cohena (akceptowalna wartość kappa ≥ 0,7).
- Oblicz wskaźnik H-score, korzystając ze wzoru: H-score = Σ(i × Pi), gdzie i = intensywność barwienia (1, 2 lub 3) oraz Pi = procent komórek (0–100%) na każdym poziomie intensywności.
UWAGA: Wskaźnik H-score przyjmuje wartości od 0 do 30010. - Znormalizuj dane H-score do całkowitej liczby komórek w polu widzenia, określonej poprzez ręczne przeliczenie wszystkich widocznych komórek w każdym polu pod mikroskopem kontrastowym w fazie przed obrazowaniem immunofluorescencyjnym, aby uwzględnić różnice w gęstości komórek pomiędzy dołkami.
- Oblicz i zaraportuj osobno wyniki H-score dla RANKL (punkt końcowy osteogeniczny) oraz DMP-1 (punkt końcowy odontogeniczny), aby umożliwić bezpośrednie porównanie obu szlaków różnicowania.
6. Ocena proliferacji i żywotności
- Wykonać zliczanie komórek przy użyciu hemocytometru i barwienia błękitem trypanu w celu odróżnienia komórek żywych od nieżyjących. Obliczyć całkowitą liczbę żywych komórek na mL hodowli. Dla zapewnienia wiarygodności statystycznej należy zliczyć co najmniej 100 komórek na próbkę.
- Przeprowadzić test MTT w celu pomiaru aktywności metabolicznej mitochondriów8,10.
- Do komórek dodać roztwór MTT w końcowym stężeniu 0,5 mg/mL (Tabela materiałów) i inkubować przez 4 h w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór, dodać czynnik solubilizujący (np. SDS-HCl; patrz Tabela materiałów) i zmierzyć gęstość optyczną przy 570 nm za pomocą spektrofotometru (długość fali referencyjnej: 630–650 nm).
- Obliczyć żywotność komórek według wzoru: Żywotność (%) = (Absorbancja komórek traktowanych / Absorbancja nie traktowanych komórek kontrolnych) × 100. Wartości >100% wskazują na stymulację proliferacji w stosunku do kontroli negatywnej. Należy uwzględnić dołek kontrolny (blank) w celu korekcji tła.
- Znormalizować wyniki do liczby komórek, korzystając z równoległego zliczania błękitem trypanu. Wszystkie testy należy wykonać w trzech powtórzeniach (n = 3 dołki/grupa, ≥3 powtórzenia biologiczne).
UWAGA: Bufor solubilizujący SDS-HCl jest żrący. Należy posługiwać się odpowiednimi środkami ochrony indywidualnej. Odpady zawierające formazan należy utylizować zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi.
Wyniki
Wszystkie zaprezentowane tutaj wyniki zostały opracowane na podstawie badań towarzyszących4,8,9,10 przeprowadzonych przez tę samą grupę badawczą na podstawie jednolitej instytucjonalnej zgody komisji etycznej (FDASU-Rec IM112105).
Charakterystyka nanomateriałów i izolacja komórek macierzystych
Zestandaryzowany schemat postępowania pozwala w pierwszej kolejności na ilościowe potwierdzenie właściwości rusztowań oraz fenotypów komórek macierzystych. Po syntezie przygotowane nanomateriały są walidowane przy użyciu wysokorozdzielczego TEM i XRD w celu potwierdzenia wielkości cząsteczek i krystaliczności (Rycina 1A,B). Równocześnie DPSCs lub SCAPs izolowane poprzez trawienie enzymatyczne wykazują silną adhezję i proliferację w pełnej pożywce hodowlanej. Analiza cytometryczna przepływowa waliduje immunofenotyp zebranych komórek w trzecim pasażu, wykazując wysoką ekspresję markerów mezenchymalnych (CD44, CD43) i potwierdzając ich niehematopoetyczne pochodzenie poprzez brak CD45 (Rycina 1C).
Ustalenie bezpiecznego stężenia materiału i proliferacji
Poprzez hodowlę komórek macierzystych w szeregowych rozcieńczeniach nanomateriałów (50–1.56 µg/mL) przez 72 h; czteroparametrowa regresja logistyczna liczby żywych komórek pozwala na uzyskanie wiarygodnej wartości EC₅₀ (nieliniowy sigmoidalny model zależności odpowiedzi od dawki, opisany w kroku 4.1). Wartości żywotności w teście MTT przekraczające 100% wskazują na stymulację proliferacji w stosunku do kontroli nieleczonej, ponieważ wartości są normalizowane względem grupy kontrolnej negatywnej (komórki nieleczone przyjęto za 100%). Wartość wynosząca np. ~196% dla Nano-NeoMTA2 odzwierciedla bioaktywną stymulację aktywności mitochondrialnej, a nie >100% bezwzględna przeżywalność komórek9.
W kilku badaniach z zastosowaniem tego zstandaryzowanego protokołu, przy użyciu czteroparametrowego modelu logistycznego (krok 4.1), ustalono wartości EC₅₀ wynoszące 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 oraz 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10, co potwierdza bezpieczne stężenia robocze do wykorzystania w testach różnicowania opisanych w niniejszym protokole. Wartości te zostały uwzględnione w Tabeli 1 jako reprezentatywne wskaźniki walidacji.
Ilościowe określenie różnicowania osteogennego i odontogennego (ocena z wykorzystaniem podwójnego markera)
Podejście oparte na podwójnej immunofluorescencji pozwala na uzyskanie dwóch odrębnych, komplementarnych miar wyników z tej samej preparacji komórkowej. W ocenie osteogennej wyniki H-score dla RANKL pozwoliły na statystycznie istotne rozróżnienie wszystkich czterech grup: komórki hodowane z Nano-NeoMTA2 wykazały znacznie wyższą ekspresję RANKL niż kontrola negatywna, co jest zgodne ze zwiększoną aktywacją komórek podobnych do osteoblastów (Rysunek 2A, Tabela 1)8,9. W ocenie odontogennej wyniki H-score dla DMP-1 ujawniły silne różnicowanie komórek DPSCs hodowanych z Nano-NeoMTA2 w kierunku komórek podobnych do odontoblastów, przy czym wyniki H-score były istotnie wyższe niż w grupach nanohydroksyapatytu i kontroli negatywnej, co potwierdza preferencyjne zaangażowanie w dentinogenezę (Rysunek 3A, Tabela 1)10. Tożsamość komórek została potwierdzona za pomocą mikroskopii kontrastowej oraz charakterystycznych kryteriów morfologicznych (morfologia wrzecionowata lub wieloboczna) przed dokonaniem oceny.
Aktywność ALP została odróżniona spektrofotometrycznie we wszystkich grupach przy 405 nm, służąc jako wczesny marker enzymatyczny zarówno dla różnicowania osteogennego, jak i odontogennego (Tabela 1). Spektrofotometryczna analiza MTT potwierdziła, że wszystkie nanomateriały w bezpiecznych stężeniach wyznaczonych na podstawie EC₅₀ utrzymywały wysoką żywotność komórek w stosunku do kontroli negatywnej, co jest zgodne z przedstawionymi wartościami reprezentatywnymi (Tabela 1).
Nieoptymalne i nieudane wyniki eksperymentalne
Nieoptymalne wyniki podsumowano w Tabeli 2. Niska żywotność komórek w teście MTT zazwyczaj wskazuje na to, że stężenie nanomateriału przekracza próg EC₅₀ lub że sterylizacja UV była niewystarczająca. Niespójna absorbancja ALP (CV > 20%) zazwyczaj wskazuje na nierównomierne zagęszczenie wysiewu lub niepełną homogenizację buforu lizującego. Słaby lub brak sygnału immunofluorescencji dla RANKL lub DMP-1 najczęściej wynika z inaktywacji przeciwciał, niewystarczającej permeabilizacji lub nadmiernej fiksacji; rozwiązaniem w tym przypadku jest zastosowanie świeżego 4% formaldehydu oraz jednorazowych aliquotów przeciwciał. Reaktywność krzyżową między kanałami RANKL a DMP-1 należy wykluczyć poprzez analizę obrazów kontrolnych z samym przeciwciałem wtórnym przed dokonaniem oceny.
Rycina 1Standaryzowana charakterystyka nanomateriałów i walidacja fenotypu komórek macierzystych. (A) widma XRD potwierdzające fazę krystaliczną i integralność strukturalną nanocząsteczek. (B) Reprezentatywne obrazy TEM wykazujące nanometrową wielkość cząstek, morfologię oraz jednorodną dyspersję zsyntezowanych biomateriałów; porównanie NeoMTA2 i hydroksyapatytu. Widoki przy małym powiększeniu przedstawiono dla (a) NeoMTA2 i (b) hydroksyapatytu, natomiast widoki przy dużym powiększeniu szczegółowo zobrazowano w (c) NeoMTA2 i (d) hydroksyapatycie. Skale znajdują się w lewym dolnym rogu. (C) Protokół bramkowania w cytometrii przepływowej dla charakterystyki komórek macierzystych. Reprezentatywne wieloparametryczne wykresy kropkowe przedstawiają komórki barwione pod kątem CD44, CD73 (oznaczone jako CD43 PE na oryginalnych wykresach) oraz CD45. Subpopulacje CD44+ i CD73+ zostały obramowane w odniesieniu do ekspresji CD45. Panele A i C zostały zaadaptowane z pracy Zaki i wsp.8 (CC BY-NC-SA) oraz Panel B zaadaptowano z Habib et al.10 (CC BY-NC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2Ilościowa i półilościowa ocena różnicowania osteogenicznego za pomocą immunofluorescencji RANKL. (A) Reprezentatywne mikrografie immunofluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości przedstawiające ekspresję kluczowych osteogennych markerów białkowych RANKL w mikrośrodowisku rusztowania 2D (a) komórki kontrolne negatywne tworzą małe kolonie ze słabą, błonową ekspresją RANKL, podczas gdy (b) komórki kontrolne pozytywne wykazują zwiększoną liczbę kolonii przypominających osteoblasty z gęstą, homogeniczną ekspresją. Komórki macierzyste traktowane (c) NHAP, (d) NHAP/chitozanem oraz (e) nanocząsteczkami bioaktywnego szkła wykazują zaawansowane różnicowanie, charakteryzujące się dużymi, zlanymi koloniami przypominającymi osteoblasty z intensywną, homogeniczną lokalizacją RANKL zarówno w błonie, jak i w jądrze; zaadaptowano z: Elshahat et al.4. (B) Wykresy słupkowe przedstawiające ilościowe oznaczenie wskaźnika H-score dla ekspresji RANKL w różnych badaniach. Zastosowanie metodyki H-score w celu normalizacji danych immunofluorescencyjnych. Poprzez matematyczną integrację wizualnej intensywności barwienia (ocenianej w skali 0–3) z odsetkiem komórek wykazujących barwienie pozytywne, wskaźnik H-score przekształca jakościową analizę mikroskopową w solidną metrykę półilościową, znacząco redukując subiektywny błąd obserwatora. (a) Porównanie Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) oraz nanocząsteczek bioaktywnego szkła (NBG; 500 µg/mL) w odniesieniu do pozytywnej kontroli z medium osteogennym (OM-PC) oraz negatywnej kontroli DMEM (DMEM-NC). NBG wywołało najwyższy profil ekspresji (p < 0,001). Adaptacja na podstawie pracy Abdelaziz i wsp. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Ocena nanohydroksyapatytu (NHAP; 10µg/mL), kompozyt NHAP/chitozan (10 µg/mL), oraz NBG (500 µg/mL) w stosunku do kontroli, przy czym NHAP/chitozan wykazał najwyższe wartości H-score. Adaptowano z Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Ocena Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) w porównaniu z NHAP (10 µg/mL) oraz kontroli, wykazując znacznie podwyższoną ekspresję RANKL w Nano-NeoMT, zaadaptowano z: Zaki i in.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy immunofluorescence oraz analiza H-score. (A) Ocena ekspresji białka macierzy dentynowej (DMP-1) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w grupach eksperymentalnych; zielona fluorescencja wskazuje na pozytywne barwienie przeciwciałami poliklonalnymi anty-DMP-1. (a) Kontrola negatywna: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste miazgi zęba (hDPSCs) w medium nieindukującym (UM) wykazują niewielkie agregaty komórkowe ze słabą, jednorodną ekspresją DMP-1 (+). (b) Kontrola pozytywna: hDPSCs w medium odontogenicznym (OM) wykazują ekspansję kolonii charakteryzującą się gęstymi, jednorodnymi sygnałami DMP-1 (++). (c) Nanohydroksyapatyt (10 μg/mL) oraz (d) Nano-NeoMTA2 (9,92 μg/mL): Zróżnicowane hDPSCs tworzą duże, zlane kolonie komórek podobnych do odontoblastów, wykazujących silną, jednorodną ekspresję DMP-1 zlokalizowaną w błonach i jądrach. Powiększenie: ×10. Żółte okręgi wskazują kolonie podobne do odontoblastów; żółte strzałki oznaczają intensywną ekspresję DMP-1. (B) Wykres słupkowy przedstawiający ilościowe oznaczenie H-score ekspresji białka macierzy dentynowej w grupach badawczych. Zaobserwowano wysoce istotną różnicę między grupami oceny, przy czym najwyższy H-score odnotowano w kohorcie Nano-NeoMTA2 (169,33 ± 4,04), następnie dla nanohydroksyapatytu (140,33 ± 2,52) i kontroli negatywnej (15,33 ± 1,53). Panele A i B zaadaptowano z pracy Habib i wsp.10 (CC BY-NC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Analiza / Parametr | Nanomateriał / Typ komórki | Wartość reprezentatywna (średnia ± SD) | Normalizacja | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. |
| Żywotność komórek (test MTT) | ||||
| Żywotność MTT | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1,56 ± 0,24) | Znormalizowane względem nieleczonej kontroli (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz i wsp.⁹ |
| Żywotność MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | Znormalizowano do nieleczonej kontroli (DMEM-NC = 100%) | Elshahat i wsp.⁴ |
| Żywotność w teście MTT — kontrola pozytywna | OM-PC / SCAPy | 113.46% (OD = 0,93 ± 0,03) | Znormalizowano względem nieleczonej kontroli (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz i wsp.⁹ |
| Żywotność MTT — kontrola negatywna | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0,82 ± 0,02) — Linia bazowa odniesienia | DMEM-NC zdefiniowane jako 100% referencja dla wszystkich grup | Abdelaziz i wsp.⁹ |
| Aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) | ||||
| Aktywność ALP | Bioaktywne nanocząsteczki szkła (500 µg/mL) / komórki macierzyste z tkanek okołokanałowych (SCAPs) | 69,86 ± 0,98 U/L | Znormalizowano do całkowitej zawartości białka (U/mg białka, test Bradforda/BCA) | Abdelaziz i wsp.⁹ |
| Aktywność ALP — kontrola pozytywna | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Znormalizowano do całkowitej zawartości białka (U/mg białka, metoda Bradforda/BCA) | Abdelaziz i in.⁹ |
| Aktywność ALP — kontrola negatywna | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Znormalizowano do całkowitej zawartości białka (U/mg białka, metoda Bradforda/BCA) | Abdelaziz i in.⁹ |
| Bezpieczne stężenie substancji (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | Czteroparametrowy model logistyczny (nieliniowa sigmoidalna krzywa zależności efektu od dawki, GraphPad Prism 9) | Zaki i wsp.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9.92 µg/mL | Czteroparametrowy model logistyczny (nieliniowa sigmoidalna zależność dawka–odpowiedź, GraphPad Prism 9) | Habib i wsp.10 |
| H-Score — ekspresja białka RANKL (marker osteogenny) | ||||
| H-Score (RANKL) Marker osteogenny | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia kontrastowa) | Zaki i wsp.⁸ |
| H-Score (RANKL) Marker osteogenny | nHA (10 µg/mL) / SCAP-y | 68 ± 3 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia kontrastowa) | Zaki i wsp.⁸ |
| Wskaźnik H-Score (RANKL) Kontrola pozytywna | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia fazokontrastowa) | Zaki i wsp.⁸ |
| H-Score (RANKL) Kontrola negatywna | DMEM-NC / SCAPy | 18 ± 1 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia fazokontrastowa) | Zaki i wsp.⁸ |
| Wskaźnik H-Score — ekspresja białka DMP-1 (marker odontogenny) | ||||
| H-Score (DMP-1) Marker odontogenny | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / DPSCs (perowskitowe ogniwa słoneczne) | 169.33 ± 4.04 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia kontrastowa) | Habib i wsp.10 |
| Wskaźnik H-Score (DMP-1) Marker odontogenny | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140.33 ± 2.52 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia fazokontrastowa) | Habib i wsp.10 |
| Wskaźnik H-Score (DMP-1) Kontrola negatywna | DMEM-NC / DPSCs (podstawkowa pożywka Eagle zmodyfikowana dla komórek nietworzących / komórki macierzyste z miazgi zęba) | 15.33 ± 1.53 (skala 0–300) | Całkowita liczba widocznych komórek w polu widzenia (mikroskopia kontrastowa) | Habib i wsp.10 |
| Wskaźnik H-score (DMP-1) Marker odontogenny [Kontrola pozytywna -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 wskaźnik H-score (skala 0–300) | Całkowita liczba komórek na pole widzenia (mikroskopia kontrastowa) | Habib i wsp. Eur Endod J, 202610 |
| H-score = Σ(i × Pi): i = intensywność barwienia (1, 2 lub 3); Pi = procent komórek na każdym poziomie intensywności (0–100%); zakres 0–300. Żywotność w teście MTT wyrażona względem zestawu DMEM-NC przyjętego jako referencyjne 100%. Aktywność ALP wyrażona w U/L na podstawie enzymatycznej defosforylacji p-nitrofenylofosforanu; następnie znormalizowana do całkowitej zawartości białka (U/mg białka). OM-PC = ośrodki indukujące osteogenny/odontogenny (kontrola pozytywna). DMEM-NC = podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco (kontrola negatywna). | ||||
Tabela 1: Reprezentatywne wyniki ze zestandaryzowanego schematu oceny in vitro.Reprezentatywne wyniki ilościowe z wcześniej opublikowanych badań wykazujące analizy proliferacji komórek, aktywności fosfatazy alkalicznej oraz immunofluorescencji, przeprowadzone zgodnie ze zestandaryzowanym protokołem.
| Obserwowany problem | Potencjalna przyczyna | Zalecane rozwiązanie |
| Niska żywotność komórek w teście MTT (OD < kontrola nieleczona) | Stężenie nanomateriału przekracza EC₅₀, niewystarczająca sterylizacja UV lub nieodpowiednia dyspersja nanocząsteczek. | Powtórzyć oznaczenie EC₅₀ (rozdział 4). Wydłużyć sterylizację UV do 30 min. Zweryfikować homogenność zawiesiny nanocząsteczek poprzez sonikację sondą (40 W, 30 s włącz/wyłącz, 3 cykle w 4 °C) bezpośrednio przed użyciem. |
| CV żywotności w teście MTT >15% pomiędzy powtórzeniami | Błąd pipetowania, nierównomierne wysiewanie komórek lub zmienny czas/temperatura inkubacji MTT. | Użyć skalibrowanej pipety wielokanałowej do wszystkich dodatków. Potwierdzić gęstość wysiewu za pomocą hemocytometru przed wysianiem na płytki. Zachować ścisłą 4 h inkubację w 37 °C w inkubatorze CO₂ z nawilżaniem. Uwzględnić dołek kontrolny (blank) do korekcji tła. |
| Niespójne odczyty absorbancji ALP (CV >20% pomiędzy dołkami) | Nierównomierna gęstość wysiewu komórek, niepełna liza komórek lub niespójność pipetowania podczas dodawania substratu. | Ściśle przestrzegać gęstości 1 × 10⁴ komórek/dołek w płytkach 24-dołkowych. Dokładnie wymieszać bufor do lizy w wortexie przed użyciem. Zachować spójną inkubację lizy (10 min, 4 °C, delikatne kołysanie). Sprawdzić absorbancję tła w dołku kontrolnym bez komórek. |
| Słaby lub nieobecny sygnał immunofluorescencji RANKL (krok 5.4a) | Inaktywacja przeciwciała wskutek niewłaściwego przechowywania, nadmierna fiksacja ograniczająca dostępność epitopu lub niewystarczająca permeabilizacja. | Przygotować świeży 4% formaldehyd bezpośrednio przed użyciem. Dodać 0,1% Triton X-100 do permeabilizacji (10 min, RT) przed blokowaniem. Przetytrować rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (zacząć od 1:200). Uwzględnić przekrój tkanki jako kontrolę pozytywną. Alikwotować zapas przeciwciała, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. |
| Słaby lub nieobecny sygnał immunofluorescencji DMP-1 (krok 5.4b) | Inaktywacja przeciwciała wskutek cykli zamrażania i rozmrażania, nieoptymalne rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego lub niekompatybilny gatunek gospodarza przeciwciała drugorzędowego. | Alikwotować przeciwciało anty-DMP-1, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Przetytrować rozcieńczenie, zaczynając od 1:200. Potwierdzić kompatybilność gatunku gospodarza pomiędzy przeciwciałem pierwszorzędowym (DMP-1) a drugorzędowym. Uwzględnić przekrój tkanki zębiny jako kontrolę pozytywną dla DMP-1. |
| Reaktywność krzyżowa pomiędzy kanałami fluorescencji RANKL i DMP-1 | Nakładanie się widm emisji w przypadku użycia tego samego fluorochromu dla obu przeciwciał drugorzędowych lub niewystarczająca separacja kanałów w mikroskopie fluorescencyjnym. | Użyć spektralnie różnych fluorochromów przeciwciał drugorzędowych dla RANKL i DMP-1 (np. Alexa Fluor 488 dla jednego markera, Alexa Fluor 594 dla drugiego). Przejrzeć obrazy kontrolne z samym przeciwciałem drugorzędowym dla każdego kanału oddzielnie przed oceną. Pozyskać obrazy RANKL i DMP-1 oddzielnie, korzystając z trybu sekwencyjnego. |
| Wysokie niespecyficzne tło w barwieniu immunofluorescencyjnym | Niewystarczające blokowanie białek, zbyt wysokie stężenie przeciwciała drugorzędowego lub nieodpowiednie etapy płukania pomiędzy inkubacjami. | Wydłużyć inkubację blokującą do 2 h w RT. Zwiększyć rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego do 1:1000. Potwierdzić specyficzność za pomocą kontroli z samym przeciwciałem drugorzędowym (bez przeciwciała pierwszorzędowego). Upewnić się, że wszystkie płukania PBS są kompletne (3 × 5 min każde). |
| Zmienność H-score między obserwatorami (kappa Cohena <0,7, krok 5.6) | Niespójne stosowanie czterostopniowej skali intensywności barwienia (0, 1+, 2+, 3+) pomiędzy obserwatorami lub niewystarczająca kalibracja przed sesjami oceny. | Przeprowadzić wspólną sesję kalibracyjną z wykorzystaniem reprezentatywnych obrazów treningowych przed formalną oceną. Użyć identycznych ustawień wyświetlania obrazu (jasność, kontrast) dla wszystkich obserwatorów. Ocenić minimum pięć pól dużego powiększenia na dołek i obliczać współczynnik kappa po każdych 10 polach, aby monitorować odchylenia. |
| Krzywa EC₅₀ nie zbiega się lub dopasowanie jest słabe (krok 4.1) | Niewystarczająca liczba punktów danych, zbyt wąski zakres stężeń lub brak uzyskania homogennej zawiesiny przed wysianiem. | Rozszerzyć zakres rozcieńczeń szeregowych, aby objął co najmniej 6 stężeń w przedziale 50–1,56 µg/mL. Upewnić się, że sonikacja sondą jest wykonywana bezpośrednio przed każdym krokiem rozcieńczania. Powtórzyć badanie w co najmniej 3 niezależnych powtórzeniach biologicznych. Potwierdzić CV <15% pomiędzy powtórzeniami. |
Tabela 2: Kluczowe parametry i przewodnik rozwiązywania problemów. Typowe problemy techniczne występujące podczas realizacji protokołu, ich potencjalne przyczyny oraz zalecane rozwiązania w celu poprawy powtarzalności eksperymentów i jakości danych. Skróty: CV = współczynnik zmienności; RT = temperatura pokojowa.
Dyskusja
Krytyczne etapy niniejszego protokołu obejmują dokładne wyznaczenie EC₅₀, przygotowanie homogenicznej zawiesiny nanomateriału oraz normalizację wyników testów biologicznych. Obliczanie EC₅₀ za pomocą regresji nieliniowej (czteroparametrowy model logistyczny) zapewnia bardziej rygorystyczną ocenę zależności dawka-odpowiedź niż interpolacja liniowa i powinno być preferowane w przypadku dostępności wystarczającej liczby punktów danych13,14. Zapewnienie homogenicznej zawiesiny nanocząsteczek poprzez sonikację sondą bezpośrednio przed ekspozycją komórek jest kluczowe; słabo zdyspergowane zawiesiny prowadzą do uzyskania niewiarygodnych krzywych dawka-odpowiedź i zniekształcają szacunki EC₅₀. W przypadku nowych materiałów, takich jak NeoMTA2, rozdrobnienie do skali nanometrycznej jest niezbędnym pierwszym krokiem, ponieważ rozmiar cząsteczek w skali makro znacząco zmienia reaktywność powierzchni i późniejszą bioaktywność13,14. Jeśli zaobserwowana zostanie niska żywotność komórek przy stężeniach uznanych za bezpieczne, badacze powinni zweryfikować protokół sterylizacji UV oraz ponownie sprawdzić procedury rozdrabniania i dyspersji przed powtórzeniem testu EC₅₀10.
Kluczowym elementem niniejszego protokołu jest zastosowanie dwóch komplementarnych markerów immunofluorescencyjnych, które odzwierciedlają odrębne, lecz nakładające się szlaki różnicowania. Podwyższenie poziomu RANKL w komórkach podobnych do osteoblastów odzwierciedla osteogenne sygnalizowanie napędzane jonami wapnia i jest proporcjonalne do liczby komórek osteogennych8,9, natomiast ekspresja DMP-1 służy jako specyficzny wskaźnik różnicowania w kierunku komórek podobnych do odontoblastów oraz aktywności dentynogennej, co jest szczególnie istotne, gdy populacją docelową są DPSCs10. Dzięki ilościowemu określeniu obu markerów przy użyciu metodologii H-score, protokół ten pozwala badaczom odróżnić zaangażowanie w linię osteogeniczną od odontogennej w ramach jednego ustandaryzowanego systemu analizy, co stanowi postęp w stosunku do podejść opartych na pojedynczym markerze, które nie pozwalają na rozróżnienie między zaangażowaniem w tworzenie kości a tworzenie dentyny. W celu zachowania porównywalności między badaniami, we wszystkich publikacjach wykorzystujących ten protokół należy podawać wartości H-score dla RANKL oraz DMP-1. Badacze powinni stosować fluorochromach o różnych widmach dla dwóch przeciwciał wtórnych, aby zapobiec nakładaniu się kanałów, oraz muszą przeanalizować obrazy kontrolne zawierające wyłącznie przeciwciała wtórne przed dokonaniem oceny.
Przy adaptacji niniejszego protokołu do alternatywnych biomateriałów lub modeli komórkowych mogą być wymagane pewne modyfikacje metodologiczne. W przypadku rusztowań o wysokim stopniu nieprzezroczystości lub intensywnym zabarwieniu, interferencja z absorbancją MTT przy 570 nm może wymagać zastosowania alternatywnego testu żywotności, takiego jak CellTiter-Glo (luminescencja) lub PrestoBlue (redukcja rezazuryny), które są mniej podatne na interferencje optyczne wywoływane przez materiały rusztowań. Badacze wykorzystujący komórki SCAPs zamiast DPSCs powinni zwrócić uwagę, że SCAPs wykazują tendencję do silniejszej ekspresji RANKL, co odzwierciedla ich większy potencjał osteogenny, podczas gdy DPSCs wykazują bardziej wyraźną ekspresję DMP-1, co odzwierciedla ich silniejsze ukierunkowanie na linię odontogenno-dentynogenną. Liczba pasażów jest zmienną krytyczną: należy unikać stosowania komórek powyżej 6. pasażu, ponieważ mogą one wykazywać obniżoną zdolność do różnicowania oraz zmienioną ekspresję markerów powierzchniowych.
Ograniczenia niniejszego schematu metodologicznego obejmują krótkie okno oceny (72 h), które może nie uchwycić późnych etapów mineralizacji, zazwyczaj wymagających 14–21 dni. Brak walidacji in vivo stanowi istotną lukę translacyjną. Zastosowanie H-score wprowadza potencjalną zmienność obserwatora; niezawodność międzyobserwatorska (kappa Cohena) opisana w sekcji 5.10 powinna być uwzględniona we wszystkich publikowanych wynikach.
Niniejszy schemat oferuje kilka zalet w stosunku do istniejących podejść opartych na pojedynczym punkcie końcowym. Konwencjonalne testy osteogenne często opierają się wyłącznie na barwieniu alizaryną czerwienią lub pomiarze aktywności ALP w pojedynczym punkcie czasowym. Integracja przesiewowego badania żywotności metodą MTT, ilościowego oznaczenia aktywności ALP oraz H-scoringu immunofluorescencji dla RANKL + DMP-1 w ramach jednego schematu pracy zapewnia wieloparametryczny wynik, który umożliwia bezpośrednie porównanie statystyczne różnych typów rusztowań w identycznych warunkach doświadczalnych. Opisane strategie normalizacji – aktywność ALP wyrażona na mg białka, wyniki MTT jako procent kontroli nieleczonej oraz H-score znormalizowany do całkowitej liczby komórek w polu – eliminują zakłócenia wynikające z zmienności między dołkami4,8.
Przyszłe badania mogą zastosować tę metodologię do oceny wpływu biomateriałów na markery zapalne, odpowiedzi angiogenne lub alternatywne modele komórek macierzystych. Sekwencja analizy jest również możliwa do dostosowania do formatów rusztowań 3D. Ostatecznie przyjęcie tych ustandaryzowanych ram w niezależnych laboratoriach ułatwi wartościowe porównania meta-analityczne wydajności rusztowań w przedklinicznych badaniach nad regeneracyjną stomatologią15.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24-dołkowe płytki hodowlane | Corning | 3527 | Stosowane do testów ALP |
| Płytki 96-dołkowe | Corning | 3596 | Stosowane do pomiarów absorbancji ALP i testów MTT |
| Zestaw do testu ALP | Abcam | ab83369 (lub odpowiednik) | Stosowany do pomiaru aktywności fosfatazy zasadowej |
| Bufor substratowy ALP (2-amino-2-metylopropan-1-ol) | Sigma-Aldrich | N/A | Stosowany do zainicjowania katalitycznej reakcji ALP |
| Wodorotlenek amonu (NH4OH) | N/A | N/A | Stosowany do regulacji pH podczas syntezy nanohydroksyapatytu. ŻRAWE |
| Przeciwciało pierwszorzędowe anty-DMP-1 | N/A | N/A | Marker odontogenny; rozcieńczenie 1:200 w buforze blokującym; inkubacja przez noc w 4 °C |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD44 (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Stosowane do cytometrii przepływowej; pozytywny marker mezenchymalnych komórek macierzystych |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD45 (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Stosowane do cytometrii przepływowej; negatywny marker linii krwiotwórczej |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD73 (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Stosowane do cytometrii przepływowej; pozytywny marker mezenchymalnych komórek macierzystych |
| Autoklaw (reaktor hydrotermalny) | Tuttnauer | N/A | Stosowany do obróbki hydrotermalnej nanohydroksyapatytu w 140 °C, 0,3 MPa |
| Zestaw do oznaczania białka BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (lub odpowiednik) | Stosowany do oznaczenia całkowitego stężenia białka w celu normalizacji aktywności ALP |
| Inkubator CO2 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Ustawiony na 37 °C i 5% CO2 dla wszystkich etapów hodowli komórkowej |
| Kolagenaza typu I | Sigma-Aldrich | C0130 | Stosowana do trawienia enzymatycznego tkanek zębowych podczas izolacji komórek macierzystych |
| DMEM (podłoże Eagle modyfikowane przez Dulbecco) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Podstawowe podłoże hodowlane; stosowane również jako grupa kontrolna negatywna |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Suplement do pełnego podłoża hodowlanego; FBS kwalifikowany dla MSC stosowany do podłoża różnicującego |
| Cytometr przepływowy (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Stosowany do immunofenotypowania komórek macierzystych |
| Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Stosowane do bramkowania i analizy danych z paneli cytometrii przepływowej |
| Mikroskop fluorescencyjny | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Stosowany do obrazowania immunofluorescencyjnego i oceny H-score |
| Liofilizator | Labconco | N/A | Stosowany do suszenia osadów nanomateriałów w −50 °C |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne; rozcieńczenie 1:500; 1 h w temperaturze pokojowej |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (lub odpowiednik) | A-11012 (lub odpowiednik) | Spektralnie odmienne przeciwciało wtórne stosowane do immunofluorescencji DMP-1 podczas barwienia multipleksowego |
| Oprogramowanie GraphPad Prism | GraphPad Software | Wersja 9 | Stosowane do obliczeń EC50 i analizy statystycznej |
| Hemocytometr | Neubauer | N/A | Stosowany do ręcznego liczenia komórek i wyznaczenia całkowitej liczby komórek do normalizacji H-score |
| Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy | Olympus | N/A | Stosowany do codziennego monitorowania wzrostu i morfologii komórek |
| Medium montażowe, przeciwblaknące (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Stosowane do montowania preparatów na szkiełkach po barwieniu immunofluorescencyjnym |
| Odczynnik MTT | Invitrogen | M6494 | Stosowany do oceny aktywności metabolicznej komórek; 0,5 mg/mL, 4 h w 37 °C |
| Nanohydroksyapatyt (NHAP) | Nanogate, Kair, Egipt | N/A | Syntetyzowany metodą wytrącania na mokro lub pozyskany komercyjnie; stosowany w stężeniu 10 µg/mL |
| Proszek NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Materiał wyjściowy do przygotowania Nano-NeoMTA2 za pomocą planetarnej młyna kulowego |
| Normalna kozia surowica | N/A | N/A | Stosowana do blokowania (5% w PBS) przed aplikacją przeciwciała pierwszorzędowego |
| Podłoże do różnicowania osteogennego/odontogennego | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Podłoże kontrolne pozytywne; zawiera DMEM, FBS, askorbinian, beta-glicerylofosforan i deksametazon |
| Paraformaldehyd (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | Stosowany do fiksacji komórek przed immunofluorescencją. TOKSYCZNY — stosować w dygestorium |
| PBS (bufor fosforanowy, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Stosowany do przemywania komórek, rozcieńczania przeciwciał i zawiesin nanomateriałów |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Suplement antybiotykowy; stosowany w stężeniu 1% w pełnym podłożu hodowlanym |
| Planetarny młyn kulowy | Retsch (lub odpowiednik) | PM 400 | Stosowany do nanostrukturyzacji proszku NeoMTA2; 350 rpm, 10 h |
| Standardy p-nitrofenolu | Sigma-Aldrich | N/A | Stosowane do wyznaczenia krzywej wzorcowej aktywności ALP |
| Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-RANKL | Abcam | ab9957 | Marker osteogenny; rozcieńczenie 1:200; inkubacja przez noc w 4 °C |
| Królicze przeciwciało kontrolne izotypu IgG | N/A | Kontrola negatywna dla immunofluorescencji; stężenie dopasowane do przeciwciała pierwszorzędowego | |
| Roztwór solubilizujący SDS-HCl | Sigma-Aldrich | N/A | Stosowany do rozpuszczania kryształów formazanu MTT. ŻRAWE |
| 6-dołkowe płytki do hodowli tkanek | Corning | 3516 | Stosowane do testów różnicowania |
| Wodorotlenek sodu (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (lub odpowiednik) | N/A | Stosowany do zatrzymania reakcji ALP przed pomiarem absorbancji; ŻRAWE |
| Sonikator (sonda / kąpiel ultradźwiękowa) | Branson Ultrasonics | N/A | Stosowany do dyspersji nanocząstek przed testami biologicznymi |
| Flaski hodowlane T-75 | Corning | 430641 | Stosowane do namnażania komórek macierzystych |
| TEOS (ortokrzemian tetraetylu) | N/A | N/A | Prekursor krzemionki do syntezy sol-gel bioaktywnego szkła 45S5. ŁAMLIWE/PALNE |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Stosowany do charakterystyki rozmiaru i morfologii nanomateriałów |
| Triton X-100 (0,1% w PBS) | N/A | N/A | Stosowany do permeabilizacji komórek przed immunofluorescencją |
| Roztwór błękitu trypanu (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | Stosowany do oceny żywotności komórek |
| Dyfraktometr rentgenowski (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Stosowany do analizy krystalograficznej nanocząstek |
Bibliografia
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.